(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2013/45 EP B1 (13) (51) T3 Int.Cl. C07K 14/71 ( ) A61K 39/00 ( ) A61K 38/18 ( ) (54) Tytuł wynalazku: Szczepionka do zapobiegania nawrotowi raka sutka (30) Pierwszeństwo: US P (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2010/11 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 2014/04 (73) Uprawniony z patentu: The Henry M. Jackson Foundation for the Advancement of Military Medicine, Inc., Bethesda, US (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 GEORGE E. PEOPLES, San Antonio, US PONNIAH SATHIBALAN, Columbia, US (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Aleksandra Twardowska KANCELARIA PATENTOWA KULIKOWSKA & KULIKOWSKI SP.J. SKR. POCZT Warszawa 12 Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 24094/PE/14 EP B1 Opis POWIĄZANIE ZE ZGŁOSZENIAMI POKREWNYMI [0001] Zgłoszenie korzysta z pierwszeństwa ze zgłoszenia nr US 60/941,524 złożonego 1 czerwca 2007 roku. DZIEDZINA WYNALAZKU [0002] Wynalazek należy ogólnie do dziedziny szczepionek profilaktycznych i leczniczych. Bardziej konkretnie, wynalazek dotyczy szczepionek peptydowych do leczenia raka sutka i zapobiegania nawrotom u pacjentów w stadium remisji raka sutka. TŁO WYNALAZKU [0003] Rak sutka (BCa) jest najczęściej diagnozowanym rakiem u kobiet i drugą z głównych przyczyn śmierci z powodu raka wśród kobiet (Res LAG i in. (wyd.), SEER Cancer Statistics Review, , National Cancer Institute, Bethesda, MD). Poważny postęp w leczeniu raka sutka w ciągu ostatnich 20 lat doprowadził do znaczącej poprawy współczynnika przeżycia bez objawów choroby (współczynnik DFS). Przykładowo, terapie wykorzystujące przeciwciała skierowane przeciwko antygenom związanym z guzem zastosowano do blokowania swoistych procesów komórkowych w celu spowolnienia postępu choroby lub zapobiegania jej nawrotom. Mimo postępów w ostatnich latach w leczeniu raka sutka, ostatecznie znacząca część pacjentek umrze w wyniku nawrotu choroby. Tak więc, istnieje zapotrzebowanie na terapie, które zapobiegałyby lub spowalniałyby bądź uniemożliwiały rozwój nawrotu choroby. [0004] Ze względu na łatwość ich podawania i wysoki odsetek terapii zakończonych sukcesem obserwowany w przypadku chorób

3 2 zakaźnych atrakcyjnym modelem dla takich terapii i profilaktykisą szczepionki. Podstawowa koncepcja konstruowania szczepionki na raka jest w teorii prosta. W praktyce jednakże opracowanie skutecznych szczepionek na raka przeciwko guzóom litym spotyka się z ograniczonym sukcesem. Na przykład, grupa badawcza usiłująca podawać pacjentom szczepionkę peptydową skierowaną przeciwko czerniakowi z przerzutami obserwowała wskaźnik obiektywnych odpowiedzi zaledwie w 2,6% przypadków (Rosenberg SA i in. (2004) Nat. Med. 10: ). [0005] Istnieje wiele potencjalnych wyjaśnień tak niskiego odsetka prób zakończonych sukcesem (Campoli M i in. (2005) Cancer Treat. Res. 123:61-68). Przykładowo, nawet jeśli antygen jest swoisty względem konkretnego rodzaju komórki nowotworowej, to ekspresja antygenu w komórce guza może zachodzić na zbyt niski poziomie, lub też antygen może być zlokalizowany w miejscu ukrytym lub w inny sposób osłoniętym przed wykryciem przez układ odpornościowy. Ponadto, guzy często zmieniają swą charakterystykę antygenową poprzez gubienie antygenów w miarę swojego rozwoju. Do niskiego odsetka terapii zakończonych sukcesem przyczynia się także fakt, że w komórkach guza ekspresja białek MHC i innych białek współstymulujących koniecznych do indukowania odpowiedzi immunologicznej może zachodzić na bardzo niskich poziomach. [0006] Dodatkowe problemy, jakie występują w przypadku prób opracowania szczepień przeciwko guzom, dotyczą pacjentek w zaawansowanym stadium nowotworu. U takich pacjentów mogą występować większe guzy pierwotne i przerzutowe, a komórki wewnątrz guza mogą nie być dostępne ze względu na słaby

4 3 przepływ krwi. Jest to zgodne z obserwacją, że strategie oparte na szczepieniach wykazują większe powodzenie w leczeniu hematologicznych nowotworów złośliwych (Radford KJ i in. (2005) Pathology 37: ; i Molldrem JJ (2006) Biol. Bone Marrow Transplant. 12:13-8). Ponadto, w przypadku guzów przerzutowych, może się rozwinąć zdolność tych komórek do uwalniania czynników immunosupresyjnych do ich mikrootoczenia (Campoli, 2005; i Kortylewski M i in. (2005) Nature Med. 11: ). Guzy przerzutowe są także związane ze zmniejszeniem liczby limfocytów krwi obwodowej i dysfunkcją komórek dendrytycznych (Gillanders WE i in. (2008) Breast Diseases: A Year Book and Quarterly 17:26-8). [0007] Chociaż niektóre albo wszystkie z tych czynników mogą wpływać na trudności z opracowaniem skutecznej profilaktycznie lub terapeutycznie szczepionki, to podstawowe wyzwanie wynika z faktu, że większość antygenów guza to antygeny własne lub mające wysoki stopień homologii z antygenami własnymi, w związku z czym można oczekiwać, że będą objęte ostrą tolerancją immunologiczną. W związku z tym jest oczywiste, że wiele szczepionek na raka opartych na peptydach, z substancjami wspomagającymi stymulującymi immunologicznie lub bez, może być skazanych na ograniczone powodzenie w praktyce klinicznej z powodu niskiej immunogenności i braku swoistości. [0008] Prototypowe szczepionki na raka sutka oparte na pojedynczych antygenach okazały się umiarkowanie skuteczne w indukowaniu dającej się oznaczyć odpowiedzi immunologicznej w doświadczeniach na zwierzętach i w badaniach klinicznych u pacjentek z rakiem sutka. Obserwowana odpowiedź immunologiczna nie przełożyła się jednak na ochronę

5 4 immunologiczną przed wznową choroby będącej w stanie remisji po standardowej procedurze chirurgicznej i chemioterapii, która miałaby znaczeni kliniczne. Zatem potrzebne są nowe podejścia do szczepień mające na celu dalsze poprawienie wskaźników ponownego wystąpienia choroby i całkowitego czasu przeżycia u pacjentek z rakiem sutka. [0009] W przypadku szczepionek, preferowane są epitopy, które ulegają ekspresji wyłącznie w nowotworze lub ulegają ekspresji przynajmniej w podwyższonych ilościach. HER2/neu jest protoonkogenem ulegającym ekspresji w wielu nowotworach złośliwych nabłonka (Salamon DJ i in. (1989) Science 244:707-12). Amplifikację genu i nadekspresję białka HER2/neu stwierdza się u 20-25% przypadków raka sutka, a jego nadmierne występowanie stanowi prognostyk słabych rokowań (Pritchard KI i in. (2006) N. Engel. J. Med. 354: ). HER2/neu był badany dość intensywnie i zidentyfikowano kilka peptydów immunogennych tego białka. Jeden z takich peptydów, nazwany E75, odpowiada aminokwasom HER2/neu (SEQ ID No:1) (patent St. Zjednoczonych US 6,514,942). [0010] Podejmowano wysiłki wykorzystania peptydu E75 jako szczepionki przeciwnowotworowej, na przykład jako szczepionki opartej na jednym peptydzie sprzężonym z różnymi immunoadjuwantami (Zaks TZ i in. (1998) Cancer Res. 58:4902-8; Knutson KL i In. (2002) Clin.Cancer Res. 8:1014-8; i Murray JL i In. (2002) Clin. Cancer Res. 8: ); obciążając/wprowadzając na autologiczne komórki dendrytyczne i ponownie podając (Brossart P i in. (2000) Blond 96:3102-8; i Kono K i in. (2002) Clin. Cancer Res. 8: ); lub wbudowując w dłuższe peptydy zdolne do wiązania cząsteczki HLA klasy II w celu wykształcenia komórek T pomocniczych CD4

6 5 (Disis ML i in. (1999) Clin. Cancer Res. 5: ; i Disis ML i in. (2002) J. Clin. Oncol. 20: ). Każde z tych podejść stymulowało specyficzną dla E75 cytotoksyczną odpowiedź immunologiczną, w której pośredniczyły komórki T, ale nie prowadziło do mającej znaczenie kliniczne odporności terapeutycznej lub profilaktycznej u kobiet w zaawansowanym stadium raka sutka. [0011] HER2/neu należy do rodziny genów kodujących receptory ludzkiego nabłonkowego czynnika wzrostu i stanowi gen kodujący receptor kinazy tyrozynowej, o masie 185 kdaltonów, zaangażowany w regulację wzrostu i proliferacji komórek (Popescu NC, King CR, Kraus MH. Localization of the human erb-2 gene on normal and rearranged chromosome 17 to bands q12-21,32. Genomics 1989;4: ; Yarden Y, Sliwkowski MX, Untangling the ErbB signaling network. Nat Rev Mol Bio 2001;2: ). Nadekspresję i/lub amplifikację HER2/neu stwierdzono u 25-30% przypadków inwazyjnych raków sutka (BCa) i związane są z bardziej agresyjnymi guzami i słabszym wynikiem klinicznym. (Salamon DJ, Clark GM, Wong SG i in. Human breast cancer: correlation of relapse and survival with amplification of the HER2/neu oncogene. Science 1987;235: ; Slamon DJ, Godolphin W. Jones LA i in. Studies of the HER2/neu proto-oncogene in human breast and ovarian cancer. Science 1989;244:707-12; Toikkanen S, Helin H, Isola J, Joensuu H. Prognostic significance of HER-2 oncoprotein expression in breast cancer: A 30-year follow-up. J Clin Oncol 1992;10: ). [0012] Oznaczenie poziomu HER2/neu przeprowadza się przeważnie za pomocą dwu testów, badania immunohistochemicznego (IHC) i metodą hybrydyzacji

7 6 fluorescencyjnej in situ (FISH). W badaniu IHC wykrywa się nadekspresję białka HER2/neu, która jest przedstawiana w półilościowej skali ocen od 0 do 3+ (0 = brak, 1+ = ekspresja niska, 2+ = ekspresja średnia, 3+ = nadekspresja). Z kolei metodą FISH wykrywa się amplifikację (kopie nadmiarowe) genu HER2/neu. Wyniki jest wyrażany jako stosunek liczby kopii genu HER2/neu do kopii genu chromosomu 17 i interpretowany jako nadekspresja jeśli FISH wynosi 2,0 kopii. (Hicks DG, Tubus RR. Assesment of the HER2/neu status in breast cancer by fluorescencje in situ hybridization: a technical review with interpretive guidelines. Hum Pathol 2005; 38: ). Zgodność metod IHC i FISH wynosi około 90%. (Jacobs TW, Gown AM, Yaziji H i in. Specificity of Hercep Test In determining HER2/neu status of breast cancers using the United States Food and Drug Administration-approved scoring system. J Clin Oncol 1999; 17: ). Metoda FISH jest uważana za złoty standard, jak ujawnia analiza retrospektywna jest lepszym wskaźnikiem odpowiedzi na trastuzumab (Tz); jest bardziej obiektywna i powtarzalna. (Press MF, Salamon DJ, Flom KJ i in. Evaluation of HER2/neu Gene Amplification and Overexpression: Comparison of frequently Used Assay Methods in a Molecularly Characterized Cohort of Breast Cancer Specimens. J Clin Oncol 2002; 14: ; Bartlett J, Mallon E, Cooke T. The clinical evaluation of HER2/neu status: which test to use? J Pathol 2003; 199: ; Wolff AC, Hammond MEH, Schwartz JN i in. American Society of Clinical Oncology / College of American Pathologists guideline recommendations for human epidermal growth factor receptor 2 testing in breast cancer. J Clin Oncol 2007; 25: ).

8 7 [0013] Zidentyfikowanie i oznaczenie ilościowe HER2/neu jako protoonkogenu doprowadziło do humoralnej lub opartej na przeciwciałach immunoterapii pasywnej, obejmującej stosowanie trastuzumabu (Herceptin ). Trastuzumab stanowi rekombinowane, humanizowane przeciwciało monoklonalne, mające zdolność wiązania z pozakomórkową domeną transbłonową białka HER2/neu. (Plosker GL, Keam SJ. Trastuzumab: A review of its use In the management of HER2-positive metastatic and Elary-stage breast cancer. Drugs 2006; 66: ). Trastuzumab jest wskazany do leczenia pacjentek ze stwierdzoną nadekspresją HER2/neu (IHC 3+ lub FISH 2) z przerzutami do węzłów chłonnych (NP) i raka sutka z przerzutami (Vogel CL, Cobleigh MA, Tripathy D i in. Efficacy and safety of trastuzumab as a single agent In first-line treatement of HER2-overexpressing metastatic breast cancer. J Clin Oncol 2002;20: ; Piccart-Gebhart MJ, Procter M, Leyland-Jones B i in. Trastuzumab after adjuvant chemotherapy in HER2-positive breast cancer. N Engl J Med 2005;353: ) i wykazuje bardzo ograniczoną aktywność u pacjentek z niską i średnią ekspresją HER2/neu. (Herceptin (Trastuzumab) prescription product insert. South San Francisco, CA: Genentech Inc., revised September 2000). [0014] Inną realizowaną formą immunoterapii jest szczepienie i immunoterapia aktywna, której celem jest wywołanie odpowiedzi immunologicznej na epitopy antygenów związanych z guzem (TAA), takich jak HER2/neu. HER2/neu stanowi źródło kilku immunogennych peptydów, które mogą stymulować układ odpornościowy do rozpoznawania i likwidowania komórek raka wykazujących ekspresję HER2/neu. (Fisk B, Blevins TL, Wharton JT i in. Identification of immunodominant peptide of the V

9 8 proto-oncogene recognized by ovarian tumor-specific CTL lines. J Exp Med 1995; 181: ). [0015] E75 (KIFGSLAFL, HER2/neu, ) jest sekwencją peptydową należącego do rodziny protonkogenu HER2/neu i jest stosowany w badaniach klinicznych jako szczepionka przeciwnowotworowa do stymulacji cytotoksycznych limfocytów T (CTL) w celu zniszczenia komórek nowotworowych. (Zaks T i in. Immunization with a peptide epitope ( ) from HER2/neu leads to peptide specific cytotoxic T lymphocytes that fail to recognize HER2/neu+ tumors. Cancer Research, 58 (21):4902-8, 1998; Knutson KL, Schiffman K, Cheever MA i in.immunization of cancer patients with HER2/neu, HLA-A2 peptide, p , results in short-lived peptide-specific immunity. Clin Cancer Res 8: , 2002; Murray JL, Gillogly ME, Przepiorka D i in, Toxicity, immunogenicity, and induction of E75-specific tumorlytic CTLs by HER-2 peptide E74 ( ) combined with granulocyte macrophage colonystimulating factor in HLA-A2+ patients with metastatic breast and ovarian cancer. Clin Cancer Res 8: , 2002; Avigan D, Vasir B, Gong J i in. Fusion cell vaccination of patients with metastatic breast and renal cancer cell induces immunological responses. Clin Cancer Res 2004; 10: ; Disis ML, Gooley TA, Rinn K I in. Generation of T-cell immunity to the HER2/neu protein after active immunization with HER2/neu peptide-based vaccines. J Clin Oncol 2002;20: ; Disis ML, GrabsteinKH, Sleath PR I in. Generation of immunity to the HER2/neu oncogenic protein in patients with breast and ovarian cancer using a peptide-based vaccine. Clin Cancer Res 5: , 1999.

10 9 [0016] Ukierunkowana immunoterapia bierna oparta na protoonkogenie HER2/neu krążyła pierwotnie wokół stosowania trastuzumabu (Herceptin ). Trastuzumab stanowi rekombinowane, humanizowane przeciwciało monoklonalne, mające zdolność wiązania z pozakomórkową domeną transbłonową białka HER2/neu Trastuzumab został zatwierdzony przez urzędy rejestracyjne ze wskazaniem do leczenia pacjentek ze stwierdzoną nadekspresją HER2/neu (IHC 3+ lub FISH 2) z przerzutami i w opiece adjuwantowej u pacjentów z przerzutami do węzłów chłonnych. Trastuzumab był poddawany wielu badaniom klinicznym i jest obecnie rutynowo stosowany w leczeniu pacjentek z przerzutami oraz w leczeniu adjuwantowym pacjentek obarczonych wysokim ryzykiem z nadekspresją HER2/neu. Jednakże trastuzumab wykazuje ograniczoną aktywność u pacjentek z niską i średnią ekspresją HER2/neu. Zatem, opierając się na wcześniejszych wynikach obserwowanych w przypadku stosowania trastuzumabu, nie spodziewano by się skuteczności immunogennych szczepionek peptydowych skierowanych przeciwko HER2/neu u pacjentek na raka z niskim i średnim poziomem ekspresji HER2/neu przez komórki guza. [0017] Tak więc, istnieje e potrzeba wykorzystania immunoochronnego i terapeutycznego potencjału E75 do wytwarzania szczepionek, które zaoferują chorym na raka sutka w stadium remisji niezawodną ochronę przed nawrotami choroby. SKRÓCONY OPIS WYNALAZKU [0018] Istotę wynalazku stanowi kompozycja do zastosowania w metodach wywoływania i utrzymywania odporności przeciwko nawrotom raka sutka u pacjentek z rakiem sutka w stadium remisji. Przedmiotem wynalazku jest kompozycja zawierająca farmaceutycznie skuteczny nośnik i peptyd o sekwencji

11 10 aminokwasowej SEQ ID NO: 2 do zastosowania w wywoływaniu profilaktycznej lub terapeutycznej odporności przeciwko nawrotom raka u pacjentki, który to pacjent ma potwierdzoną immnunochemicznie (IHC) ocenę poziomu ekspresji białka HER2/neu na poziomie 1+ lub 2+ i ocenę poziomu ekspresji genu HER2/neu stosując fluorescencyjną hybrydyzację in situ (FISH) poniżej 2,0 20%. Podawanie można zrealizować dowolnymi środkami odpowiednimi w dziedzinie, takimi jak szczepienie lub iniekcje, a bardziej konkretnie iniekcje śródskórne, które można podawać w jednej lub większej ilości oddzielnych dawek. Takie dawki mogą zawierać równe stężenia peptydu i immunoadjuwanta, mogą być podawane zasadniczo równocześnie w jednym miejscu szczepienia lub oddzielnie od siebie na powierzchni skóry. Kompozycja może być podawana około trzech do sześciu razy lub więcej co miesiąc, aż do uzyskania odporności ochronnej. W niektórych aspektach, kompozycja zawiera ponadto adjuwant, taki jak rekombinowany ludzki czynnik stymulujący wzrost kolonii makrofagów (GM-CSF). [0019] W niektórych aspektach, metody obejmują także podawanie pacjentowi dawki uzupełniającej szczepionki, która zawiera skuteczną ilość kompozycji zawierającej farmaceutycznie skuteczny nośnik i peptyd o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO: 2. W niektórych aspektach, kompozycja dawki uzupełniającej zawiera ponadto adjuwant, taki jak GM-CSF. Podawanie dawki uzupełniającej można zrealizować przez szczepienie lub iniekcje i może być podawana następnie co sześć lub dwanaście miesięcy. [0020] Pacjentem może być dowolny ssak, korzystnie człowiek. W pewnych aspektach, człowiek posiada główne zgodne histologicznie antygeny krwi, takie jak ludzki antygen

12 11 leukocytowy A2 lub ludzki antygen leukocytowy A3. W innych aspektach, u człowiek zachodzi ekspresja na wykrywalnym poziomie HER2/neu. U człowieka zachodzi ekspresja HER2/neu na ma niskim lub średnim poziomie i potwierdzono immunohistochemicznie (IHC) ocenę poziomu ekspresji HER2/neu na poziomie 1+ lub 2+ i/lub poziom ekspresji genu HER2/neu w skali hybrydyzacji fluorescencyjnej in situ (FISH) poniżej 2,0 20%. [0021] Kompozycja zawiera farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, peptyd o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO: 2, adiuwant, taki jak czynnik stymulujący wzrost kolonii makrofagów, oraz zoptymalizowany harmonogram immunizacji. W niektórych konkretnych aspektach, korzystne stężenia i reżimy dawkowania kompozycji szczepionki obejmują: (1) 1 mg/ml peptydu i 0,25 mg/ml adjuwanta, (2) 0,5 mg/ml peptydu i 0,25 mg/ml adjuwanta, (3) 0,1 mg/ml peptydu i 0,25 mg/ml adjuwanta, oraz (4) 0,5 mg/ml peptydu i 0,125 mg/ml adjuwanta, każde do szczepienia co miesiąc przez 6 kolejnych miesięcy, a następnie coroczne szczepienia uzupełniające przez 3 lub więcej lat. ZWIĘZŁY OPIS RYSUNKÓW [0022] Towarzyszące rysunki, które są załączone w celu dalszego zrozumienia wynalazku i są włączone jako część obecnego opisu, ilustrują aspekty wynalazku i razem z opisem służą wyjaśnieniu istoty wynalazku. Na rysunku: [0023] Fig. 1 przedstawia maksymalną toksyczność miejscową i ogólnoustrojową doświadczaną przez pacjentki szczepione E75. Toksyczność miejscowa (rumień i stwardnienie w miejscu iniekcji) jest efektem żądanym, pokazującym odpowiedź na szczepionkę. Najczęstsze działania toksyczne stopnia 2

13 12 stanowiły świąd lub zaburzenia wymagające leczenia. Najczęstsze ogólnoustrojowe działania toksyczne stanowiły ból kości, objawy grypopodobne i zmęczenie (zazwyczaj związane z GM-CSF) i trwały <24 godzin. Dwa ogólnoustrojowe działania toksyczne stopnia 3 stanowiły obrzęk naczynioruchowy języka (po szóstym szczepieniu) i ból kostny. [0024] Fig. 2 przedstawia wykresy wg Kaplana-Meiera czasu przeżycia bez choroby przy medianie z okresu obserwacji wynoszącej 20 miesięcy. Przy 171 zakwalifikowanych do badania pacjentek, wskaźnik nawrotu choroby w grupie szczepionych wynosił 5,6% w porównaniu z 14,2% w grupie kontrolnej (P=0,04) w okresie obserwacji, którego mediana wynosiła 20 miesięcy. Wskaźniki czasu przeżycia bez choroby w grupach szczepionej i kontrolnej wynosiły odpowiednio 92,5% i 77%. [0025] Fig. 3A i 3B przedstawiają odpowiedź CTL indukowaną przez szczepionkę E75. (A) CTL indukowane przez szczepionkę E75 dla wszystkich pacjentek. Średnie poziomy CTL CD8+ swoistych dla E75 znacząco wzrosły w porównaniu z poziomami przed szczepieniem (0,39%, zakres 0,06-2,91%) do poziomu maksymalnego (1,8, zakres 0,4-12,2%, P<0,0001) i do poziomu po szczepieniu (0,70%, zakres 0,08-2,91%, P=002). Nie obserwowano różnicy pomiędzy poziomem swoistych komórek T CD8+ przed szczepieniem a poziomem długotrwałym (sześć miesięcy). (B) swoiste CTL indukowane przez szczepionkę E75 bazujące na istniejącej odporności. Pacjentki z istniejącą odpornością i pozbawione odporności wykazywały identyczne profile odpowiedzi na szczepionkę E75, z podobną medianą toksyczności maksymalnej i poziomami po szczepieniu w obydwu grupach. Jednakże u pacjentek bez istniejącej odporności następował znaczący wzrost poziomów dimeru od poziomu przed

14 13 szczepieniem do poziomu po sześciu miesiącach od szczepienia (0,13% [zakres 0-0,28%] vs. 0,45% [0-2,68%], P<0,0001). [0026] Fig. 4A-4D przedstawiają wyniki testu nadwrażliwości typu opóźnionego (DTH). (A) DTH dla wszystkich pacjentek po szczepieniu. Kontrola 2,1 0,5 mm w porównaniu z peptydem 14,0 1,4 mm, P<0,0001. (B) DTH przed szczepieniem i po szczepieniu dla pacjentek bez przerzutów do węzłów chłonnych (NN). Nie obserwowano różnicy między kontrolną solą fizjologiczną a wynikami przed szczepieniem peptydem. Po szczepieniu nastąpił znaczący wzrost poziomu odpowiedzi DTH na peptyd E75 w porównaniu z kontrolą po szczepieniu (P<0,001) i w porównaniu z DTH przed szczepieniem E75 (P<0,001). (C) DTH po szczepieniu według badania. Pacjentki z przerzutami do węzłów chłonnych (NP) wykazywały znacząco wyższe poziomy odpowiedzi DTH w porównaniu z chorymi bez przerzutów (NN) (17,3 2,4 mm vs. 10,9 1,5 mm, P=0,02). Może to wynikać z różnicy średniej dawki całkowitej szczepionki w grupie NN (2000 g vs g, P<0,0001). (D) DTH po szczepieniu według kryterium dawki. Pacjentki otrzymujące <6000 g E75 wykazywały znacząco niższy poziom odpowiedzi DTH w porównaniu z chorymi otrzymującymi w sumie 6000 g E75 (13,3 1,9 mm vs. 25,1 4,0 mm, P=0,008). [0027] Fig. 5 przedstawia liczbę komórek T CD8+ u pacjentek otrzymujących szczepionkę uzupełniającą. Pacjentki otrzymujące szczepionkę uzupełniającą 6 miesięcy po podstawowym cyklu szczepień miały znacząco wyższe poziomy komórek T CD8+ niż pacjentki >6 miesięcy po podstawowym cyklu szczepień. W grupie tych pacjentek >6 miesięcy obserwowano nieznaczący spadek od 0,7% do 0,44% w stosunku do ich własnych poziomów 6 miesięcy po szczepieniu podstawowym.

15 14 [0028] Fig. 6 przedstawia stopień zaawansowania toksyczności miejscowej i ogólnoustrojowej. Większość pacjentek doświadczała toksyczności miejscowej stopnia 1, a tylko 2 pacjentki doświadczyły toksyczności miejscowej stopnia 2. U ponad połowy pacjentek nie wystąpiła toksyczność ogólnoustrojowa, nie było przypadków toksyczności ogólnoustrojowej stopnia 2 lub 3. Jedenaście przypadków pacjentek, u których wystąpiła toksyczność ogólnoustrojowa stopnia 1 obejmowało (ilość przypadków): zmęczenie (4), ból głowy (4), bóle mięśni (3), uczucie zimna (2), gorączkę (2), biegunkę (1), złe samopoczucie (1), ból kości (1) i ból stawów (1). [0029] Fig. 7 przedstawia odpowiedź na szczepionkę uzupełniającą u pacjentek bez SRI, wykazującą tendencję zmniejszania liczby komórek T CD8+ swoistych dla antygenu. [0030] Fig. 8 przedstawia liczbę pacjentek, u których stwierdzono podwyższoną liczbę komórek wydzielających IFN- wykrywanych w teście immunoenzymatycznym. W sumie, u 91% pacjentek następowało zwiększenie liczby komórek T swoistych dla antygenu (funkcjonalnych), oznaczanych techniką ELISpot, natomiast u 50% stwierdzono wyraźny wzrost (zwiększenie liczby komórek wydzielających IFN- w 50% oznaczeń). [0031] Fig. 9 przedstawia reakcje miejscowe u pacjentek otrzymujących szczepionkę uzupełniającą. Pacjentki otrzymujące szczepionkę uzupełniającą w okresie czasu bliższym ukończenia zasadniczego cyklu szczepień ( 9 miesięcy; jasne słupki) doświadczały znacznie większych reakcji miejscowych niż pacjentki >9 miesiąca od zasadniczego cyklu szczepień. W obu grupach występowały podobne reakcje miejscowe na zakończenie zasadniczego cyklu (strona lewa).

16 15 Dane te sugerują efekt addytywny szczepionki uzupełniającej u pacjentek otrzymujących szczepionkę uzupełniającą wcześniej i utrzymywanie się efektu u pacjentek otrzymujących szczepionkę uzupełniającą później. [0032] Fig. 10 przedstawia zwiększanie reakcji miejscowej w czasie trwania zasadniczego cyklu szczepień i ilustruje, że pacjentki w obu grupach w cyklu początkowym reagowały tak samo, a jedyną różnicą jest czas od cyklu zasadniczego. Punkt Inj. 6 różni się od LR przy ostatniej dawce szczepień podstawowych pokazanej na Fig. 7, ponieważ niektóre pacjentki otrzymały jedynie 4 szczepienia. Wyniki pacjentek z obu grup były zasadniczo identyczne we wszystkich punktach z wyjątkiem szczepienia 3 (inj. 3), gdy wyniki dla grupy 9 miesięcy były większe (97 vs. 80, p=0,04). [0033] Fig. 11A - Fig. 11D przedstawiają odpowiedzi: immunologiczną (średnia SE) i potwierdzoną klinicznie (częstość bezwzględna nawrotów i częstość przypadków zgonów) pacjentek zakwalifikowanych do fazy II badania klinicznego E75 według kryterium ekspresji HER2/neu w grupach LE vs. OE. [0034] A. Odpowiedź immunologiczna in vitro we wszystkich punktach przed maks procent swoistych komórek T CD8+ in vitro zwiększył się statystycznie (LE p<0,001, OE p=0,001), u pacjentek LE obserwowano wyższy maksymalny poziom odpowiedzi niż u pacjentek OE (p=0,04). [0035] B. Odpowiedź immunologiczna in vivo we wszystkich przypadkach DTH przed-po in vivo statystycznie zwiększyły się (LE p<0,001, OE p=0,02). [0036] C. Częstość nawrotów częstość nawrotów była niższa u pacjentek szczepionych LE i OE, ale nie były to różnice statystycznie istotne.

17 16 [0037] D. Częstość przypadków zgonów u pacjentek szczepionych LE obserwowano tendencję zmniejszenia częstości zgonów. [0038] Fig. 12A - Fig. 12D przedstawiają odpowiedzi: immunologiczną (średnia SE) i potwierdzoną klinicznie (częstość bezwzględna występowania nawrotów i częstość przypadków zgonów) u pacjentek zakwalifikowanych do fazy II badania E75 według kryterium poziomu ekspresji HER2/neu. Poziom ekspresji oznaczano metodą IHC (0, 1+, 2+, 3+). [0039] A. Odpowiedź immunologiczna in vitro wszystkie poziomy procentowe komórek T CD8+ swoistych przed - maks in vitro statystycznie wzrosły (LE p<0,001, OE p=0,001), ale jedynie poziom HER2/neu 1+ przed-długotrw. wykazywał tendencje osiągania wartości istotnej statystycznie (p=0,08). [0040] B. Odpowiedź immunologiczna in vivo wszystkie warości DTH przed-po in vivo statystycznie wzrosły (0 p=0,03, 1+ p=0,02, 2+ p=0,02, 3+ p=0,05). [0041] C. Częstość nawrotów częstość nawrotów była niższa u pacjentek szczepionych o wszystkich poziomach IHC, ale różnica nie była istotna statystycznie. [0042] D. Współczynnik umieralności współczynnik umieralności zmniejszył się u pacjentek szczepionych przy wszystkich poziomach IHC i był istotny statystycznie u pacjentek szczepionych z poziomem HER2/neu 1+ (p=0,04). [0043] Fig. 13A i 13B przedstawiają oznaczenie Dimeru (dimeru D) i DTH według kryterium ODG vs. SDG. (A) Obserwowano znaczącą różnicę dla ODG vs. SDG średnich wartości procentowych komórek T CD8+ swoistych dla E75 przed szczepieniem (0,91+0,13% vs. 0,54+0,11%, p=0,03). Nie obserwowano znaczącej różnicy pomiędzy średnimi maksymalnymi

18 17 zawartościami procentowymi komórek T CD8+ swoistych dla E75. Optymalna dawka wykazała tendencję zwiększania średniego procentu komórek T CD8+ swoistych dla E75 po szczepieniach podawanych co miesiąc (0,87+0,10% vs. 0,67+0,05%, p=0,07). Nie obserwowano różnicy pomiędzy grupami w średnich długotrwałych poziomach komórek T CD8+ swoistych dla E75 po 6 miesiącach. (B) Średnia ortogonalna odpowiedź DTH (mm) ODG vs. SDG nie wykazała różnicy w stosunku do materiału inokulacyjnego kontroli (3,0+1,1 mm vs. 2,0+0,5 mm). Odpowiedź DTH na peptyd była istotnie podwyższona w ODG vs. SDG (21,5+2,5 mm vs. 11,3+1,3 mm, p=0,00021). [0044] Fig. 14 przedstawia porównanie pomiędzy SDG i ODG częstości nawrotów potwierdzonych klinicznie. W porównaniu z SDG, grupa ODG wykazywała tendencje do zmniejszenia częstości nawrotów (p=0,27), ale przy znacząco krótszej medianie okresu obserwacji. Jednakże, grupa ODG składała się z pacjentek młodszych z chorobą znacznie bardziej inwazyjną. SZCZEGÓŁOWY OPIS WYNALAZKU [0045] Różne określenia odnoszące się do metod i innych aspektów obecnego wynalazku są stosowane w całym opisie i zastrzeżeniach. Takim określeniom przypisuje się ich zwykłe znaczenie w dziedzinie do której należy wynalazek, o ile nie wskazano inaczej. Inne konkretne zdefiniowane określenia należy rozumieć w sposób zgodny z podaną niniejszym definicją. [0046] Określenie zapobiegać odnosi się do działań prowadzących do uniknięcia z powodzeniem wznowy/nawrotów raka u pacjentek w stadium remisji klinicznej, zgodnie z pomiarami

19 18 na podstawie dowolnego parametru obiektywnego lub subiektywnego, w tym wyników badania radiologicznego lub fizykalnego. [0047] Skuteczna ilość lub terapeutycznie skuteczna ilość są niniejszym stosowane zamiennie i odnoszą się do ilości związku, materiału lub kompozycji, jakie tutaj opisano, skutecznej do uzyskania konkretnego działania biologicznego takiego jak, ale bez ograniczeń, działania biologiczne ujawnione tutaj, opisane lub poparte przykładem. Takie działania mogą obejmować, ale nie są do nich ograniczone, zapobieganie rakowi sutka, a bardziej konkretnie, zapobieganie nawrotom raka sutka, np. zapobieganie nawrotom u pacjenta, co określa się za pomocą dowolnych środków znanych w dziedzinie. Optymalna ilość terapeutyczna odnosi się do dawki, schematu i stosowania szczepionki uzupełniającej dla uzyskania najlepszego wyniku klinicznego. [0048] Farmaceutycznie akceptowalny odnosi się do tych właściwości i/lub substancji, które są akceptowalne dla pacjenta z farmakologicznego/toksykologicznego punktu widzenia i dla producenta chemika-farmaceuty z fizycznego/chemicznego punktu widzenia w odniesieniu do kompozycji, formulacji, stabilności, akceptacji przez pacjentki i dostępności biologicznej. Farmaceutycznie akceptowalny nośnik odnosi się do ośrodka, który nie wpływa na skuteczność aktywności biologicznej składnika(-ów) aktywnego(-ych) i nie jest toksyczny dla pacjenta, któremu jest podawany. [0049] Odporność ochronna lub ochronna odpowiedź immunologiczna oznaczają, że u pacjenta uległa zwiększeniu aktywna odpowiedź immunologiczną przeciwko składnikowi

20 19 immunogennemu antygenu takiego jak opisane tutaj i przedstawione w przykładach antygeny raka sutka, tak że przy kolejnej ekspozycji na antygen układ odpornościowy pacjentki jest zdolny namierzyć i zniszczyć komórki wykazujące ekspresję antygenu, tym samym zmniejszając wskaźnik zapadalności na chorobę i śmiertelności z powodu nawrotu raka u pacjentki. Odporność ochronną w kontekście obecnego wynalazku korzystnie, ale nie wyłącznie, nadają limfocyty T. [0051] Określenie około stosowane niniejszym w odniesieniu do wartości dającej się zmierzyć takiej jak ilość, materialny czas trwania i tym podobne, obejmuje odchylenia o 20% lub 10%, bardziej korzystnie 5%, nawet bardziej korzystnie 1%, a jeszcze bardziej korzystnie 0,1%, od określonej wartości, jako że takie odchylenia są właściwe do wykonania ujawnionych metod. [0051] Peptyd odnosi się do dowolnego peptydu zawierającego dwa lub więcej aminokwasy połączone ze sobą wiązaniem peptydowym lub modyfikowanym wiązaniem peptydowym, czyli izostery peptydów. Polipeptyd odnosi się zarówno do krótkich łańcuchów, powszechnie określanych mianem peptydów, oligopeptydów lub oligomerów, jak i do dłuższych łańcuchów, ogólnie określanych mianem białek. Polipeptydy mogą zawierać aminokwasy inne niż 20 aminokwasów kodowanych genetycznie. Polipeptydy zawierają sekwencje aminokwasów modyfikowane albo w procesach naturalnych, takich jak procesy posttranslacyjne, lub za pomocą technik modyfikacji chemicznej, które są dobrze znane w dziedzinie. Modyfikacje takie są szeroko opisane w podstawowych tekstach i w bardziej szczegółowych monografiach, jak również w obszernej literaturze badawczej. Modyfikacje mogą mieć miejsce w dowolnym miejscu polipeptydu,

21 20 w tym w szkielecie peptydu, łańcuchach bocznych aminokwasów i grupach końcowych aminowych lub karboksylowych. Należy uznać, że ten sam rodzaj modyfikacji może występować w tym samym lub innych stopniach w kilku miejscach danego polipeptydu. Ponadto, dany polipeptyd może zawierać wiele rodzajów modyfikacji. Polipeptydy mogą być rozgałęzione w wyniku enzymatycznego procesu ubikwitynowania i mogą być cykliczne, z rozgałęzieniami lub bez. Cykliczne, rozgałęzione i rozgałęzione cykliczne polipeptydy mogą być wynikiem naturalnie zachodzących procesów posttranslacyjnych lub mogą być otrzymane metodami syntetycznymi. Modyfikacje obejmują acetylowanie, acylowanie, ADP-rybozylowanie, aminowanie, kowalencyjne przyłączenie flawiny, kowalencyjne przyłączenie reszty hemowej, kowalencyjne przyłączenie nukleotydu lub pochodnej nukleotydu, kowalencyjne przyłączenie lipidu lub pochodnej lipidu, kowalencyjne przyłączenie fosfatydyloinozytolu, sieciowanie poprzeczne, cyklizację, tworzenie mostków dwusiarczkowych, odmetylowanie, tworzenie kowalencyjnych wiązań poprzecznych, tworzenie cystyny, tworzenie piroglutaminianu, formylowanie, -karboksylację, glikozylację, kotwiczenie za pośrednictwem GPI, hydroksylację, jodowanie, metylowanie, mirystoilowanie, utlenianie, obróbkę proteolityczną, fosforylację, prenylację, racemizację, selenoizację, siarczanowanie, addycję aminokwasów do białek za pośrednictwem trna, jak arginylowanie i ubikwitynowanie. [0052] Dawka uzupełniająca odnosi się do dawki immunogenu podawanej pacjentkom w celu wzmocnienia, przedłużenia lub podtrzymania ochrony immunologicznej i przezwyciężenia

22 21 obniżenia wskaźnika odpowiedzi komórek T, w której pośredniczą regulatorowe komórki T. [0053] Wolny od raka sutka lub bez choroby lub NED (brak dowodów na istnienie choroby, ang. No Evidence of Disease) oznacza, że chory jest w stadium remisji klinicznej spowodowanej leczeniem za pomocą aktualnych standardowych terapii leczniczych. Przez remisję lub remisję kliniczną, które są stosowane równocennie, rozumie się że objawy kliniczne, objawy radiologiczne i objawy raka sutka zostały znacząco ograniczone lub znikły zupełnie, co określono na podstawie diagnostyki klinicznej, jakkolwiek komórki nowotworowe mogą wciąż istnieć w organizmie. Tak więc, uważa się, że remisja obejmuje remisję częściową lub całkowitą. Obecność pozostałych komórek nowotworowych może być oznaczana przy pomocy testów takich jak CTC (krążące komórki nowotworowe) i może być prognostykiem nawrotu. [0054] Wznowa lub nawrót lub odrodzenie się są tutaj stosowane równocennie, i odnoszą się do radiograficznej diagnozy powrotu lub oznak i objawów powrotu raka sutka po okresie poprawy lub remisji. [0055] Rak sutka jest głównym zagrożeniem zdrowia kobiet na całym świecie. Szczepionki na raka sutka, które próbowano dotychczas, miały ograniczoną skuteczność w odniesieniu do nawrotu choroby u pacjentek bez objawów choroby. Zgodnie z wynalazkiem stwierdzono, że nawrotom raka sutka u pacjentek bez objawów choroby można skutecznie zapobiegać podając pacjentkom peptyd onkogenu HER2/neu, E75 (SEQ ID NO:2), przy zachowaniu pewnych warunków. Stwierdzono także, że peptyd E75 jest związany z HLA-A2 i A3 MHC, w związku z czym może

23 22 indukować ochronę immunologiczną u pacjentek z haplotypem HLA-A2 i HLA A3. [0056] Zgodnie z tym, istotę obecnego wynalazku stanowi kompozycja szczepionki do indukowania ochrony immunologicznej zapobiegającej nawrotom raka sutka. Wynalazek dotyczy także kompozycji mających zastosowanie w metodach indukowania i utrzymywania ochrony immunologicznej zapobiegającej rakowi sutka, a bardziej konkretnie nawracającemu rakowi sutka. W pewnych aspektach, metody obejmują podawanie pacjentowi skutecznej ilości kompozycji zawierającej farmaceutycznie skuteczny nośnik i polipeptyd o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:2. [0057] Pacjentką lub pacjentem może być dowolne zwierzę, a korzystnie ssak taki jak człowiek, mysz, szczur, chomik, świnka morska, królik, kot, pies, małpa, krowa, koń, świnia i tym podobne. Najkorzystniej pacjentami są ludzie. W szczególnie korzystnych aspektach, ludzie mają haplotypy HLA- A2 lub HLA-A3. W innych korzystnych aspektach, u ludzi stwierdza się ekspresję ludzkiego HER2/neu. Poziom ekspresji HER2/neu w ludzkich guzach jest nisk i/lub średni. [0058] Kompozycje szczepionki mogą być wytwarzane w postaci preparatów liofilizowanych lub ciekłych dowolnymi środkami dostępnymi w dziedzinie wynalazku. Nieograniczające przykłady preparatów w postaci ciekłej obejmują roztwory, zawiesiny, syropy i emulsje. Odpowiednie ciekłe nośniki obejmują dowolny rozpuszczalnik organiczny lub nieorganiczny, na przykład wodę, alkohol, fizjologiczny roztwór soli, buforowany roztwór soli fizjologicznej, roztwór dekstrozy, roztwory woda-glikol propylenowy, i podobne, korzystnie w postaci wyjałowionej.

24 23 [0059] Kompozycje szczepionki mogą być wytwarzane albo w postaci obojętnej albo w postaci soli. Farmaceutycznie akceptowalne sole obejmują sole addycyjne z kwasami (tworzone z wolnymi grupami aminowymi aktywnych polipeptydów), które są tworzone z kwasami nieorganicznymi jak na przykład kwas chlorowodorowy lub fosforowy, lub kwasami organicznymi jak kwas octowy, szczawiowy, winowy, migdałowy i podobne. Sole utworzone z grup karboksylowych mogą również pochodzić z zasad nieorganicznych takich jak na przykład wodorotlenki sodu, potasu, amonu, wapnia lub żelaza oraz takimi zasadami organicznymi jak izopropyloamina, trietyloamina, 2- etyloaminoetanol, histydyna, prokaina i podobne. [0060] Kompozycje szczepionki są korzystnie formułowane w postaci odpowiedniej do szczepienia lub iniekcji podmiotowi. Do iniekcji, kompozycje według wynalazku mogą być formułowane w postaci wodnych roztworów takich jak woda lub alkohol, lub w zgodnych fizjologicznie buforach takich jak roztwór Hanksa, roztwór Ringera lub buforowana sól fizjologiczna. Roztwór może zawierać środki formulacyjne, takie jak środek zawieszający, konserwujący, stabilizujący i/lub środki ułatwiające dozowanie. Formulacje do iniekcji mogą być również sporządzane w postaci stałej z preparatów przeznaczonych do przekształcania, tuż przed użyciem, w postać ciekłą preparatu odpowiednią do iniekcji, na przykład przez odtwarzanie ex tempore z odpowiednim nośnikiem, takim jak woda wyjałowiona, roztwór soli fizjologicznej lub alkohol. [0061] Kompozycje szczepionki mogą być także formułowane w nośnikach zapewniających podtrzymywane uwalnianie lub postaci preparatów depot. Takie długo działające preparaty mogą być

25 24 podawane przez zaszczepianie lub implantację (na przykład podskórnie lub domięśniowo) lub przez iniekcje. Tak więc, na przykład, kompozycja szczepionki może być formułowana z odpowiednim materiałem polimerycznym lub hydrofobowym (na przykład jako emulsja w akceptowalnym oleju) lub żywicami jonowymiennymi, lub jako trudno rozpuszczalne pochodne, na przykład jako trudno rozpuszczalna sól. Liposomy i emulsje są dobrze znanymi przykładami nośników dostarczających do stosowania jako nośniki. [0062] Kompozycje szczepionki mogą zawierać środki wzmacniające skuteczność ochronną szczepionki, takie jak adjuwanty. Adjuwanty obejmują dowolny związek lub związki, które działają poprzez zwiększenie natężenia odpowiedzi ochrony immunologicznej na antygen peptydu E75, tym samym redukując ilość antygenu niezbędnego w szczepionce i/lub częstotliwość podawania konieczną do wygenerowania ochronnej odpowiedzi immunologicznej. Adjuwanty mogą obejmować na przykład emulgatory, dipeptydy muramylowe, akrydynę, wodne adjuwanty takie jak wodorotlenek glinu, adjuwanty oparte na chitozanie i dowolnej z wielu różnych saponin, oleje i inne substancje znane w dziedzinie, takie jak Amphigen, LPS, ekstrakty bakteryjnych ścian komórkowych, bakteryjne DNA, sekwencje CpG, syntetyczne oligonukleotydy i ich kombinacje (Schijns i In. (2000) Curr. Opin. Immunol. 12:456), ekstrakt ścian komórkowych Mycobacterialphlei (M.phlei) (MCWE) (patent ST. Zjednoczonych nr 4,744,984), DNA M.phlei (M-DNA) i kompleks ścian komórkowych M-DNA-M.phlei (MCC). Związki, które mogą służyć jako emulgatory obejmują naturalne i syntetyczne środki emulgujące, jak również związki anionowe, kationowe i niejonowe. Wśród związków syntetycznych, anionowe

26 25 środki emulgujące obejmują, na przykład, sole potasowe, sodowe i amoniowe kwasu laurynowego i oleinowego, sole wapniowe, magnezowe i glinowe kwasów tłuszczowych i sulfoniany organiczne takie jak laurylosiarczan sodowy. Syntetyczne środki kationowe obejmują na przykład bromek cetylotrietyloamoniowy, natomiast przykładowe syntetyczne środki niejonowe stanowią estry glicerylu (np. monostearynian glicerylu), estry i etery polioksyetylenoglikolu oraz estry sorbitanowe kwasu tłuszczowego (np. monopalmitynian sorbitanu) i ich pochodne polioksyetylenowe (np. polioksyetylenowany monopalmitynian sorbitanu). Naturalne środki emulgujące obejmują gumę akacja, żelatynę, lecytynę i cholesterol. [0063] Inne odpowiednie adjuwanty mogą być tworzone ze składnika olejowego, takiego jak pojedynczy olej, mieszanina olejów, emulsja typu woda w oleju lub emulsja typu olej w wodzie. Olej może być mineralny, roślinny lub zwierzęcy. Oleje mineralne stanowią ciekłe węglowodory otrzymywane z ropy naftowej techniką destylacji i są także opisywane w dziedzinie jako parafina ciekła, wazelina ciekła lub biały olej mineralny. Odpowiednie oleje mineralne obejmują na przykład olej z wątroby dorsza, olej z halibuta, olej z menhadena, olej z gardłosza atlantyckiego i olej z wątroby rekina, wszystkie są dostępne handlowo. Odpowiednie oleje roślinne obejmują na przykład olej rzepakowy, migdałowy, z nasion bawełny, kukurydziany, oliwa z oliwek, olej arachidowy, słonecznikowy, sezamowy, sojowy i tym podobne. Dwa powszechnie stosowane w preparatach szczepionek adjuwanty stanowią kompletny adjuwant Freunda (CFA) i niekompletny adjuwant Freunda (IFA) i są one także przydatne w

27 26 zastosowaniu zgodnym z obecnym wynalazkiem. Zarówno FCA jak i FIA stanowią emulsje typu woda w oleju mineralnym, ale FCA zawiera również martwe bakterie Mycobacterium sp. [0064] W kompozycjach szczepionki mogą być również stosowane na przykład immunomodulujące cytokiny zwiększające skuteczność szczepionki. Nieograniczające przykłady takich cytokin obejmują interferon alfa (IFN- ), interleukinę-2 (IL-2) i czynnik stymulujący tworzenie kolonii makrofagów (GM-CSF) lub ich kombinacje. [0065] Kompozycje szczepionki zawierające antygeny peptydu E75 i dodatkowo zawierające adjuwanty można przygotowywać stosując techniki dobrze znane specjalistom w dziedzinie, obejmujące, ale nie ograniczające się do wymienionych, mieszanie, sonikację i mikrofuidyzację. Adiutant może stanowić od około 10% do około 50% (obj/obj) kompozycji szczepionki, korzystniej około 20% do około 40% (obj/obj), a najkorzystniej około 20% do około 30% (obj/obj) lub dowolną wartość w tym zakresie. Szczególnie korzystnie stanowi 25% (obj/obj). [0066] Kompozycję szczepionki można podawać na drodze infuzji lub iniekcji (np. dożylnych, domięśniowych, śródskórnych, podskórnych, dooponowych, do dwunastnicy, dootrzewnowych, itp.). Kompozycje szczepionki można również podawać donosowo, dopochwowo, doodbytniczo, doustnie lub przezskórnie. Ponadto, kompozycje szczepionki można podawać systemem dostarczania bezigłowym. Korzystnie, kompozycje są podawane przez iniekcje śródskórne. Podawanie może być prowadzone pod kierunkiem lekarza lub asystenta lekarza. [0067] Iniekcje mogą być podzielone na dawki wielokrotne, przy czym takie podzielone szczepienia są korzystnie

28 27 prowadzone zasadniczo równocześnie. Gdy stosowane są iniekcje podzielone, dawka immunogenu jest korzystnie, ale niekoniecznie, dzielona równo w każdym osobnym zastrzyku. Jeśli w kompozycji szczepionki obecny jest adjuwant, dawka adjuwanta jest korzystnie, ale niekoniecznie, dzielona równo w każdym osobnym zastrzyku. Miejsca aplikacji pacjentce szczepionki podzielonej są korzystnie w niewielkiej odległości od siebie.. W pewnych korzystnych aspektach, miejsca iniekcji są co najmniej około 1 cm od siebie w obrębie ciała pacjentki. W pewnych korzystnych aspektach, miejsca iniekcji są co najmniej około 2,5 cm od siebie. W szczególnie korzystnych aspektach, miejsca iniekcji są co najmniej około 5 cm od siebie. W pewnych korzystnych aspektach, miejsca iniekcji są co najmniej około 10 cm od siebie, na przykład co najmniej około 12,5, 15, 17,5, 20 cm od siebie w obrębie ciała pacjentki. Iniekcje w immunizacji podstawowej i iniekcje uzupełniające mogą być podawane w schemacie dawek podzielonych, niniejszym opisanym i popartym przykładami. [0068] Mogą być stosowane różne alternatywne farmaceutyczne systemy podawania. Niestanowiące ograniczenia przykłady takich systemów obejmują liposomy i emulsje. Mogą być także stosowane pewne rozpuszczalniki organiczne takie jak dimetylosulfotlenek. Ponadto, kompozycje szczepionki mogą być podawane z wykorzystaniem systemu podtrzymywanego uwalniania, takiego jak półprzepuszczalne matryce stałych polimerów zawierające środek terapeutyczny. Różne dostępne materiały podtrzymujące uwalnianie są dobrze znane osobom biegłym w dziedzinie. Kapsułki o podtrzymywanym uwalnianiu mogą, zależnie od ich natury chemicznej, uwalniać kompozycje

29 28 szczepionki w okresie od kilku dni do kilku tygodni lub kilku miesięcy. [0069] Aby zapobiec nawrotom raka sutka u pacjentki, która jest w stadium remisji raka sutka, pacjentce podaje się terapeutycznie skuteczną ilość kompozycji szczepionki. Terapeutycznie skuteczna ilość zapewni klinicznie znaczący wzrost liczby cytotoksycznych limfocytów T (CD8+) swoistych przeciwko E75 u pacjentki, jak również klinicznie znaczący wzrost wskaźnika odpowiedzi cytotoksycznych limfocytów T na antygen, potwierdzonych dowolnymi środkami odpowiednimi w dziedzinie. Ogólnie, u pacjentki, terapeutycznie skuteczna ilość kompozycji szczepionki będzie niszczyć minimalne pozostałości choroby i znacząco ograniczać lub eliminować ryzyko nawrotów raka sutka u pacjentki. [0070] Skuteczna ilość kompozycji szczepionki może zależeć od dowolnej liczby zmiennych, w tym, bez ograniczeń, gatunku, rasy, wielkości, wysokości, wieku, ogólnego stanu zdrowia pacjentki, rodzaju formulacji, trybu lub sposobu podawania lub obecności bądź braku czynników ryzyka, które znacząco zwiększają prawdopodobieństwo nawrotu raka sutka u pacjentki. Takie czynniki ryzyka obejmują, choć nie są ograniczone do wymienionych, rodzaj zabiegu chirurgicznego, stan i liczbę zajętych gruczołów chłonnych, wielkość guza, stopień oceny histologicznej guza, obecność/brak receptorów hormonalnych (estrogen i progesteron), ekspresja HER2/neu, inwazja limfonaczyniowa i uwarunkowania genetyczne (BRCA 1 i 2). W pewnych korzystnych aspektach, skuteczna ilość zależy od tego, czy u pacjentki są przerzuty do gruczołu limfatycznego czy nie, a jeśli są przerzuty do gruczołu limfatycznego, to liczba i stopień zajętych gruczołów. We wszystkich

30 29 przypadkach, odpowiednia skuteczna ilość może być rutynowo określona przez osoby biegłe w dziedzinie, z wykorzystaniem rutynowych technik optymalizacji oraz oceny wykwalifikowanego i poinformowanego praktyka oraz inne czynniki oczywiste dla osób biegłych w dziedzinie. Korzystnie, terapeutycznie skuteczna dawka kompozycji szczepionki według wynalazku będzie zapewniać terapeutycznie ochronne korzyści, nie powodując zasadniczej toksyczności wobec pacjentki. [0071] Toksyczność i skuteczność terapeutyczna kompozycji szczepionki może być określana na podstawie standardowych procedur farmaceutycznych w hodowlach komórkowych lub na zwierzętach doświadczalnych, np. oznaczania LD50 (dawka śmiertelna dla 50% populacji) i ED50 (dawka terapeutycznie skuteczna w 50% populacji). Stosunek dawek toksycznej i skutecznej terapeutycznie stanowi indeks terapeutyczny, który może być wyrażany jako współczynnik LD50/ED50. Preferowane są kompozycje szczepionki, które wykazują wysokie wskaźniki terapeutyczne. Dane uzyskane w oznaczeniach w hodowlach komórkowych i badaniach na zwierzętach mogą być wykorzystane do opracowania zakresu dawek do stosowania u pacjentek. Dawka takich kompozycji szczepionki leży korzystnie w przedziale stężeń cyrkulujących w pobliżu ED50 z niewielką toksyczności albo jej brakiem. Dawka może być różna w tym zakresie zależnie od stosowanej postaci dawkowania i wykorzystanej drogi podania. [0072] Wiedza na temat toksyczności może być wykorzystana do bardziej dokładnego określenia użytecznych dawek u konkretnej pacjentki, takiej jak człowiek. Lekarz prowadzący może zakończyć, przerwać lub dostosować podawanie ze względu na toksyczność lub zaburzenia pracy narządów, a także w razie

31 30 konieczności może dostosować leczenie, jeśli odpowiedź kliniczna nie jest wystarczająca, do poprawienia odpowiedzi. Moc dawki podawanej do zapobiegania nawracającego raka sutka będzie różna w zależności od stopnia zaawansowania stanu pacjentki, względnego ryzyka nawrotu lub drogi podawania, wśród innych czynników. Stopień zaawansowania stanu pacjentki może być na przykład oceniany, częściowo, standardowymi metodami oceny rokowań. [0073] Kompozycje szczepionki mogą być podawane pacjentki zgodnie z dowolnym schematem odpowiednim do wywołania i/lub utrzymania ochronnej odporności przeciwko nawrotom raka sutka, a bardziej konkretnie do wywołania i/lub utrzymywania odpowiedzi cytotoksycznych limfocytów T na E75 (SEQ ID NO:2). Przykładowo, chorym można podawać kompozycję szczepionki w schemacie immunizacji podstawowej zgodnie z obecnym opisem i podanymi przykładami, a po schemacie dawki podstawowej może następować schemat szczepionki uzupełniającej w celu podbudowania i/lub podtrzymania odporności ochronnej. [0074] W pewnych aspektach, chorym można podawać kompozycje szczepionki 1, 2 albo 3 razy na miesiąc. Podawanie co miesiąc przez sześć kolejnych miesięcy jest korzystne dla ustalenia odpowiedzi ochronnej immunologicznie, zwłaszcza w odniesieniu do schematu immunizacji podstawowej. W pewnych aspektach, szczepionka uzupełniająca może być podawana w regularnych odstępach, takich jak co 6 lub więcej miesięcy od zakończenia schematu immunizacji podstawowej. Podawanie szczepionki uzupełniającej korzystnie następuje co 6 miesięcy. Dawki uzupełniające mogą być również podawane w miarę potrzeb. [0075] Schemat podawania szczepionki, obejmujący immunizację podstawową i podawanie dawki uzupełniającej, może być