Kalceina. Komunikacja międzykomórkowa między biologią a cytochemią. Jarosław Czyż

Transkrypt

1 Kalceina Komunikacja międzykomórkowa między biologią a cytochemią Jarosław Czyż Zakład Biologii Komórki, Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii UJ jarek.czyz@uj.ed.pl

2

3 Złącza szczelinowe i koneksony - budowa Jednostka strukturalna - koneksyna Koneksyny stanowią dużą konserwatywną rodzinę (wykazują homologię pod względem sekwencji aminokwasowej w 60%). Geny kodujące różne rodzaje koneksyn znajdują się na kilku chromosomach W jej skład wchodzi przynajmniej 20 konserwatywnych ewolucyjnie rodzajów białek, które zaklasyfikowano do różnych grup i nazwano według ich mas cząsteczkowych ( kda) Białka te w środowisku lipidowym spontanicznie formują heksamery (koneksony) W jednej komórce możliwa jest ekspresja kilku różnych rodzajów koneksyn, również w obrębie jednego koneksonu mogą występować różne koneksyny Koneksyny obecne są u kręgowców. U bezkręgowców występują ineksyny

4 E1 1 2 Budowa i funkcje złącz NH 3 + szczelinowych - tworzenie kanałów łączących przedziały cytoplazmatyczne sąsiednich komórek E2 3 4 COO _ - międzykomórkowa bierna wymiana dobnocząsteczkowych metabolitów o masie poniżej 1.5 kda Konekson (Eckert &Huelser, zmienione) Kanały łączące przedziały cytoplazmatyczne sąsiednich komórek 4

5 Tkankowo-specyficzne funkcje złącz szczelinowych Sprzężenie elektryczne; np. w miokardium, układzie nerwowym i innych tkankach pobudliwych Serce Koneksyna Cx40 Cx43 Cx45 Funkcja - międzykomórkowy transfer jonów wapnia -synchronizacja aktywności skurczowej kardiomiocytów Układ nerwowy Cx32 Cx37 Cx43 - przewodnictwo nerwowe - wewnątrzcytoplazmatyczny transfer metabolitów w komórkach Schwanna Sprzężenie metaboliczne; np. wątroba i inne tkanki niepobudliwe Np. wątroba i trzustka Cx32 Cx36 - synchronizacja wydzielania insuliny przez komórki β trzustki - synchronizacja sekrecji glukozy przez hepatocyty

6 Czynniki determinujące funkcje złącz szczelinowych: - poziom I zależny od typu i lokalizacji koneksyny w danej komórce - poziom ekspresji danej koneksyny - typ koneksyny budującej złącze i kompatybilność koneksonów zbudowanych z różnych koneksyn - selektywność kanałów złącz szczelinowych - transport do błony i wewnątrzkomórkowa lokalizacja koneksyn - poziom II zależny od zewnętrznych regulatorów funkcji złącz szczelinowych - regulatory przepuszczalności kanałów złącz szczelinowych np. ph, stężenie wewnątrzkomórkowego wapnia - aktywność szlaków sygnałowych determinujących przepuszczalność kanałów poprzez zmiany poziomu fosforylacji koneksyn -stabilizacja złącz przez białka adhezji międzykomórkowej - stabilizacja mechaniczna

7 Skład koneksonów decyduje o funkcji złącz jako specyficznych mediatorów międzykomórkowej wymiany informacji Laird, 2007 Złącza szczelinowe wykazują selektywność dla cząsteczek, która zależy od składu koneksonów

8 Selektywność złącz szczelinowych zbudowanych z Cx32 Goldberg et al., 2002 Wniosek: złącza szczelinowe zbudowane z Cx32 wykazują selektywną przepuszczalność dla cząsteczek o ładunku dodatnim

9 Ekspresja różnych izoform koneksyn w komórkach sugeruje rolę interakcji między nimi w determinowaniu funkcji koneksonów i złącz szczelinowych homomeryczne heteromeryczne - ze względu na budowę koneksonów -ze względu na budowę kanałów homotypowe heterotypowe heterotypowe-heteromeryczne

10 Saez et al., 2003 Obrót koneksyn

11 Kompleksy białkowe towarzyszące złączom szczelinowym Winkulina Mikrotubule kateniny N-kadheryna Szlak Wnt Wei et al., 2004 Białka związane z kompleksem powierzchniowym decydują zarówno o ekspresji, jak i o funkcji złącz szczelinowych

12 Czynniki determinujące funkcje złącz szczelinowych: - poziom I zależny od typu i lokalizacji koneksyny w danej komórce - typ koneksyny budującej złącze i kompatybilność koneksonów zbudowanych z różnych koneksyn - selektywność kanałów złącz szczelinowych - poziom ekspresji danej koneksyny - transport do błony i wewnątrzkomórkowa lokalizacja koneksyn - poziom II zależny od zewnętrznych regulatorów funkcji złącz szczelinowych - regulatory przepuszczalności kanałów złącz szczelinowych np. ph, stężenie wewnątrzkomórkowego wapnia - aktywność szlaków sygnałowych determinujących przepuszczalność kanałów poprzez zmiany poziomu fosforylacji koneksyn -stabilizacja złącz przez białka adhezji międzykomórkowej - stabilizacja mechaniczna

13 Zmiany stężenia jonów wpływają na przepuszczalność kanałów złącz szczelinowych Niskie Ca ++ Wysokie Ca ++ Sens ochrona komórek przed szokiem wapniowym wynikającym z napływu jonów wapnia do uszkodzonej sąsiedniej komórki Właściwość ta służy utrzymaniu homeostazy wapniowej w tkankach

14 Szlaki sygnałowe warunkujące bramkowanie kanałów złącz szczelinowych closed Kniga p. 47 Różnorodne szlaki sygnałowe wpływają na intensywność komunikacji międzykomórkowej za pośrednictwem złącz szczelinowych w sposób zależny od przewodnictwa kanałów

15 Kategorie składników kompleksu powierzchniowego regulujących funkcje złącz szczelinowych 1. Białka sygnałowe 2. Białka strukturalne Laird, 2005

16 Choroby związane z dysfunkcją złącz szczelinowych - Mutacje genu kodującego Cx37 wywołują niepłodność samic myszy, co wynika z roli Cx37 w komunikacji międzykomórkowej między oocytami, a komórkami granulosa - Zahamowanie funkcji genu kodującego Cx40 prowadzi do arytmii pracy mięśnia sercowego, poprzez upośledzenie przewodzenia bodźców elektrycznych między przedsionkami a komorami - Zahamowanie funkcji genu kodującego Cx43 wywołuje wady rozwojowe mięśnia sercowego, najprawdopodobniej wynikające ze zmian aktywności migracyjnej komórek grzebienia neuralnego - Spadek ekspresji Cx32 upośledza koordynację sekrecji glukozy przez hepatocyty wywołanej bodźcem elektrycznym, a także znacznie zwiększa ryzyko rozwoju nowotworów wątroby - Mutacje genu kodującego Cx26 wywołują głuchotę, prawdopodobnie poprzez upośledzenie międzykomórkowego transferu jonów potasu w obrębie ucha wewnętrznego 16

17 Funkcja Cx32 w determinowaniu wewnątrzkomórkowego transferu metabolitów w obrębie komórek Schwanna Mutacje genu kodującego Cx32 (stwierdzono przynajmniej 90 ich typów!), wywołują u człowieka chorobę Charcot-Marie-Tooth (CMTX), polegającą na postępowej degeneracji nerwów peryferycznych, wynikającej z upośledzonej komunikacji między fałdami komórek Schwanna Xu, COCB 2004

18 Funkcja niszy czyli mikrośrodowiska komórek w transformacji nowotworowej Mediatory wymiany informacji między komórką a niszą wspomagające transformację nowotworową: Neo - zaburzenia funkcji endo- i egzogennych czynników humoralnych oddziaływania krynne - modyfikacje składu macierzy międzykomórkowej oraz ekspresji receptorów adhezji komórkowej, np. integryn i kadheryn - zmiany równowagi mechanochemicznej w obrębie niszy, prowadzące do zaburzeń wymiany bodźców mechanicznych między komórka a jej mikrośrodowiskiem Czyz J., Wobus A.M. Differentiation (2001) 68: deregulacja bezpośredniej wymiany metabolitów za pośrednictwem złącz szczelinowych

19 Involvement of gap junctional coupling in tumorigenesis Stages of tumorigenesis -Neoplasia (initiation) -Promotion -Progression invasion/metastasis Tranfected connexin Breast Carcinoma Cx26/Cx43 Reduced growth in vitro/in vivo (Hirschi et al ) Cervical adenocarcinoma (HeLa) Cx43 Reduced anchorage-independent growth (King et al.., 2000) Glioblastoma (U251T98G) Cx43 Decreased cell proliferation in vitro (Huang et al ) Hepatoma (SKHep1) Cx32 Retarded tumorigenicity (Eghbali et al.., 1991) Lung carcinoma (PG) Cx43 Reduced growth rate (Zhang et al.., 1998) Melanomas (UACC903) Cx43 Anchorage-dependent growth (Su et al.., 2000) Prostate cancer (LNCaP) Cx32/Cx43 Inhibited growth (Mehta et al.., 1999) 19

20 Rola złącz szczelinowych w rozwoju nowotworów Efekt hamujący : 1. Spadek ekspresji koneksyn obserwowany jest na wczesnych etapach rozwoju nowotworów. 2. Re-ekspresja koneksyn w komórkach transformowanych przynajmniej częściowo przywraca fenotyp charakterystyczny dla komórek prawidłowych. 3. Koneksyny wpływają na aktywność szlaków sygnałowych zależnych od cyklin, w sposób niezależny od komunikacji międzykomórkowej Efekt promujący: 1. Wiele linii komórek nowotworowych cechuje wysoki poziom ekspresji koneksyn i wysoka intensywność komunikacji międzykomórkowej za pośrednictwem złącz szczelinowych (Trosko, 2002) 20

21 Zmutowane somatyczne komórki macierzyste jako źródło nowotworów Inicjacja nowotworu Rozwój guza pierwotnego Czynniki inicjujące Zaburzenia proporcji między podziałem Mutacje genów regulatorowych symetrycznym i asymetrycznym Inwazyjna komórka macierzysta Możliwe cechy odpowiedzialne za inwazyjność komórek nowotworowych: - Ruchliwość - Cechy reologiczne - Aktywność enzymów proteolitycznych - Ekspresja białek adhezji - Ekspresja koneksyn - Reaktywność na chemoatraktanty Guz wtórny

22 Rola złącz szczelinowych w rozwoju nowotworów-rozwinięcie Wiele linii komórek nowotworowych cechuje wysoki poziom ekspresji koneksyn i wysoka intensywność komunikacji międzykomórkowej za pośrednictwem złącz szczelinowych Efekt promujący: Czyż,

23 Konkluzja: 23 Trosko, 2001

24 Techniki wizualizacji struktury i funkcji złącz szczelinowych

25 Huelser, 2000 Wizualizacja budowy i składu złącz szczelinowych przy pomocy mikroskopii elektronowej

26 Wizualizacja złącz szczelinowych - immunocytochemia Daniel et al., 2008 Melanoma B16 DNA Cx43

27 Zastosowanie GFP w wizualizacji koneksyn Cx43-GFP Merge Pameleaire, 2005

28 Kalceina Techniki analizy intensywności komunikacji międzykomórkowej za pośrednictwem złącz szczelinowych

29 1. Techniki elektrofizjologiczne 2. Pomiar międzykomórkowego przepływu jonów wapnia Paemeleire et al

30 Mikroiniekcja Wybraną komórkę nastrzykuje się barwnikiem a następnie obserwuje się tempo jego rozchodzenia do komórek sąsiednich

31 Scrape-loading Komórki uszkadza się, aby przez uszkodzoną błonę przeszedł barwnik fluorescencyjny, który następnie przenika do sąsiednich komórek przez złącza szczelinowe. Tempo rozchodzenia się barwnika jest miarą funkcji złącz szczelinowych w badanej populacji

32 Xie, 2007 Gap-FRAP

33 Techniki analizy komunikacji międzykomórkowej za pośrednictwem złącz szczelinowych 1. Analizy elektrofizjologiczne (np. patch-clump) 2. Analizy oparte na pomiarach intensywności międzykomórkowego transferu cząsteczek np.: - metabolitów znakowanych izotopami promieniotwórczymi (np. C 14 -glukoza, jony wapnia) - barwników fluorescencyjnych: Techniki wprowadzania barwników fluorescencyjnych do komórki: - mikroinjekcja - elektroperforacja - dye-loading DiI Calcein Donor cell Czyż et al., Exp. Cell Res. (2000),255: h

34 Jakościowa analiza intensywności komunikacji międzykomórkowej za pośrednictwem złącz szczelinowych techniką wizualizacji międzykomórkowego transferu kalceiny Czyz et al., 2000

35 Ilościowa analiza intensywności komunikacji międzykomórkowej za pośrednictwem złącz szczelinowych techniką pomiaru międzykomórkowego transferu kalceiny z wykorzystaniem cytometrii przepływowej DiI Calcein Donor cell 2h Analiza funkcji złącz szczelinowych oparta na wykorzystaniu kalceiny w połączeniu z kwantyfikacją transferu barwnika za pomocą cytometrii przepływowej stanowi alternatywę dla innych technik np. mikroiniekcji fluorochromu, co przede wszystkim wynika z możliwości zobiektywizowanej analizy międzykomórkowej komunikacji w układach heterotypowych i heterologicznych. Czyż et al., 2000

36 Ilościowa analiza intensywności komunikacji międzykomórkowej za pośrednictwem złącz szczelinowych z wykorzystaniem cytometrii przepływowej C r = N green /N red Wykorzystanie cytometrii przepływowej umożliwia zobiektywizowaną analizę funkcji złącz szczelinowych w populacjach komórek prawidłowych i nowotworowych BICR/M1R k Cx43 RIN 3T3/SV40 HeLa Cx43 Hela Cx40 HeLa Czyż et al., Exp. Cell Res. (2000),255:40-46

37 Analiza wpływu apigeniny na fizjologię komórek nowotworowych Aktywność fizjologiczna: - zmiatacz wolnych rodników - antyutleniacz - inhibitor kinaz białkowych Reaktywność komórek na apigeninę: - Apoptoza - Zahamowanie proliferacji - Indukcja funkcji złącz szczelinowych 1) Czy i w jaki sposób międzykomórkowa wymiana metabolitów wpływa na reaktywność komórek na apigeninę?

38 Analiza wpływu Cx43 na wrażliwość komórek linii HeLa na działanie apigeniny z wykorzystaniem cytometrii przepływowej Hela wt Control 10 µm Api 30 µm Api 50 µm Api G 1-36% S - 33% G 2-31% Apo - 0.5% A G 1-55% S - 22% G 2-23% Apo - 2.4% 250 B C D 125 G 1-47% S - 19% G 2-34% Apo - 23% G 1-42% S - 18% G 2-40% Apo - 44% Hela Cx G 1-50% S - 31% G 2-19% Apo - 0,6% E F G H 200 G 1-63% S - 19% G 2-18% Apo - 6,1% G 1-50% S - 18% G 2-32% Apo - 43% G 1-39% S - 23% G 2-38% Apo - 61% by-stander effect

39 Podsumowanie Klasyfikacja technik analizy GJIC 1. Techniki wizualizacji koneksyn i składu złącz szczelinowych 2. Metody analizy intensywności komunikacji międzykomórkowej za pośrednictwem złącz szczelinowych 3. Metody analizy selektywności złącz szczelinowych GJIC- gap junctional intercellular coupling Ruetz&Huelser, 2001 Goldberg, 2003