WYKRYWANIE I IDENTYFIKACJA LISTERIA MONOCYTOGENES W ŻYWNOŚCI. Sylwia Wróblewska, Anna Misiewicz

Transkrypt

1 WYKRYWANIE I IDENTYFIKACJA LISTERIA MONOCYTOGENES W ŻYWNOŚCI Sylwia Wróblewska, Anna Misiewicz INSTYTUT BIOTECHNOLOGII PRZEMYSŁU ROLNO-SPOŻYWCZEGO Zakład Mikrobiologii Streszczenie Przedstawiono charakterystykę bakterii z gatunku Listeria monocytogenes, groźnej bakterii chorobotwórczej, występującej i przenoszonej z żywnością, powodującej wiele chorób ludzi i zwierząt. Opisano występowanie bakterii w różnych rodzajach żywności. Przedstawiono metody identyfikacji tej bakterii narzędziami biologii molekularnej. Słowa kluczowe: Listeria monocytogenes, bakterie chorobotwórcze w żywności DETECTION AND IDENTIFICATION OF LISTERIA MONOCYTOGENES IN FOOD Summary The characteristic of human and animal pathogen Listeria monocytogenes that causes a wide spectrum of human and animal diseases. Occurring this bacteria in different food are described. Several molecular methods using to identify this pathogen was included. Key words: Listeria monocytogenes, human and animal pathogens 91

2 I. WPROWADZENIE Bakterie z rodzaju Listeria są grupą drobnoustrojów blisko spokrewnionych z bakteriami należącymi do rodzajów: Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Streptococcus i Staphylococcus. Do rodzaju Listeria należą fakultatywnie beztlenowe, Gram dodatnie i nie tworzące form przetrwalnikowych pałeczki, wykazujące ruchliwość w temperaturze od 10 do 25ºC [Collins i in., 1991; Sallen i in., 1996,]. W rodzaju tym wyróżnia się 6 gatunków bakterii: Listeria monocytogenes, L.innocua, L.ivanovii, L.seeligeri, L.welshimeri i L.grayi. Wielkość komórek bakterii Listeria waha się od 0,4 do 1,5 μm. Mikroorganizmy te, zwłaszcza dwa blisko spokrewnione gatunki L. monocytogenes i L. innocua, szeroko rozpowszechnione w środowisku, izolowane są z zanieczyszczeń, wody, ścieków, produktów spożywczych, odchodów ludzkich i zwierzęcych [Vazquez-Boland i in., 2001]. Oba wymienione gatunki są często znajdowane w produktach żywnościowych, w których mogą wzrastać w szerokim zakresie ph od 4,39 do 9,40, w temperaturze 4 C [Rodriguez-Lazaro i in., 2004]. Najczęściej zakażanymi produktami żywnościowymi są sery i produkty mleczarskie, wędliny, wędzone ryby oraz żywność produkowana przemysłowo, chłodzona i gotowa do spożycia, bez wcześniejszej obróbki cieplnej [Farber i Peterkin, 1991; McLauchlin i in., 1990; McLauchlin i in., 1991; Rocourt 1996]. Obok bakterii Listeria monocytogenes mikroorganizmem potencjalnie patogennym w obrębie rodzaju Listeria są bakterie z gatunku L. ivanovii. Spożycie żywności zawierającej bakterie L. monocytogenes lub L. ivanovii - patogenów ludzkich i zwierzęcych, groźnych dla ptaków, ssaków dzikich i udomowionych, mogą powodować listeriozy. Rozwojowi choroby sprzyjają stany braku odporności, nowotwory, cukrzyca itp., narażone są na nie szczególnie osoby starsze, noworodki i kobiety w ciąży. Nietypowe, grypopodobne objawy listeriozy utrudniają identyfikację pierwszych objawów zakażenia. Profilaktyka zakażeń powinna więc polegać m.in. na stałym monitorowaniu liczby tych bakterii w żywności. Różne metody dbałości o bezpieczeństwo 92

3 mikrobiologiczne surowców i produktów spożywczych stosowane obecnie w przemyśle rolno-spożywczym nie zawsze są skuteczne w stosunku do bakterii Listeria monocytogenes. Patogen ten jest odporny na zakwaszenie środowiska i wysokie stężenia jonów sodowych, które są czynnikami konserwującymi produkty spożywcze. Zdolny jest do namnażania się w niskiej temperaturze panującej w lodówkach i chłodniach. Przechowywanie żywności w warunkach chłodniczych nie zapobiega więc rozwojowi bakterii z rodzaju Listeria. Szczególnie ryzykowne jest jedzenie długo przechowywanych w lodówce takich produktów jak biały ser czy pasztet, a także gotowanych posiłków zawierających mięso nie poddawanych bezpośrednio przed spożyciem działaniu wysokiej temperatury. Bakterie z rodzaju Listeria, izolowane z wody, gleby, gnijącej roślinności, traw, kiszonek oraz różnych gatunków ssaków, ptaków i ryb, są bardzo powszechne w środowisku wiejskim, dlatego zakażenie surowców, użytych następnie do przygotowania przemysłowo przetworzonej żywności, jest bardzo często spotykane. U bakterii tych są dobrze rozwinięte mechanizmy ochronne przed przemysłowymi metodami obróbki i sterylizacji żywności. Wykrywanie obecności bakterii Listeria w produktach żywnościowych staje się istotnym problemem w zapewnieniu bezpieczeństwa żywności. Na walkę z nimi poświęca się coraz więcej środków, opracowując także nowe metody ich wykrywania [Vazquez-Boland i in., 2001]. W obrębie gatunku Listeria monocytogenes tylko trzy (½a, ½b i 4b) z dwunastu znanych serotypów są odpowiedzialne za wywoływanie ponad 90% ludzkich i zwierzęcych przypadków listerioz. Także bakterie o innych serotypach, jak np. 1 / 2 c stanowią częste zanieczyszczenia żywności. Bakterie o serotypie 4b jest przyczyną występowania 50% wszystkich przypadków listerioz. W bakteriach izolowanych z żywności przeważają szczepy bakterii z grupy antygenowej ½ (½a, ½b i ½c). Chociaż zakażenia żywności bakteriami należącymi do gatunku Listeria monocytogenes są względnie częste w stosunku do obecności 93

4 w niej innych bakterii patogennych, to jednak zanotowane przypadki listerioz są rzadsze niż mogłoby to wynikać z częstości ich występowania. Zazwyczaj notuje się od 2 do 8. sporadycznych przypadków listerioz w ciągu roku w Europie i USA. Wyjątkowo wysoki współczynnik zachorowalności notuje się w Hiszpanii i we Francji, odpowiednio 10,9 i 14,7 przypadków na milion osób w ciągu roku. Uważa się, że L.monocytogenes ma niski potencjał patogenności w porównaniu z innymi bakteriami chorobotwórczymi występującymi w żywności, co zgodne jest ze stosunkowo wysoką wartością dawki letalnej (50%=LD 50 ) dla myszy eksperymentalnie zainfekowanych drogą oralną (10 9 jtk) lub rodzicielską (od 10 5 do 10 6 jtk). Minimalna liczba komórek bakterii L.monocytogenes niezbędna dla wystąpienia klinicznej infekcji u ludzi nie została jeszcze określona, jednak duża liczba tych bakterii identyfikowanych w żywności, której spożycie spowodowało wystąpienie objawów klinicznych listeriozy (typowo 10 6 jtk), pozwala wnioskować, że jest to wartość wysoka. Przy określaniu dawki infekcyjnej powinien zostać uwzględniony długi okres inkubacji inwazyjnej listeriozy oraz czas upływający między diagnozą a analizą zjedzonego pokarmu, w którym bakterie namnożyły się w trakcie przechowywania w lodówce pacjenta. Nie można wykluczyć, że infekcję spowodowała mała liczba bakterii w zakażonej partii żywności, a zainfekowana została osoba o obniżonej odporności, w bardziej zaawansowanym wieku lub kobieta ciężarna. Dlatego poziom bakterii od 10 2 do 10 4 jtk w gramie zakażonej żywności wyznaczono jako potencjalnie niebezpieczny dla ludzi [Farber i Peterkin, 1991; Vazquez- Boland i In., 2001]. II. CZYNNIKI PATOGENNOŚCI LISTERIA SPP. Istnieją dowody na powiązania między składem antygenowym i patogennością Listeria spp. Przekonującym przykładem jest budowa serotypu 5 u L.ivanovii, izolowanego prawie wyłącznie z przewodu pokarmowego przeżuwaczy. U tych zwierząt bakterie należące do serotypu 5, powodują infekcje przedurodzeniowe, ale nie są przyczyną zapalenia mózgu, 94

5 najbardziej typowego objawu owczej listeriozy [Wiedemann i in., 1997]. Potwierdzają to obserwacje, że tylko 3 na 13 znanych serotypów L.monocytogenes: 1 / 2 a, 1 / 2 b i 4b, powoduje więcej niż 90% ludzkich i zwierzęcych zachorowań na listeriozy, chociaż inne serotypy, jak 1 / 2 c, są również odnajdowane jako zanieczyszczenia żywności [Wiedemann i in., 1997]. W obrębie serotypów skorelowanych z listeriozami, bakterie o serotypie 4b są odpowiedzialne za ponad 50% zaobserwowanych przypadków na świecie. Na tej podstawie można stwierdzić, że: 1. serotyp 4b jest bardziej zaadaptowany do warunków panujących w tkankach gospodarza niż bakterie zaklasyfikowane do serogrupy ½; 2. pewne klony L.monocytogenes mogą być szczególnie patogenne. Polimorfizm sekwencji DNA w genach wirulencji został zidentyfikowany zarówno poprzez analizę RFLP jak i sekwencjonowanie, co pozwoliło później potwierdzić obecność dwóch linii ewolucyjnych L.monocytogenes. Te dwie zdefiniowane podgrupy zawierają powszechnie występujące szczepy o różnych serotypach. Pierwsza podgrupa zawiera głównie serotypy a i c, natomiast druga zawiera serotyp b. Opierając się na analizie sekwencji genów listeriolizyny O (hly), białka skorelowanego z inwazją (iap) oraz flageliny (flaa) zdefiniowano ostatnio trzy linie genetyczne L.monocytogenes. Rola poszczególnych serotypów L.monocytogenes w zachorowalności zwierząt nie została jeszcze poznana [Wiedemann i in., 1997]. Listeriozy mają u zwierząt cztery odmienne formy kliniczne. Zazwyczaj tylko jeden z symptomów jest widoczny u zakażonego zwierzęcia, co wskazuje, że istnieją różnice w rodzaju wirulencji u poszczególnych szczepów L.monocytogenes [Wiedemann i in., 1997]. Translokacja bakterii z rodzaju Listeria jest prawdopodobnie pasywnym, niespecyficznym procesem, podobnym do obserwowanego u innych bakterii. L.monocytogenes proliferuje ściany jelita cienkiego [Vazquez-Boland i in., 2001]. Nie obserwuje się tego zjawiska u L.innocua. Patogeny te zdolne są do penetracji apikalnej 95

6 spolaryzowanej powierzchni linii zróżnicowanych ludzkich komórek enterocytarnych (Caco-2) z rąbkiem szczoteczkowym [Karunasagar i in., 1994]. Najczęstszym miejscem dla replikacji bakteryjnej są kępki Peyera. Konieczna w tym procesie jest obecność głównego czynnika infekcyjnego Hly (hemolizyna, listeriolizyna O). L.monocytogenes staje się wewnątrzkomórkowym pasożytem, zdolnym do przeżycia i namnożenia w makrofagach. Infekcja jelitowa bakteriami L.monocytogenes przebiega bez większych makroskopowych i histologicznych uszkodzeń jelita [Marco i in., 1992]. Uważa się, że faza jelitowa, w której dochodzi do zwielokrotnienia liczby bakterii L.monocytogenes, nie jest niezbędna do zajścia infekcji systemowej. Ostatnie badania wykazały, że patogen ten ulega translokacji do głębszych organów bardzo szybko, w ciągu kilku minut, wykazując tym samym, że przejście przez barierę jelitową przebiega bez wcześniejszej wewnątrzjelitowej replikacji. Wykazano również, że czynnikami wirulencji niezbędnymi do zajścia inwazji komórek epitelialnych są białka InlA i InlB, dla przeżycia komórkowego Hly; natomiast dla rozszerzania zasięgu infekcji Acta [Vazquez-Boland i in., 2001]. Kliniczna infekcja listerii zależy od trzech głównych czynników: 1. liczby bakterii przyjętych z pokarmem, 2. patogennych właściwości szczepu związanych z rodzajem serotypu, 3. immunologicznego statusu chorego Jednym z pierwszych genów zidentyfikowanych, jako warunkujący wirulencję Listeria monocytogenes był gen hly. Dzięki jego identyfikacji, szybko odkryto i całkowicie scharakteryzowano locus, na którym gen ten został zmapowany. Locus to, o wielkości 9 kb, zawiera geny wirulencji, które są wymagane dla podstawowej funkcji przeżycia mikroorganizmów w środowisku wewnątrzkomórkowym. Locus internaliny, inlab, został zidentyfikowany i scharakteryzowany prawie równocześnie z locus hly. W locus tym (inlab) zlokalizowany jest gen inwazyjny, jako pierwszy tego typu opisany dla bakterii Gram+, 96

7 niezbędny do internalizacji przez komórki, które nie są zwykle fagocytarne, takie jak komórki endotelialne i hepatocyty. Geny infekcyjności i ich funkcje: 1. iap koduje największe zewnątrzkomórkowe białko p60, konserwatywne części genu zlokalizowane są na końcach 5 i 3, natomiast wewnętrzny fragment jest specyficzny gatunkowo i jest wykorzystywany do identyfikacji poszczególnych gatunków rodzaju Listeria. Białko p60 odpowiedzialne jest za hydrolizę mureiny niezbędną w oddzieleniu sept w późnym etapie podziału komórkowego. Poniżej przedstawiono schemat graficzny genu iap z zaznaczeniem fragmentów konserwatywnych i zmiennych [Bubert i in., 1999]: pz konserwatywna 600 pz zmienna 160 pz zmienna pz zmienna 360 pz konserwatywna hlya gen kodujący listeriolizynę O (hemolizynę A), gen wirulencji, jest bardzo konserwatywny dla wszystkich szczepów L.monocytogenes, zidentyfikowany tylko w tym mikroorganizmie. Gen hlya jest pierwszym genem Listeria monocytogenes, który został zsekwencjonowany. Koduje 504-aminokwasowe białko listeriolizynę O, homologiczne do streptolizyny O z S.pyogenes i pneumolizyny z S.pneumoniae. Białko zawiera unikalne reszty cysteiny niezbędne do aktywności cytolitycznej, o maksimum działania w ph 5,5, natomiast przy ph 7 jest niewykrywalne [Mengaud i in., 1988; Cossart i in., 1989]. III. WYKRYWANIE I IDENTYFIKACJA Ze względu na to, iż ludzkie przypadki listerioz powodowane są głównie przez trzy serotypy Listeria monocytogenes (4b, 1 / 2 a i 1 / 2 b), do ich badania stosuje się głównie serotypowanie. Serotypowanie, jako metoda histochemiczna jest główną, aczkolwiek mało swoistą metodą wykrywania bakterii, stosowaną głównie w badaniach epidemiologicznych. Poszukiwane są nowe, alternatywne metody typowania szczepów. Dużą powtarzalność i swoistość typowania zapewnia metoda phage typing, jednak jej ograniczeniem są niskie 97

8 wyniki typowania w obrębie serotypu ½ (ok. 50%) oraz brak fagów dla innych serotypów (3, 4a, 4ab, 4c, 4d, 4e, i 7), które choć rzadko wywołują zakażenie, stanowią jednak potencjalnie zagrożenie dla życia [Farber i Peterkin 1991]. Typowanie izoenzymów pozwala zróżnicować badane bakterie na podstawie różnic w migracji izoform enzymów w polu elektrycznym. Według różnych źródeł można wyodrębnić 45 odmiennych typów elektroforetycznych (ETs) [Piffaretti i in., 1989] lub 56 ET [Bibb i in., 1989]. Co interesujące, wszystkie z głównych listerioz powodowanych przez zakażenia żywnością wydają się mieć taki sam lub podobny genotyp wielolokusowy (profil ETs). Uważa się, że technikę tę można z powodzeniem zastosować w celu potwierdzenia lub wykluczenia źródła epidemii pokarmowej listeriozy. Przy uzyskaniu wspólnego profilu ET, potwierdzającego zakażenia, wyniki powinno się traktować z należytą ostrożnością, jeśli próby pobierano od małej liczby pacjentów [Bibb i in., 1989]. Tradycyjne metody, zarówno izolacji, jak i identyfikacji bakterii Listeria monocytogenes są zarówno czasochłonne jak i niepewne, zwłaszcza przy izolacji termicznie niszczonych bakterii czy też organizmów poddanych różnego rodzaju procesom przemysłowym, uszkadzających strukturę komórki bakteryjnej [Vazquez-Boland i in., 2001]. Metody wykorzystujące do identyfikacji przeciwciała i właściwości kwasów nukleinowych są szybsze i bardziej specyficzne w wykrywaniu bakterii chorobotwórczych występujących w żywności niż tradycyjne metody opierające się na hodowli komórek i klasycznych testach mikrobiologicznych [Wiedemann i in., 1997]. Techniki wykorzystujące najnowsze zdobycze genetyki i biologii molekularnej są bardziej czułe i można dzięki nim wykrywać mikroorganizmy izolowane z przetworzonej żywności. Produkt reakcji PCR może zostać uwidoczniony w wyniku rozdziału elektroforetycznego zarówno na nośniku agarozowym, jak i poliakrylamidowym lub poprzez badanie hybrydyzacji produktów amplifikacji. Technika PCR umożliwiła rozwój metod wykrywania i identyfikacji bakterii chorobotwórczych w tym 98

9 Listeria monocytogenes bezpośrednio w próbkach środowiskowych. Wykrywaniu i identyfikacji mikroorganizmów zakażających żywność sprzyja znajomość sekwencji genów zarówno kwasów deoksyrybonukleinowych (DNA), jak i rybonukleinowych (RNA). Amplifikacja wybranych, określonych fragmentów tych cząsteczek, swoistych gatunkowo, a następnie ich trawienie enzymami restrykcyjnymi (technika RFLP) pozwala z jednej strony sprawdzić, czy badane mikroorganizmy należą do gatunku Listeria monocytogenes, a następnie zróżnicować je do poziomu szczepu [Wiedemann i in., 1997, Rodriguez-Lazaro i in., 2004, Paillard i in. 2003, Doumith i in. 2004]. Znajomość sekwencji genów, których produkty białkowe warunkują proces inwazji patogenu i są włączane w trakcie rozwoju zakażenia, umożliwia opracowanie nowych, niekonwencjonalnych metod pozwalających na szybkie i skuteczne wykrywanie mikroorganizmów w żywności i innych próbkach środowiskowych. IV. PIŚMIENNICTWO 1. Bibb W.F., Schwartz B., Gellin B.G., Plikaytis B.D., Weaver R.E. (1989): Analysis of Listeria monocytogenes by multilocus enzyme electrophoresis and application of the method to epidemiologic investigation. Int. J. Food Microbiol ; 2. Bubert A., Hein I., Rauch M., Lehner A., Yoon B., Goebel W., Wagner M. (1999). Detection and differentiation of Listeria spp. by a single reaction based on multiplex PCR. Appl. Env. Microbiol. 65(10) ; 3. Collins M.D., Wallbanks S., Lane D.J i in. (. 1991): Phylogenetic analysis of the genus Listeria based on reverse transcriptase sequencing of 16S rrna. Int. J. Syst. Bacteriol ; 4. Cossart P., Vicente M.F., Mengaud J., i in. (1989): Listeriolysine O is essential for virulence of Listeria monocytogenes: direct evidence obtained by gene complementation. Infection and Immunity. 57 (11)

10 5. Doumith M., Cazalet C., Simoes N. i in. (2004) New Aspects Regarding Evolution and Virulence of Listeria monocytogenes Revealed by Comparative Genomics and DNA Arrays Infection and Immunity. (2) Farber J.M., Peterkin P.I., (1991): Listeria monocytogenes, a food-borne pathogen, Microbiol. Rev. 55 (3) ; 7. Karunasagar I., Senghaas B., Krohne G., Goebel W., Ultrastructural study of Listeria monocytogenes entry into cultured human colonic epithelial cells. Infection and Immunity ; 8. Marco A.J, Prats N., Ramos J. A. i in. (1992): A microbiological, histopathological and immunohistological study of the intragastric inoculation of Listeria monocytogenes in mice. J. Comp. Pathol McLauchlin J., Greenwood M.H., Pini P.N. (1990): The occurrence of Listeria monocytogenes in cheese from manufacturer associated with a case of listeriosis. Int. J. Food Microbiol ; 10. McLauchlin J., Hall S.M., Velani S.K., Gilbert R.J. (1991): Human listeriosis and pate: a possible association. Br. Med. J ; 11. Mengaud J., Vicente M.-F., Chenevert J. i in.(1988): Expression In Echerichia coli and sequence analysis of the listeriolysin O determinant of Listeria monocytogenes. Infection and Immunity, 56 (4) Paillard D., Dubois V., Duran R. i in. (2003): Rapid Identification of Listeria Species by Using Restriction Fragment Length Polymorphism of PCR-Amplified 23S rrna Gene Fragments. Appl. Environm. Microbiol. 69 (11) Piffaretti J-C., Kressbuch H., Aeschbacher M. in. (1989): Genetic characterisation of clones of the bacterium Listeria monocytogenes causing epidemic disease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA ; 100

11 14. Rocourt J. (1996): Risk factors for listeriosis. Food Control Rodriguez-Lazaro D., Hernandez M. i in. (2004): Quantitative detection of Listeria monocytogenes and Listeria innocua by Real-time PCR: assesment of hly, iap, and lin02483 targets and AmpliFluor technology. Appl. Environm. Microbiol. 70 (3) Sallen B., Rajoharison A.S., Desverenne S. i in. (1996) Comparative analysis of 16S and 23S rrna sequence of Listeria species. Int. J. Syst. Bacteriol ; 17. Vazquez-Boland J.A., Kuhn M., Berche P. i in. (2001): Listeria pathogenesis and molecular virulence determinants. Clinical Microbiol. Rev. 14 (3) Wiedemann M., Bruce L.J., Keating C. i in. (1997): Ribotypes and virulence gene polymorphisms suggest three distinct Listeria monocytogenes lineages with differences in pathogenic potential. Infection and Immunity 65 (7) ; 101