BACTEC PZA Test Medium Culture Vials Middlebrook 7H12 Medium ph 6.0

Transkrypt

1 BACTEC PZA Test Medium Culture Vials Middlebrook 7H12 Medium ph 6.0 PP071JAA MA /06 Polski PRZEZNACZENIE Po ywkê testow¹ PZA BACTEC (bulion Middlebrook 7H12, ph 6,0) opracowano specjalnie do wykonywania badañ wra liwoœci pr¹tka gruÿlicy (Mycobacterium tuberculosis) na pirazynamid (PZA). Przeznaczona jest przede wszystkim do stosowania w aparacie 460TB BACTEC. STRESZCZENIE I OBJAŒNIENIE Technikê radiometryczn¹ BACTEC stosuje siê do badania wra liwoœci drobnoustrojów na podstawowe leki przeciwgruÿlicze (streptomycynê, izoniazyd, ryfampinê i etambutol) 1-4. W tej technice oznacza siê iloœciowo 14 CO 2 wytwarzany przez pr¹tki na drodze metabolizmu substratu wyznakowanego 14 C, obecnego w po ywce 12B BACTEC. Po dodaniu do po ywki œrodka przeciwko drobnoustrojom dochodzi do zahamowania wzrostu izolatów pr¹tków wra liwych na ten œrodek i do zmniejszenia iloœci wytwarzanego 14 CO 2. Butler i wsp. 5 zaproponowali ulepszenie konwencjonalnej metody badania wra liwoœci na PZA, co wymaga zastosowania specjalnej po ywki agarowej 7H10 o ph 5,5. Ograniczeniem tej metody jest to, e przy ph 5,5 wiele izolatów M. tuberculosis nie roœnie wcale lub roœnie s³abo. Po ywki 12B BACTEC nie mo na stosowaæ do badania wra liwoœci na PZA, poniewa lek ten jest aktywny tylko przy ni szych wartoœciach ph 5. Heifets i wsp. sugerowali wykorzystanie do wra liwoœci na PZA metody radiometrycznej z zastosowaniem po ywki 12B BACTEC przy ph 5,5. Metoda ta wymaga³a obni enia ph ka dej fiolki z 6,8 do 5,5 po zapocz¹tkowaniu wzrostu w fiolce 6. Przy ph 5,5 niektóre izolaty nie ros³y w po ywce 12B, chocia ca³kowite wyniki uzyskane w po ywce 12B przy ph 5,5 by³y lepsze ni w po ywce 7H10 w ph 5,5. Potem sugerowano dodanie ó³tka jaja w celu uzyskania lepszego wzrostu pr¹tków 7. Pozwoli³o to uzyskaæ wyniki bardziej nadaj¹ce siê do praktycznego wykorzystania w klinice, jednak stwierdzono, e dodawanie œwie ego ó³tka jaja jest k³opotliwe i nie nadaje siê do rutynowego stosowania w laboratorium klinicznym. Salfinger i Heifets po kolejnych badaniach stwierdzili wzrost MIC PZA wraz ze wzrostem ph po ywki z 5,5 do 6,8 8. Salfinger i wsp., wykorzystuj¹c modyfikacjê wy ej opisanych procedur radiometrycznego badania wra liwoœci, zalecali stosowanie po ywki 12B BACTEC w ph 5,9 6,0 (Po ywka testowa PZA BACTEC) przy stê eniu PZA wy szym ni w konwencjonalnych po ywkach sta³ych (ph 5,5) 9. ZASADY PROCEDURY Po ywka testowa PZA BACTEC jest zmodyfikowan¹ po ywk¹ 7H12 o ph zmniejszonym do 6,0. Przy tym ph mo na oznaczyæ aktywnoœæ PZA przeciwko pr¹tkom bez hamowania wzrostu wiêkszoœci izolatów M. tuberculosis. W celu skompensowania wzrostu ph, w teœcie BACTEC stosuje siê wiêksze stê enie PZA (100 µg/ml), ni w teœcie konwencjonalnym (25 50 µg/ml). Po ywka testowa PZA zawiera substrat wyznakowany 14 C. Pr¹tki, rosn¹c w tej po ywce, metabolizuj¹ wyznakowany substrat i dochodzi do uwalniania 14 CO 2 do atmosfery ponad po ywk¹ w zamkniêtej fiolce. Aparat 460TB BACTEC wykonuje analizy pod k¹tem obecnoœci 14 CO 2, usuwaj¹c gaz z fiolki i przenosz¹c go do elektrometru, gdzie iloœciowa wartoœæ jonizacji przekszta³cana jest na parametr zwany indeksem wzrostu (GI, Growth Index). Prêdkoœæ uwalniania i iloœæ 14 CO 2 wytworzonego w po ywce s¹ wprost proporcjonalne do prêdkoœci i iloœci wzrostu w po ywce. Po dodaniu do po ywki PZA leku przeciwgruÿliczego dochodzi do zahamowania wzrostu podatnych pr¹tków. WskaŸnikiem tego jest zmniejszenie wytwarzania 14 CO 2 w porównaniu z trendem wzrostowym w kontroli. Je eli drobnoustroje s¹ oporne, nie dochodzi do zahamowania wzrostu w fiolce testowej albo zahamowanie to jest niewielkie. ODCZYNNIKI Zawartoœæ* na fiolkê (4 ml) po ywki testowej PZA (koñcowe ph 6,0 ± 0,2): Bulion 7H9... 0,47% (stê enie wagowe) Hydrolizat kazeiny... 0,10% (stê enie wagowe) Abumina surowicy bydlêcej... 0,50% (stê enie wagowe) Katalaza jednostki Substrat 14 C... 4 µci Woda dejonizowana (ml)... 4 q.s. *z odpowiednim dodatkiem, niezbêdnym do osi¹gniêcia kryteriów wydajnoœci. Ostrze enia i œrodki ostro noœci: Do u ytku diagnostycznego in vitro. Produkt zawiera suchy kauczuk naturalny. W próbkach mog¹ byæ obecne drobnoustroje patogenne, takie jak wirusy zapalenia w¹troby i wirus HIV. Przy kontakcie z ka dym materia³em zanieczyszczonym krwi¹ lub innymi p³ynami ustrojowymi nale y przestrzegaæ Uniwersalnych œrodków ostro noœci i zaleceñ obowi¹zuj¹cych w danej instytucji.

2 Procedury nale y prowadziæ w odpowiedniej kabinie bezpieczeñstwa mikrobiologicznego przy w³aœciwej wentylacji pomieszczenia. Inokulowane fiolki nale y badaæ na aparacie 460TB BACTEC zaopatrzonym w kaptur 460TB BACTEC, dostarczaj¹cy powietrza przefiltrowanego HEPA i zapewniaj¹cy ujemne ciœnienie w obszarze testowym aparatu. Przed u yciem ka da fiolka powinna byæ zbadana pod k¹tem œladów zniszczenia, zanieczyszczenia lub przecieku, takich jak œciemnienie, uwypuklenie lub zapadniêcie siê przegrody. NIE U YWAÆ fiolek z cechami zanieczyszczenia. W fiolce z zanieczyszczeniami mo e dojœæ do zwiêkszenia ciœnienia. Zanieczyszczenie fiolki mo e nie byæ ³atwo widoczne. Fiolki z cechami uszkodzenia nale y wyrzuciæ przed inokulacj¹. W rzadkich przypadkach szyjka fiolki mo e byæ pêkniêta i mo e od³amaæ siê podczas zdejmowania pokrywki albo w czasie obs³ugi. Tak e w rzadkich przypadkach fiolka mo e nie byæ zamkniêta wystarczaj¹co szczelnie. W obu takich przypadkach zawartoœæ fiolki mo e wyciekaæ lub rozlaæ siê, zw³aszcza przy odwróceniu fiolki do góry dnem. Jeœli fiolka by³a inokulowana, materia³, który wyciek³ lub rozla³ siê nale y traktowaæ z ostro noœci¹ ze wzglêdu na to, e mo e on zawieraæ patogenne drobnoustroje/czynniki. Przed utylizacj¹ nale y wysterylizowaæ wszystkie inokulowane fiolki w autoklawie. Aby zminimalizowaæ potencjalny wyciek podczas inokulacji próbki do fiolki hodowlanej, nale y u yæ strzykawek z za³o onymi na sta³e ig³ami lub zakoñczeniami Luer-Lok. Zanieczyszczenie Nale y przedsiêwzi¹æ œrodki ostro noœci, aby zapobiec zanieczyszczeniu podczas pobierania i inokulacji do fiolki BACTEC. Zanieczyszczona próbka da odczyt dodatni, co jednak nie oznacza wyniku istotnego klinicznie. Takie zanieczyszczenie mo e wynikaæ z nieprawid³owej konserwacji igie³ i przewodów BACTEC, niedostatecznego oczyszczenia przegrody lub niew³aœciwego dzia³ania jednostki ogrzewaj¹cej ig³ê BACTEC (zob. instrukcjê obs³ugi i konserwacji aparatu). Takie ustalenie musi byæ wykonane przez u ytkownika na podstawie takich czynników jak: typ wykrytych drobnoustrojów, wystêpowanie tego samego drobnoustroju w wielu hodowlach, historia choroby pacjenta, odpowiednie kontrole aparatury itd. Instrukcja przechowywania Fiolki z po ywk¹ testow¹ PZA BACTEC nale y przechowywaæ w ch³odnym (2 25 C), suchym miejscu. Zapisaæ datê wa noœci na zewnêtrznej powierzchni ka dego opakowania i najpierw zu yæ najstarsze zapasy. Dobr¹ praktyk¹ jest segregowanie materia³u radioaktywnego i sk³adowanie go w pomieszczeniu, do którego dostêp maj¹ tylko osoby upowa nione. Pomieszczenie nale y oznaczyæ napisem Uwaga! Materia³y radioaktywne!. Nie wystawiaæ po ywki na bezpoœrednie dzia³anie silnego œwiat³a. Zawsze najpierw badaæ ka d¹ fiolkê na aparacie systemu 460TB BACTEC w celu ustalenia w fiolce atmosfery 5 10% CO 2 i wykluczenia z badañ fiolek z du ym odczytem t³a. Fiolki, w których we wstêpnym badaniu uzyskuje siê wynik GI wynosz¹cy 20 lub wiêcej, nale y wyrzuciæ. PRZYGOTOWANIE PRÓBKI Izolowane czyste hodowle M. tuberculosis nale y bezpoœrednio przed inokulacj¹ wyhodowaæ w po ywce 12B BACTEC i u yæ ich do testu w momencie, gdy znajduj¹ siê w fazie aktywnego wzrostu. Nie stosowaæ starych, zamro onych hodowli ani hodowli, które wykazywa³y szczytowy odczyt GI przez wiêcej ni jeden dzieñ. PROCEDURA Dostarczane materia³y Po ywka testowa PZA BACTEC Materia³y wymagane, ale niedostarczane Zestaw: lek PZA/ciecz do rozprowadzania BACTEC (50 testów) } Po ywka 12B BACTEC Zob. Dostêpnoœæ Aparat 460TB BACTEC Strzykawka tuberkulinowa z ig³¹ przymocowan¹ na sta³e Strzykawka 5 ml Roztwór odka aj¹cy 70% alkohol izopropylowy Przygotowanie po ywki z lekiem a. Liofilizowany PZA dostarcza siê oddzielnie wraz ze specjaln¹ ciecz¹ do jego rozprowadzenia (RF, Reconstituting Fluid). b. Oczyœciæ wierzcho³ek fiolki wacikiem nas¹czonym alkoholem. Aseptycznie dodaæ strzykawk¹ 5 ml RF do fiolki z liofilizowanym PZA. Dok³adnie wymieszaæ. Po ca³kowitym rozpuszczeniu uzyskuje siê roztwór podstawowy 4000 µg PZA/mL. c. Przed inokulacj¹, po oczyszczeniu wierzcho³ka fiolki wacikiem nas¹czonym alkoholem, do ka dej fiolki po ywki PZA dodaæ strzykawk¹ o pojemnoœci 1 ml 0,1 ml roztworu podstawowego PZA. Uzyskuje siê stê enie 100 µg PZA/mL po ywki. Œrodki ostro noœci: Nie rozprowadzaæ PZA w wodzie ani adnym innym rozcieñczalniku poza RF. Objêtoœæ RF mo e byæ ró na. Przy rozprowadzaniu proszku PZA odmierzyæ dok³adnie 5 ml z dostarczonej fiolki. Dodanie w³aœciwej iloœci leku testowego do po ywki ma kluczowe znaczenie dla wydajnoœci testu wra liwoœci. Dodaæ dok³adnie 0,1 ml roztworu podstawowego za pomoc¹ strzykawki tuberkulinowej o pojemnoœci 1 ml. Przygotowanie kontroli Jako kontroli u ywa siê po ywki testowej PZA bez adnego leku. Do fiolki kontrolnej przed inokulacj¹ hodowli dodaæ 0,1 ml RF. RF zawiera substancjê sprzyjaj¹c¹ wzrostowi stearynian polioksoetylenowy (POES). Niezbêdna jest obecnoœæ RF we wszystkich inokulowanych fiolkach. Przygotowanie inokulum Do nastawienia tego testu nale y stosowaæ tylko aktywnie rosn¹ce hodowle. Nie u ywaæ hodowli przeroœniêtych, przechowywanych ani wyhodowanych na innych po ywkach. a. Z hodowli testowej nale y wykonaæ podhodowlê do fiolki z po ywk¹ 12B BACTEC (nr kat ), uzupe³nion¹ 0,1 ml RF na fiolkê. b. Inkubowaæ w temperaturze 37 C ±1 C i badaæ fiolkê codziennie na aparacie 460TB BACTEC. 2

3 c. Gdy dzienny GI osi¹gnie , fiolki u yæ do inokulacji testu wra liwoœci. d. Je eli wartoœæ GI wynosi ponad , do fiolki z pocz¹tkowym wzrostem dodaæ œwie ej po ywki 12B wed³ug poni szej tabeli. W przypadku rozcieñczenia zapisaæ zastosowane rozcieñczenie do póÿniejszego wgl¹du. GI : Bez rozcieñczenia GI : Dodaæ 1,0 ml po ywki 12B GI : Dodaæ 1,5 ml po ywki 12B GI : Dodaæ 2,0 ml po ywki 12B GI : Dodaæ 2,5 ml po ywki 12B GI : Dodaæ 3,5 ml po ywki 12B Przed u yciem dok³adnie zmieszaæ. Nie u ywaæ fiolek z odczytem 999, które przekroczy³y szczytow¹ wartoœæ GI. Inokulacja testu a. Wierzcho³ki wszystkich fiolek do hodowli oczyœciæ wacikiem nas¹czonym 70% alkoholem. b. Dok³adnie wymieszaæ hodowlê testow¹ w po ywce 12B strzykawk¹ tuberkulinow¹ o pojemnoœci 1,0 ml z ig³¹ zamocowan¹ na sta³e. c. Dodaæ 0,1 ml tego inokulum do fiolki kontrolnej i fiolki z PZA. DO KONTROLI NIE ROZCIEÑCZAÆ HODOWLI, tak jak siê to zaleca w przypadku innych leków (takich jak izoniazyd, streptomycyna, etambutol, ryfampina itd.). d. Wierzcho³ek gumowej przegrody odkaziæ odpowiednim œrodkiem odka aj¹cym i nastêpnie oczyœciæ wacikiem nas¹czonym 70% alkoholem. UWAGA: Przy wykonywaniu testu nale y zachowaæ ostro noœæ. Przegrody fiolek mog¹ byæ zanieczyszczone drobnoustrojami z hodowli. Inkubacja i badanie a. Wszystkie inokulowane fiolki (w tym fiolki kontrolne) nale y badaæ w aparacie 460TB BACTEC przed inkubacj¹ w celu uzyskania atmosfery 5% CO 2. Je eli nie zrobiono tego wczeœniej, fiolki mo na badaæ bezpoœrednio przed inokulacj¹. b. Fiolki inkubowaæ w temperaturze 37 C ±1 C. c. Fiolki z PZA i fiolki kontrolne badaæ codziennie na aparacie 460TB BACTEC do momentu, a GI fiolki kontrolnej osi¹gnie co najmniej 200. Kontrola jakoœci NIE U YWAÆ fiolek hodowlanych po up³ywie ich daty wa noœci. Nie u ywaæ fiolek wykazuj¹cych pêkniêcia lub defekty. Fiolki odpowiednio utylizowaæ. Informacje na temat kontroli jakoœci aparatu 460TB BACTEC mo na znaleÿæ w instrukcji obs³ugi i konserwacji aparatów 460TB i 460 BACTEC. Podobnie jak w przypadku wszystkich badañ wra liwoœci na lek, kluczowe znaczenie ma jakoœæ inokulum. U ywaæ tylko hodowli wykazuj¹cych aktywny wzrost w po ywce 12B przy odpowiednim rozcieñczeniu. W warunkach idealnych próbka kontrolna powinna osi¹gaæ GI 200 w czasie 4 7 dni. Je eli osi¹gnie wartoœæ GI 200 w czasie krótszym ni 4 dni, oznacza to, e obci¹ enie danym inokulum. Je eli wyniki nie s¹ ewidentne, badanie nale y powtórzyæ. Je eli kontrola osi¹ga wartoœæ GI 200 w czasie d³u szym ni 7 10 dni, wskazuje to na s³ab¹ jakoœæ inokulum (np. ma³¹ ywotnoœæ, nisk¹ pocz¹tkow¹ wartoœæ GI inokulum lub niew³aœciwe rozcieñczenie) i wyniki mog¹ byæ b³êdne. Nale y obserwowaæ GI w kontroli i w fiolkach z lekiem do uzyskania ewidentnych wyników. W przypadku w¹tpliwoœci badanie powtórzyæ. Je eli GI w fiolce z lekiem zbli a siê do 10% wartoœci dla kontroli, fiolki badaæ przez dodatkowe 1 3 dni. U³atwia to ocenê wzorca wra liwoœci hodowli badanej. Je eli wyniki nie nadaj¹ siê do interpretacji, badanie powtórzyæ z izolatem hodowanym w œwie ej po ywce 12B BACTEC (nr kat ). Zawsze u ywaæ jako kontroli wra liwej H37Rv (ATCC 27294), a jako kontroli opornej H37Rv PZA-R (ATCC 35828). Nale y stosowaæ siê do wymogów kontroli jakoœci zgodnie z obowi¹zuj¹cymi przepisami miejscowymi, krajowymi i (lub) federalnymi, wymaganiami narzucanymi przez instytucje nadaj¹ce certyfikaty i do rutynowych procedur kontroli jakoœci danego laboratorium. U ytkownikowi zaleca siê zapoznanie siê z odpowiednimi zaleceniami NCCLS i przepisami CLIA w zakresie odpowiednich procedur kontroli jakoœci. INTERPRETACJA WYNIKÓW Aparat dostarcza odczytów bezpoœrednio w skali indeksu wzrostu od 0 do 999. Indeks wzrostu jest w istocie miar¹ aktywnoœci metabolicznej drobnoustrojów w po ywce. Gdy GI w fiolce kontrolnej osi¹ga 200 lub wiêcej, wyniki interpretowaæ nastêpuj¹co: GI w fiolce z lekiem < 9% GI w fiolce kontrolnej = Wra liwe GI w fiolce z lekiem > 11% GI w fiolce kontrolnej = Oporne GI w fiolce z lekiem wynosi od 9% do 11% (w³¹cznie) GI w fiolce kontrolnej = Wartoœæ graniczna OGRANICZENIA PROCEDURY Indeks wzrostu odzwierciedla prêdkoœæ i iloœciow¹ wartoœæ wzrostu w po ywce, nie mo na go jednak stosowaæ do iloœciowej oceny jednostek tworz¹cych kolonie na ml. Morfologia kolonii oraz pigmentacja mo e byæ wykrywana tylko na po ywkach sta³ych. Jako przybli on¹ ocenê opornoœci lub wra liwoœci nale y przyj¹æ margines 10% oparty na uzyskanym GI. Badanie wra liwoœci na PZA BACTEC zaleca siê stosowaæ tylko do izolatów kompleksów M. tuberculosis. U ytecznoœæ PZA i tej metody badania wra liwoœci w odniesieniu do pr¹tków innych ni pr¹tek gruÿlicy (MOTT) nie jest znana. WARTOŒCI OCZEKIWANE W fiolce kontrolnej powinno dochodziæ do stopniowego wzrostu GI. W fiolce badanej GI mo e pozostawaæ na tym samym poziomie, rosn¹æ lub maleæ, w zale noœci od wra liwoœci drobnoustrojów (zob. przyk³ady 1 i 2). Wyniki BACTEC uzyskuje siê zwykle w ci¹gu 4 7 dni. Hodowle wolno rosn¹ce mog¹ niekiedy wymagaæ d³u szego czasu. Wyników nie nale y interpretowaæ przed up³ywem 4 dni ani po up³ywie ponad 21 dni. 3

4 Przyk³ad 1: Wra liwoœæ na PZA Codzienne odczyty GI GI (lek) GI (kontrola) w % Wyniki: Kontrola x 100 = 0,8% Wra liwe Lek < 9% 475 Przyk³ad 2: Opornoœæ na PZA codzienne odczyty GI Codzienne odczyty GI GI (lek) GI (kontrola) w % Wyniki: Kontrola x 100 = 86,5% Oporne Lek > 11% 282 CHARAKTERYSTYKA WYDAJNOŒCIOWA Technika radiometryczna 460TB BACTEC na bazie zmodyfikowanej po ywki 7H12 w ph 6,0 jest obecnie jedyn¹ hodowlan¹ metod¹ badania wra liwoœci na PZA i jest zalecana przez amerykañsk¹ komisjê ds. Klinicznych Standardów Laboratoryjnych (NCCLS, National Committee for Clinical Laboratory Standards) 14,15. W badaniu Pfyffer i wsp. w testach wra liwoœci M. tuberculosis na PZA uzyskano zgodnoœæ ponad 96% przy porównywaniu po ywki PZA 460TB BACTEC i leku z po ywk¹ PZA MGIT 960 BACTEC i lekiem. Œredni czas konieczny do uzyskania wyniku dla testu PZA 460TB BACTEC wynosi³ 5,4 dnia, bez uwzglêdnienia czasu do uzyskania podhodowli radiometrycznej o indeksie wzrostu (GI) równym Dostêpnoœæ Nr kat. Opis Fiolki do hodowli z po ywk¹ do badañ PZA BACTEC, 4 ml, opakowania po Zestawy z lekiem PZA/ciecz¹ do jego rozprowadzania BACTEC (50 testów) Po ywka 12B BACTEC Aparat 460TB BACTEC Piœmiennictwo 1. Gross, W. M. and J.L. Hawkins, Radiometric selective inhibition test for differentiation of Mycobacterium tuberculosis, Mycobacteria bovis, and other mycobacteria. J. Clin. Microbiol., 21: Middlebrook, G. et al Automatable radiometric detection of growth of Mycobacterium tuberculosis in selective media. Amer. Rev. Resp. Dis. 115: Roberts, G.D. et al. Evaluation of the BACTEC radiometric method for recover of mycobacteria and drug susceptibility testing of M. tuberculosis from acid-fast smear positive specimens. J. Clin. Microbiol. 18: Siddiqi, S.H. et al Evaluation of a rapid radiometric method for drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis. J. Clin. Microbiol. 13: Butler, W.R. and J.O. Kiburn Improved method for testing susceptibility of Mycobacterium tuberculosis to pyrazinamide. J. Clin. Microbiol. 16: Heifets, L.B. and M. D. Iseman, Radiometric method for testing susceptibility of mycobacteria to pyrazinamide in 7H12 broth. J. Clin. Microbiol. 21: Woodley, C.L. and R. W. Smithwick, Radiometric method for pyrazinamide susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis in egg yolk enriched BACTEC 12B medium. Antimicrob. Agents Chemother. 32: Salfinger, M. and L. Heifets, Determination of pyrazinamide MICs for Mycobacterium tuberculosis at different ph s by the radiometric method. Antimicrob. Agents Chemother. 32: Salfinger, M. et al Rapid radiometric method for pyrazinamide susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis. Res. Microbiol. 140: National Committee for Clinical Laboratory Standards Approved Guideline M29-A2. Protection of laboratory workers from occupationally acquired infections, 2nd ed. NCCLS, Wayne, PA. 11. Garner, J.S Hospital Infection Control Practices Advisory Committee, U.S. Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention. Guideline for isolation precautions in hospitals. Infect. Control Hospital Epidemiol. 17: U.S. Department of Health and Human Services Biosafety in microbiological and biomedical laboratories, HHS Publication (CDC), 4th ed. U.S. Government Printing Office, Washington, D.C. 13. Directive 2000/54/EC of the European Parliament and of the Council of 18 September 2000 on the protection of workers from risks related to exposure to biological agents at work (seventh individual directive within the meaning of Article 16(1) of Directive 89/391/EEC). Official Journal L262, 17/10/2000, p Pfyffer, G.E., F. Palicova and S. Rüsch-Gerdes Testing susceptibility of Mycobacterium tuberculosis to pyrazinamide with the nonradiometric BACTEC MGIT 960 System. J. Clin. Microbiol. 40: National Committee for Clinical Laboratory Standards Tentative standard M24-T2. Susceptibility testing of mycobacteria, nocardia and other aerobic actinomycetes, 2nd ed. NCCLS, Wayne, PA. 4

5 5

6 Becton, Dickinson and Company 7 Loveton Circle Sparks, Maryland USA BENEX Limited Bay K 1a/d, Shannon Industrial Estate Shannon, County Clare, Ireland Tel: Fax: ATCC is a trademark of the American Type Culture Collection. BD, BD Logo, BACTEC, Luer-Lok and MGIT are trademarks of Becton, Dickinson and Company BD.