Analityka ogólna, ćwiczenia dla studentów III OAM 2010/2011 Wydział Farmaceutyczny UJCM, Zakład Diagnostyki Medycznej

Transkrypt

1 Prowadzące ćwiczenia: dr Wirginia Krzyściak, mgr Joanna Tisończyk, lek. Paulina Dumnicka Ćwiczenia I I. Zasady BHP w laboratorium medycznym 1. Zagrożenia biologiczne Każdą próbkę lub tkankę pobraną od pacjenta (np. płyny ustrojowe, świeżą tkankę, wydalinę, wydzielinę, plwocinę, płyny z drenów) oraz uszkodzoną skórę pacjenta należy traktować jako zakaźną. Do czynników zakaźnych przenoszonych drogą krwi zaliczamy HBV, HCV i HIV. Możliwe drogi zakażenia: pokarmowa pozajelitowa (przez uszkodzoną skórę lub błony śluzowe) przez powietrze (aerozole). Jeśli doszło do ekspozycji na materiał zakaźny, należy: skaleczoną skórę przemyć wodą z mydłem oraz środkiem do dezynfekcji rąk, a następnie dwukrotnie wetrzeć ten preparat w miejsce i okolice zranienia; nie tamować krwawienia, miejsce zranienia zabezpieczyć opatrunkiem jałowym nie wyciskać ran, nie używać standartowych środków dezynfekcyjnych (jodyny, spirytusu) błony śluzowe i spojówki przepłukać kilkakrotnie wodą lub 0,9% roztworem NaCl; nie używać do płukania jamy ustnej środków dezynfekcyjnych na bazie alkoholu jeśli materiał zakaźny dostał się do ust, trzeba go wypluć i kilkanaście razy przepłukać jamę ustną czystą wodą. 2. Zagrożenia chemiczne Informacje o zagrożeniach i wskazówki co do postępowania po ekspozycji na daną substancję chemiczną podane są w karcie charakterystyki substancji chemicznej. Karty charakterystyki w języku polskim są, zgodnie z prawem, dostarczane wraz z odczynnikami i przechowywane w laboratorium. Na opakowaniach odczynników chemicznych umieszcza się skróconą informację o zagrożeniach związanych z dana substancją, w formie piktogramów. (patrz plik Piktogramy) 3. Zasady obowiązujące na ćwiczeniach z analityki ogólnej i podstaw hematologii na salach ćwiczeń nie wolno jeść, pić, palić tytoniu itp. 1

2 należy pracować uważnie i ostrożnie, aby nie wylać próbek czy odczynników i nie uszkodzić sprzętu laboratoryjnego każdy materiał biologiczny należy traktować jako zakaźny przy pracy z materiałem biologicznym i odczynnikami chemicznymi obowiązuje korzystanie z fartuchów ochronnych i jednorazowych rękawiczek, a w uzasadnionych przypadkach także z okularów ochronnych odpady zakaźne, w tym rękawiczki, należy wyrzucać do odpowiednich pojemników po ćwiczeniach należy uporządkować miejsce pracy i umyć sprzęt wielokrotnego użytku każdy wypadek przy pracy należy zgłosić prowadzącemu ćwiczenia II. Podstawowe informacje o pipetach automatycznych Rodzaje pipet pipety z fazą (poduszką) powietrzną: próbka zasysana do końcówki z tworzywa sztucznego oddzielona jest od tłoka wewnątrz pipety przez poduszkę powietrzną. Na dokładność pipetowania mają wpływ gęstość i lepkość odmierzanego roztworu, głębokość i kąt zanurzenia końcówki pipety przy pobieraniu cieczy oraz ciśnienie, temperatura i wilgotność powietrza. Pipety te najlepiej nadają się do odmierzania cieczy o lepkości i gęstości zbliżonej do wody. Istnieje możliwość zanieczyszczenia pipetowaną cieczą lub jej parą/aerozolem wnętrza pipety (aby tego uniknąć, można użyć końcówek z filtrem). pipety z bezpośrednim wypieraniem: tłok pipety porusza tłoczek wbudowany w końcówkę, ciecz jest bezpośrednio zasysana/wypierana przez tłoczek będący częścią końcówki pipety. Taka konstrukcja pipety pozwala dokładnie odmierzyć ciecze z dużą prężnością pary, lepkością lub gęstością; zapobiega też kontaminacji wnętrza pipety próbką i powstawaniu aerozoli pipetowanej cieczy. Pipetowanie proste wcisnąć przycisk pipety do pierwszego oporu zanurzyć końcówkę pipety w pobieranej cieczy trzymając pipetę pionowo, powoli zwolnić przycisk wyjąć końcówkę z roztworu, dotykając brzegu naczynia usunąć nadmiar płynu na końcówce wcisnąć przycisk do drugiego oporu, aby oddać płyn; końcówkę obetrzeć o ściankę naczynia, aby usunąć z niej cały płyn Pipetowanie zwrotne wcisnąć przycisk pipety do drugiego oporu zanurzyć końcówkę pipety w pobieranej cieczy trzymając pipetę pionowo, powoli zwolnić przycisk wyjąć końcówkę z roztworu, dotykając brzegu naczynia usunąć nadmiar płynu na końcówce wcisnąć przycisk do pierwszego oporu, aby oddać płyn; pewna część płynu pozostanie w końcówce, nie powinna być usuwana metoda pozwala na wielokrotne pipetowanie tej samej cieczy Ogólne wskazówki dotyczące pipetowania objętość należy nastawić w zakresie właściwym dla danej pipety należy stosować końcówki zalecane przez producenta końcówki są jednorazowe 2

3 podczas zasysania cieczy należy trzymać pipetę pionowo i powoli zwalniać przycisk funkcyjny, aby nie dopuścić do zanieczyszczenia wnętrza pipety nie kładziemy poziomo pipety z założoną końcówką; kiedy nie używamy pipety, przechowujemy ją w pozycji pionowej końcówkę odrzucamy natychmiast po użyciu pipetowanie jest dokładniejsze, jeśli pipeta, roztwór i końcówki mają tę samą temperaturę należy regularnie sprawdzać i kalibrować pipety Kalibracja pipet Pipety kalibrujemy używając wody destylowanej i wagi analitycznej o odpowiedniej dokładności. Mierzymy masę odmierzonej wody i przeliczamy ją na objętość (gęstość wody zależy od jej temperatury i ciśnienia atmosferycznego). Wykonujemy 10 pomiarów dla objętości maksymalnej i 10 pomiarów dla objętości minimalnej lub równej 10% objętości maksymalnej. Obliczamy średnią i względny błąd dokładności (1) (miary błędu systematycznego dokładności pomiaru) oraz odchylenie standardowe (2) i współczynnik zmienności (3) (miary błędu przypadkowego precyzji pomiaru): % (1) 100% wartość średnia; wartość nominalna (2) n liczba pomiarów; wartość pomiaru; wartość średnia (3) % 100% SD odchylenie standardowe; wartość średnia III. Badanie fizykochemiczne moczu Badanie ogólne moczu jest badaniem przesiewowym, przydatnym w diagnostyce i kontroli leczenia chorób nerek i dróg moczowych cukrzycy schorzeń wątroby i dróg żółciowych. 3

4 W skład badania ogólnego moczu wchodzą: ocena makroskopowa badanie właściwości fizykochemicznych (m. in. testy paskowe) ocena mikroskopowa Ocena makroskopowa Zapach: świeżo oddany mocz ma nikły zapach, w warunkach fizjologicznych na zapach moczu ma wpływ przede wszystkim spożywany pokarm zapach amoniaku: bakterie gram ujemne zapach zbutwiały/mysi: fenyloketonuria zapach owocowy: ciała ketonowe (niewyrównana cukrzyca) zapach syropu klonowego: choroba syropu klonowego Kolor: prawidłowo różnej intensywności żółty od wydalanego urochromu wodojasny: mocz rozcieńczony ciemnożółty: zagęszczony mocz, ryboflawina bursztynowy: nadmiar urobilinogenu w żółtaczce hemolitycznej żółto zielony: bilirubina / biliwerdyna (produkt utlenienia bilirubiny), zakażenie Pseudomonas czerwony: krew / hemoglobina ciemnobrunatny: melanina, masywna hematuria, kwas homogentyzynowy (alkaptonuria) Zmętnienie: świeżo oddany mocz powinien być klarowny Zmętnienie mogą powodować komórki (leukocyty, erytrocyty, komórki bakteryjne), kryształy (krystaluria szczególnie w moczu alkalicznym), śluz. Badanie fizykochemiczne Przeprowadza się je przede wszystkim przy użyciu pasków testowych. Paski zawierają szereg pół reakcyjnych przystosowanych do jakościowego lub półilościowego oznaczania wybranych właściwości i składników moczu (ciężar właściwy, ph, białko, hemoglobina, esteraza leukocytarna, azotyny, glukoza, ciała ketonowe, bilirubina i urobilinogen, ewentualnie witamina C). Pola testowe zawierają substancje związane z fazą stałą reagujące ze składnikami moczu. W wyniku reakcji powstają barwne produkty, co pozwala na ocenę występowania i oszacowanie stężenia badanego elementu. Ciężar właściwy (właściwie gęstość lub gęstość względna): prawidłowo 1,016 1,022 Ocena zdolności nerek do zagęszczania moczu. Izostenuria kilkakrotnie stwierdzany ciężar właściwy moczu 1,010 1,012 g/ml (równy gęstości względnej odbiałczonego osocza) występuje w niewydolności cewek nerkowych. Reakcja na pasku testowym: na skutek wymiany jonów (głównie Na, K) na jony H następuje zmiana ph na pasku, a w rezultacie zmiana zabarwienia wskaźnika, którym wysycone jest pole reakcyjne (najczęściej błękit bromotymolowy). Ograniczenia testu: test nie reaguje na niezjonizowane składniki moczu (glukoza, mocznik, kreatynina). ph>7 zaniża wynik, białko>100mg/dl zawyża wynik. Inne testy: refraktometr, osmometr (metoda krioskopowa), urometr (metoda grawimetryczna), metoda konduktometryczna (każda metoda ma inne ograniczenia) 4

5 ph: prawidłowo 4,5 8,0; świeżo oddany mocz osoby na standardowej diecie powinien być lekko kwaśny. ph<4.5: kwasica metaboliczna, dieta wysokobiałkowa; ph>8: infekcje bakteryjne, alkaloza, dieta wegetariańska Reakcja na pasku testowym: zmiana zabarwienia wskaźników ph (czerwieni metylowej i błękitu bromotymolowego). Ograniczenia testu: bakteriomocz (długie przechowywanie próbki) powodują alkalizację moczu. Inne testy: ocena równowagi kwasowo zasadowej krwi tętniczej lub włośniczkowej Glukoza: prawidłowo brak Może być obecna w cukrzycy, cukrzycy ciężarnych, glikozuriach nerkowych (tubulopatie: zespół Fanconiego, zaburzenia polekowe). Próg nerkowy dla glukozy wynosi mg/dl. Reakcja na pasku testowym: Oksydaza glukozy: glukoza + 2 H 2 O + O 2 kwas glukonowy + 2 H 2 O 2 Peroksydaza chrzanu: H 2 O 2 + chromogen barwny kompleks + H 2 O Ograniczenia testu: czynniki redukujące (m.in. witamina C), bakterie (glikoliza), ketony i wysokie ph zaniżają wynik, środki utleniające (podchloryn) zawyżają (bezpośrednio wchodzą w reakcję z chromogenem). Test nie oznacza laktozy, galaktozy, fruktozy. Inne testy: test tabletkowy Clinitest, glukoza w surowicy. Ciała ketonowe: prawidłowo brak Występują w kwasicy ketonowej (cukrzycowej, alkoholowej), przy przedłużającym się głodzeniu, przy diecie bogatej w tłuszcze i ubogiej w wodorowęglany, przy odwodnieniu. Reakcja na pasku testowym: reakcja z nitroprusydkiem sodu w środowisku alkalicznym i w obecności glicyny jako katalizatora reakcji powstaje liliowo fiotetowy kompleks barwny. Ograniczenia testu: Reagują kwas acetooctowy i aceton. Kwas ß hydroksymasłowy nie jest wykrywany. Wyniki fałszywie dodatnie mogą być spowodowane intensywną barwą moczu, obecnością leków zawierających grupy sulfhydrylowe (kaptopril, N acetylocysteina) lub dużymi stężeniami metabolitów lewodopy. Inne testy: glukoza, ciała ketonowe w surowicy, KetoStix, KetoDiasticks, Acetest Bilirubina: prawidłowo brak Reakcja na pasku: bilirubina + sól diazoniowa w obecności H + azobilirubina Ograniczenia: ekspozycja na światło, wysokie stężenia witaminy C, wysokie stężenia azotynów zaniżają wynik. Metabolity chlorpromazyny i przebarwiony mocz mogą zawyżać wynik. Test wykrywa tylko bilirubinę sprzężoną. Inne testy: test tabletkowy (Ictotest, Bayer) czulsza wersja testu paskowego, bilirubina całkowita i bezpośrednia w surowicy krwi Urobilinogen: prawidłowo <1.0 mg/dl Reakcja na pasku: urobilinogen + p dimetyloaminobenzaldehyd w obecności H + różowy kompleks Ograniczenia: leki (kwas p aminosalicylowy, chloropromazyna, sulfonamidy) zawyżają wynik; azotyny oraz przedłużona ekspozycja próbki na tlen oraz światło (urobilinogen urobilina) zaniżają wynik. Niemożliwe jest wykrycie zupełnego braku urobilinogenu. Inne testy: bilirubina całkowita i bezpośrednia w surowicy krwi 5

6 Nadmierna hemoliza Upośledzenie odpływu żółci Uszkodzenie hepatocytów, niewydolność wątroby Przykłady Żółtaczka hemolityczna Żółtaczka mechaniczna Wirusowe zapalenie wątroby Bilirubina niesprzężona / Bilirubina sprzężona 0/ Bilirubina w moczu 0 Urobilinogen w moczu Sterkobilinogen w kale Krew, hemoglobina: prawidłowo brak. Reakcja na pasku testowym: wykorzystanie pseudoperoksydazowych właściwości hemoglobiny nadtlenek obecny w mieszaninie reakcyjnej paska + chromogen (TMB) w obecności hemu barwny kompleks Ograniczenia testu: azotyny>10 mg/dl zaniżają wynik, utleniacze, podchloryn i peroksydazy bakteryjne zawyżają wynik. W teście reaguje też mioglobina. Inne testy: badanie mikroskopowe Przyczyny krwinkomoczu/krwiomoczu i hemoglobinurii przednerkowe nerkowe pozanerkowe skazy krwotoczne, masywna hemoliza wewnątrznaczyniowa zapalenia nerek kłębuszkowe i śródmiąższowe, schorzenia naczyń nerkowych, wielotorbielowatość nerek, nowotwory nerek zapalenia dróg moczowych, kamica nerkowa, nowotwory dróg moczowych, urazy Leukocyty (esteraza granulocytarna): prawidłowo brak Leukocyturia jest wyrazem procesu zapalnego w układzie moczowym (zapalenie pęcherza moczowego, kamica, w związku z cewnikowaniem pęcherza moczowego), może wystąpić po wysiłku fizycznym, przy gorączce, w niewydolności krążenia, może być związana z kontaminacją leukocytami z pochwy. Reakcja na pasku testowym: esteraza leukocytarna przekształca ester indoksylowy do indoksylu; indoksyl tworzy barwny kompleks z solą diazową. Ograniczenia testu: wyniki fałszywie dodatnie mogą być spowodowane zanieczyszczeniem próbki np. wydzieliną z pochwy; białko >500mg/dl, glukoza i niektóre leki (np. cefalosporyny) mogą dawać wyniki fałszywie ujemne. Metoda wykrywa tylko granulocyty. Inne testy: ocena mikroskopowa moczu Azotyny: prawidłowo brak Azotyny powstają w wyniku redukcji wydalanych z moczem azotanów pochodzenia pokarmowego przez bakterie gram ( ). Reakcja na pasku testowym: azotyny + amina w obecności H + związek dwuazowy związek dwuazowy + tetrahydrobenzochinolon różowo czerwony barwnik azowy Ograniczenia testu: wyniki zawyżone przy długim przechowywaniu próbki w temperaturze pokojowej; kwas askorbinowy zaniża wynik; brak azotanów w diecie (pochodzą z warzyw) i krótka inkubacja moczu w pęcherzu (redukcja azotanów do azotynów wymaga czasu) mogą spowodować wyniki fałszywie ujemne (najlepsza próbka 6

7 to pierwsza poranna). Bakterie gram(+) i drożdżaki nie są zdolne do redukcji azotanów i nie są wykrywane tą metodą (dodatni wynik testu potwierdza bakteriurię, ale wynik ujemny nie wyklucza jej). Inne testy: ocena mikroskopowa moczu, posiewy moczu Białko: prawidłowo brak (<20 mg/l). Ilość białka w moczu wykrywana jako ilość śladowa testem paskowym przewyższa znacznie wartości prawidłowe. Każdy dodatni wynik musi być zweryfikowany. Reakcja na pasku testowym: białko wypiera H + z połączenia z barwnikiem (błękit tetrabromofenolowy zbuforowany do ph 3) Ograniczenia testu: test oznacza głównie albuminę, próg detekcji wynosi ok mg/l; wysokie ph moczu i niektóre środki dezynfekcyjne mogą powodować wyniki fałszywie dodatnie. Inne testy: próba zmętnieniowa z kwasem trichlorooctowym (TCA) lub kwasem sulfosalicylowym; czulsze testy paskowe (mikroalbuminuria, metody immunochemiczne); ocena ilościowa (białko/kreatynina lub białkomocz dobowy, metody zmętnieniowe); elektroforeza na żelu poliakrylamidowym z dodatkiem SDS Współczynnik białko/kreatynina: ilość białka w moczu w mg przeliczona na 1g kreatyniny w moczu jest w przybliżeniu liczbowo równa dobowemu wydalaniu białka (np. 200mg/g kreatyniny = 200mg/dobę). Dorosły człowiek wydala w moczu ok. 1g kreatyniny/dobę. Przyczyny białkomoczu przednerkowe nerkowe pozanerkowe funkcjonalne (duży wysiłek fizyczny, ciąża, białkomocz ortostatyczny), gorączka, niedotlenienie nerek, nadciśnienie, masywna hemoliza, rabdomioliza, szpiczak mnogi (białko Bence Jonesa) zespół nerczycowy, kłębuszkowe i śródmiąższowe zapalenia nerek, nowotwory nerek zapalenia dróg moczowych lub gruczołu krokowego, nowotwory dróg moczowych, zanieczyszczenie np. wydzieliną z pochwy Termin mikroalbuminuria oznacza obecność albuminy w moczu w ilościach większych niż fizjologiczne, ale niewykrywalnych rutynowym paskiem testowym (jest to rodzaj białkomoczu). Mikroalbuminuria jest wczesnym markerem nefropatii cukrzycowej i nadciśnieniowej. μg/min mg/24 godz. mg/l mg/g kreatyniny norma* <20 <30 <20 <30 mikroalbuminuria albuminuria >200 >300 >200 >300 * a nawet niżej: mężczyźni 17mg albuminy/g kreatyniny, kobiety 25mg albuminy/g kreatyniny (wyniki badań klinicznych skłaniają do obniżania wartości referencyjnych dla albuminy w moczu) 7