Kategorie składników kompleksu powierzchniowego regulujących funkcje złącz szczelinowych. 1. Białka sygnałowe 2. Białka strukturalne

Transkrypt

1 Kategorie składników kompleksu powierzchniowego regulujących funkcje złącz szczelinowych 1. Białka sygnałowe 2. Białka strukturalne Laird, 2005

2 Choroby związane z dysfunkcją złącz szczelinowych - Mutacje genu kodującego Cx37 wywołują niepłodność samic myszy, co wynika z roli Cx37 w komunikacji międzykomórkowej między oocytami, a komórkami granulosa - Zahamowanie funkcji genu kodującego Cx40 prowadzi do arytmii pracy mięśnia sercowego, poprzez upośledzenie przewodzenia bodźców elektrycznych między przedsionkami a komorami - Zahamowanie funkcji genu kodującego Cx43 wywołuje wady rozwojowe mięśnia sercowego, najprawdopodobniej wynikające ze zmian aktywności migracyjnej komórek grzebienia neuralnego - Spadek ekspresji Cx32 upośledza koordynację sekrecji glukozy przez hepatocyty wywołanej bodźcem elektrycznym, a także znacznie zwiększa ryzyko rozwoju nowotworów wątroby - Mutacje genu kodującego Cx26 wywołują głuchotę, prawdopodobnie poprzez upośledzenie międzykomórkowego transferu jonów potasu w obrębie ucha wewnętrznego 2

3 Funkcja Cx32 w determinowaniu wewnątrzkomórkowego transferu metabolitów w obrębie komórek Schwanna Mutacje genu kodującego Cx32 (stwierdzono przynajmniej 90 ich typów!), wywołują u człowieka chorobę Charcot-Marie-Tooth (CMTX), polegającą na postępowej degeneracji nerwów peryferycznych, wynikającej z upośledzonej komunikacji między fałdami komórek Schwanna Xu, COCB 2004

4 Funkcja Niszy czyli mikrośrodowiska komórek w transformacji nowotworowej Mediatory wymiany informacji między komórką a niszą wspomagające transformację nowotworową: Neo - zaburzenia funkcji endo- i egzogennych czynników humoralnych oddziaływania krynne - modyfikacje składu macierzy międzykomórkowej oraz ekspresji receptorów adhezji komórkowej, np. integryn i kadheryn - zmiany równowagi mechanochemicznej w obrębie niszy, prowadzące do zaburzeń wymiany bodźców mechanicznych między komórka a jej mikrośrodowiskiem Czyz J., Wobus A.M. Differentiation (2001) 68: deregulacja bezpośredniej wymiany metabolitów za pośrednictwem złącz szczelinowych

5 Cechy komórek nowotworowych Wykazują niekontrolowany wzrost, co objawia się: brakiem zahamowania kontaktowego proliferacji oraz; zależności wzrostu od przyczepienia się do podłoża nie podlegają one także anoikis; Wiele z nich wykazuje spadek ekspresji koneksyn w porównaniu z komórkami tkanki z ktorej pochodzą, co w powiązaniu z faktem, iż wyciszenie ekspresji koneksyn np. Cx32 u myszy powoduje wzrost podatności na kancerogenezę chemiczną sugeruje, że rozmowa między komórkami decyduje o socjalizacji ich zachowań - by-stander effect 5

6 Wpływ aktywności kinaz białkowych na obrót koneksyn Lampe & Lau, 2004, IJBCB 36: 1171 Kinazy białkowe fosforylując Cx43 wpływają na przebieg poszczególnych etapów cyklu życiowego tego białka

7 Fosforylacja Cx43 (Ser262) przez PKC skutkuje zahamowaniem komunikacji międzykomórkowej w sposób zależny od kontekstu komórkowego Sroka et al., 2008 Konkluzja: zmiany poziomu fosforylacji koneksyn wpływają na przepuszczalność złącz szczelinowych

8 Różnice w intensywności GJIC między komórkami prawidłowymi i nowotworowymi Mikroiniekcja wybraną komórkę nastrzykuje się barwnikiem a następnie obserwuje się tempo jego rozchodzenia do komórek sąsiednich

9 Korelacja między ekspresją koneksyn a potencjałem proliferacyjnym komórek nowotworowych - Inicjacja - Promocja - Progresja inwazja/tworzenie przerzutów Tranfected connexin Rak sutka Cx26/Cx43 Przyhamowany wzrost in vitro/in vivo (Hirschi et al ) Rak szyjki macicy (HeLa) Cx43 Zahamowanie wzrostu niezależnego od przyczepienia (King et al., 2000) Glioblastoma (U251T98G) Cx43 Zahamowana proliferacja in vitro (Huang et al. 1998) Hepatoma (SKHep1) Cx32 Przyhamowana zdolność do tworzenia guzów (Eghbali et al., 1991) Lung carcinoma (PG) Cx43 Zahamowana proliferacja in vitro (Zhang et al., 1998) Melanomas (UACC903) Cx43 Wzrost zależny od przyczepienia (Su et al., 2000) Prostate cancer (LNCaP) Cx32/Cx43 Zahamowanie wzrostu (Mehta et al.., 1999) 9

10 Pierwotna funkcja złącz szczelinowych w rozwoju nowotworów 1. Zahamowanie funkcji złącz szczelinowych promuje rozwój choroby nowotworowej (Yamasaki, 1999, Loevenstein 1991) 2. Re-ekspresja koneksyn(y) prowadzi do choćby częściowej odbudowy fenotypu charakterystycznego dla komórek prawidłowych Mechanizmy: Oddziaływania koneksyn z elementami regulującymi cykl komórkowy Efekt sąsiedztwa 10

11 Efekt sąsiedztwa bystander effect HeLa wt G 1-36% S - 33% G 2-31% Apo - 0.5% A G 1-55% S - 22% G 2-23% Apo - 2.4% 250 B C D 125 G 1-47% S - 19% G 2-34% Apo - 23% G 1-42% S - 18% G 2-40% Apo - 44% HeLa Cx G 1-50% S - 31% G 2-19% Apo - 0,6% E F G H 200 G 1-63% S - 19% G 2-18% Apo - 6,1% G 1-50% S - 18% G 2-32% Apo - 43% G 1-39% S - 23% G 2-38% Apo - 61%

12 Proliferacja i cytoszkielet komórek prawidłowych i nowotworowych CHF MLL B16 XC Neo Norm Czyz et al.,

13 Point of no return Przejście G1/S Aktywacja ścieżki MAP przez czynniki wzrostowe umożliwia przejście G1/S Ale czy tylko?

14 Schemat regulacji cyklu komórkowego Funkcja białka skp2 skp2 fosforylując białko p27 umożliwia jego degradację, co z kolei zwalnia blokadę dla przejścia G1/S Nature 2005

15 Wpływ wariantów Cx43 na proliferację komórek i poziom ekspresji skp2 Zhang et al., 2003 Wniosek: Cx43 może synergistycznie wpływać na proliferację komórek w sposób zależny i niezależny od GJIC Zhang et al., 2003

16 Funkcja złącz szczelinowych w rozwoju nowotworów W początkowych etapach nowotworzenia (inicjacja, propagacja) zahamowanie połączeń za pomocą złącz szczelinowych uwalnia komórki spod reżimu mikrośrodowiska a to wspomaga transformację nowotworową 16

17 Rola złącz szczelinowych w rozwoju nowotworów Efekt hamujący : 1. Spadek ekspresji koneksyn obserwowany jest na wczesnych etapach rozwoju nowotworów. 2. Re-ekspresja koneksyn w komórkach transformowanych przynajmniej częściowo przywraca fenotyp charakterystyczny dla komórek prawidłowych. 3. Koneksyny wpływają na aktywność szlaków sygnałowych zależnych od cyklin, w sposób niezależny od komunikacji międzykomórkowej Efekt promujący: 1. Wiele linii komórek nowotworowych cechuje wysoki poziom ekspresji koneksyn i wysoka intensywność komunikacji międzykomórkowej za pośrednictwem złącz szczelinowych (Trosko, 2002) 17

18 Rola złącz szczelinowych w rozwoju nowotworów-rozwinięcie Wiele linii komórek nowotworowych cechuje wysoki poziom ekspresji koneksyn i wysoka intensywność komunikacji międzykomórkowej za pośrednictwem złącz szczelinowych Efekt promujący: Czyż,

19 Aby komunikacja za pośrednictwem złącz szczelinowych mogła w ogóle zaistnieć potrzebna jest fizyczna obecność kompatybilnych koneksonów w błonach sąsiednich komórek Komórki B16 Daniel et al., 2008 DNA Cx43

20 Jakościowa analiza intensywności komunikacji międzykomórkowej za pośrednictwem złącz szczelinowych techniką wizualizacji międzykomórkowego transferu kalceiny

21 Ilościowa analiza intensywności komunikacji międzykomórkowej za pośrednictwem złącz szczelinowych techniką pomiaru międzykomórkowego transferu kalceiny z wykorzystaniem cytometrii przepływowej DiI Calcein Donor cell 2h Analiza funkcji złącz szczelinowych oparta na wykorzystaniu kalceiny w połączeniu z kwantyfikacją transferu barwnika za pomocą cytometrii przepływowej stanowi alternatywę dla innych technik np. mikroiniekcji fluorochromu, co przede wszystkim wynika z możliwości zobiektywizowanej analizy międzykomórkowej komunikacji w układach heterotypowych i heterologicznych. Czyż et al., 2000

22 Ilościowa analiza intensywności komunikacji międzykomórkowej za pośrednictwem złącz szczelinowych z wykorzystaniem cytometrii przepływowej C r = N green /N red Wykorzystanie cytometrii przepływowej umożliwia zobiektywizowaną analizę funkcji złącz szczelinowych w populacjach komórek prawidłowych i nowotworowych BICR/M1R k Cx43 RIN 3T3/SV40 HeLa Cx43 Hela Cx40 HeLa Czyż et al., Exp. Cell Res. (2000),255:40-46

23 Analiza potencjału metastatycznego i proliferacji szczepów linii HeLa różniących się ekspresją Cx43 HeLa Cx wt G 1-36% S - 33% G 2-31% Apo - 0.5% Cx43 G 1-50% S - 31% G 2-19% Apo - 0,6% HeLa wt 0 0 N C 10 5 HeLa wt HeLa Cx Time/h wt Cx43 HeLa wt HeLa Cx43 Czyz J., Madeja Z., Irmer U., Korohoda W., Huelser D.F. Int. J. Cancer. (2005), 114:

24 Kaskada metastatyczna w raku prostaty EMT: przejście epitelialnomezenchymalne - zmiany morfologii -aktywacja Snail - zmiany ekspresji genów (E-kadheryna-> N-kadheryna) etc. Nisza metastatyczna jako mikrośrodowisko komórki w miejscu jej ekstrawazacji Funkcja Cx43??? Czyz J. et al.., Nature Reviews Urology 9, (2012) 24

25 Zaangażowanie komunikacji międzykomórkowej za pośrednictwem złącz szczelinowych w procesach inwazji nowotworowej i determinowaniu potencjału metastatycznego komórek nowotworowych 1. Wykazano, iż szereg linii komórek nowotworowych o wysokim potencjale metastatycznym cechuje wysoki poziom ekspresji koneksyn (np. komórki raka sutka, glejaki, czerniaki...) A E B F C G D H 25

26 Z drugiej strony: Koneksyny mogą wpływać na progresję nowotworową niezależnie od komunikacji międzykomórkowej za pośrednictwem złącz szczelinowych

27 Ruchliwość komórek może wpływać na funkcje złącz szczelinowych poprzez modyfikacje ich stabilności (I) Inkubacja komórek linii MAT-LyLu i B16 na podłożach pokrytych poli-l-lizyną powoduje spadek ich ruchliwości. Daniel et al., 2008

28 co skutkuje stabilizacją złącz szczelinowych i wzrostem wydajności międzykomórkowego transferu kalceiny Daniel et al., 2008

29 Zdolność koneksyn do ukierunkowania ruchu komórek nerwowych w rozwoju układu nerwowego Wniosek: Elias et al., Nature, Cx43 uczestniczy w ukierunkowaniu ruchu komórek w sposób niezależny od GJIC

30 Wpływ Cx43 na migrację komórek glejaka Bates, D. C., Sin, W. C., Aftab, Q., and Naus, C. C. Connexin43 enhances glioma invasion by a mechanism involving the carboxy terminus. Glia 55 (2007)

31 Prostata Funkcja paneksyn w komunikacji między erytrocytami a komórkami śródbłonka Dahl et al., 2006 Wniosek: Paneksyny tworzą kanały błonowe łączące cytoplazmę z otoczeniem komórki, a nie z jej sąsiadem Podobną cechę zasugerowano dla koneksonów zbudowanych z klasycznych koneksyn Locovei et al., 2006

32 Podstawowy model rozwoju nowotworu GUZ PIERWOTNY TSC Ekspansja klonalna, wzrost, dywersyfikacja, angiogeneza Właściwości komórek nowotworowych Limfocyt Płytki krwi Inwazja tkanki i intrawazacja Oddziaływania z komórkami limfatycznymi 1. Brak zależności wzrostu od lokalnej adhezji i funkcji czynników wzrostowych 2. Zanik wrażliwości na czynniki hamujące proliferację komórek 3. Zanik zdolności do apoptozy GUZ WTÓRNY Adhezja do śródbłonka i błony podstawnej 4. Wzmożona ruchliwość Ekstrawazacja (Hanahan&Weinberg, 2000) Angiogeneza Błona podstawna Macierz zewnątrzkomórkowa Proliferacja 32

33 Źródła heterogenności komórek nowotworowych Biochim Biophys Acta January; 1805(1): 105. Published online 2009 November 18. doi: /j.bbcan

34 Funkcjonalna heterogenność komórek AT-2 Ryszawy et al. (submitted) Niekompletne przejścia między fenotypem epithelioidalnym i mezenchymalnym odpowiadają za heterogenność komórek AT-2 34

35 Heterogenność sub-klonów AT-2 Ryszawy et al. (submitted) Korelacja między morfologią, ekspresją Snail-1 i Cx43, a potencjałem inwazyjnym subklonów AT-2 35

36 Pętle wspomagania między Cx43 a inwazyjnym fenotypem komórek AT-2_Fi2 Cx43 silencing induces MET in AT-2_Fi2 cells Snail-1 silencing induces MET and Cx43 down-regulation in fibroblastoid AT-2_Fi2 cells Converging effects of GJIC-dependent and GJIC-independent Cx43 function on the efficiency of PCC transendothelial migration 36

37 Zaaangażowanie Cx43 w stabilizację mikrotubul Wpływ na polaryzację ruchu komórek PLoS One. 2011; 6(10): e Published online 2011 October 14. doi: /journal.pone

38 Cx43 w diapedezie cyrkulujących komórek nowotworowych Pollmann et al. Breast Cancer Res, 2005 Układ odpornościowy: -Gap junctions in cytokine-induced leukocyte adhesion to endothelium in vivo. Véliz et al. Am J Physiol Heart Circ Physiol Connexin43 hemichannel activity with consequences on the innate immune response in endothelial cells Robertson et al., Biochem. J. (2010) 432 ( ) -Cx43 regulates B-lymphocyte spreading and adhesion. Machtaler et al. J. Cell Sci (2011); 124: 2611 Komorki nowotworowe: - el-sabban ME, Pauli BU. Adhesion-mediated gap junctional communication between lung-metastatatic cancer cells and endothelium. Invasion Metastasis ;14(1-6): Zhang et al. J. Communication between malignant glioma cells and vascular endothelial cells through gap junctions Neurosurg Apr;98(4): Pollmann et al. Connexin 43 mediated gap junctional communication enhances breast tumor cell diapedesis in culture. Breast Cancer Res. 2005;7(4):R

39 Cx43 i komunikacja między komórkami nowotworowymi a śródbłonkiem ułatwia transmigrację komórek nowotworowych przez warstwę endothelium Pollmann et al., 2006 GJIC Transmigracja

40 Transśródbłonkowa migracja komórek raka prostaty rola Cx43??? DU-145 AT-2 MAT-LyLU PC-3 [%] 100 Cx43 actin 75 AT-2 MAT-LyLu 50 Cx43 1h 25 0 GAPDH Mat-LyLu Miekus et al., (2005) AT-2 [%] 100 Cx43 75 Actin 50 Du145 PC-3 24h 25 0 Co-cultures of endothelial cells (HMEC, HUVEC) with prostate carcinoma cells used to visualize the communication systems within the Bermuda triangle of metastatic niche 40

41 Displacement [μm] Displacement [μm] ASCM [μm/h] Displacement [μm] DU145 DU145 sirna Komórki raka prostaty indukują aktywność migracyjną komórek endothelialnych (HUVEC) 200 HUVEC 100 Cx α-tubulin Total length of cell movement [μm] Total length of cell movement [μm] HUVEC+DU-145 HUVEC+PC ASCM * * ARCD * * ARCD [μm/h] Total length of cell movement [μm] 0 HUVEC + DU DU145_siRNA The involvement of Cx43... Szpak et al. (submitted) 41

42 Pętle parakrynne w niszy metastatycznej komórek raka prostaty Conditioned media... HUVEC * Zymography standard DU-145 PC-3 HUVEC MMP2 55 MMP9 0 Control CM HUVEC CM DU145 CM PC-3 18 Averaged rate of cell displacement [μm/h] ARCD [μm/h] CM HUVEC CM DU145 CM PC HUVEC + IMMP * * + DU145 # # * * + DU145 +IMMP + PC3 + PC3 +IMMP Szpak et al. (submitted) 42

43 Wzrost ekspresji Cx43 w komórkach HUVEC w obecności komórek raka prostaty HUVEC PC3 DU-145 Mo 0,1mln DU145 Mo 1mln Mo 0,1mln DU145 sirna Mo 1mln HUVEC HUVEC 1h HUVEC+DU-145 HUVEC +Mo 0,1mln HUVEC +Mo 1mln 6h 24h HUVEC+DU HUVEC+DU-145 Mo 0,1mln + Mo 1mln 48h DU-145 sicx43 DU-145 co-culture control HUVEC DU-145 1h 6h 24h 48h c1h c6h c24h c48h Cx43 Cx43 β-catenin α-tubulin tubulin PC-3 Cx43 α-tubulin DU145_siRNA HUVEC+PC3 1h 6h 24h 48h control 1h 6h 24h 48h controlcx43 Cx43 α-tubulin Monocytes HUVEC HUVEC DU-145 [μm/h] 16 Average Rate of Cell Displacement 12 HUVEC +PC-3 * * * HUVEC + DU-145 * Cx43 β-catenin tubulin Szpak et al. (submitted) 43

44 Ekspresja Cx43 a zdolność komórek raka prostaty do mobilizacji komórek śródbłonka Displacement [μm] Displacement [μm] Displacement [μm] co-culture control HUVEC MAT-LyLu 1h 24h 48h c1h c24h c48h Cx43 β-catenin tubulin co-culture control HUVEC AT-2 1h 24h 48h c1h c24h c48h Cx HUVEC Total length of cell movement [μm] 200 HUVEC+AT β-catenin tubulin Total length of cell movement [μm] HUVEC 1h 24h HUVEC+ MAT-LyLu Total length of cell movement [μm] Szpak et al. (submitted) HUVEC mobilization in xenogenic systems is also correlated with PCC invasive potential and Cx

45 Ekspresja Cx43 w komórkach śródbłonka i podścieliska promuje ekstrawazację komórek krwi Czyż, 2007 Wzrost ekspresji Cx43 w komórkach śródbłonka w miejscach stanu zapalnego może promować ekstrawazację komórek nowotworowych wykazujących (re)ekspresję tego białka 45 Wang et al., 2006

46 Podsumowanie Existence of: Converging GJIC-dependent and GJIC-independent Cx43 effects on the efficiency of PCC transedothelial migration Czyz J. et al.., Nature Reviews Urology 9, (May 2012) doi: /nrurol Three levels of Cx43 involvement in metastatic niche: - cancer cell competence for GJIC with endothelial continuum - endothelial cell competence for GJIC with cancer cells - intrinsic invasive potential of cancer cells 46

47 Czyz J., Wobus A.M. Differentiation (2001) 68: Neo

48 Model ontogenezy, organogenezy i karcinogenezy organizmów wielokomórkowych funkcja niszy Interakcje między komórkami a ich niszą czyli mikrośrodowiskiem komórki pozostającym w stanie ciągłej z nią wymiany informacji decydują o przebiegu ontogenezy i organogenezy organizmów wielokomórkowych Zaburzenia komunikacji między komórkami a ich niszą decydują o toku rozwoju nowotworu

49 Od komórki do organu Od komórki do guza