Ocena rozprawy doktorskiej

Transkrypt

1 Kraków, Ocena rozprawy doktorskiej Mgr. Tomasza Bednarskiego pt. Rola szlaków sygnałowych regulujących metabolizm lipidów w rozwoju przerostu lewej komory mięśnia sercowego Niewydolność serca stanowi obecnie bardzo istotny problem kliniczny, gdyż jest jednym z kluczowych schorzeń układu sercowo naczyniowego prowadzących do śmierci oraz w znaczącym stopniu obniżającym jakość życia. Dlatego badania nad mechanizmami i potencjalnymi metodami leczenia i zapobiegania niewydolności serca, są szczególnie ważne. W prezentowanej rozprawie autor podejmuje szczególnie ważny i dotychczas słabo poznany problem dotyczący mechanizmów lipidowych przerostu lewej komory serca w kilku patologiach tworząc możliwości modulacji tych mechanizmów za pomocą inhibitorów szlaków regulujących metabolizm lipidów. Tak trafny dobór tematu zasługuje na szczególne podkreślenie w kontekście relatywnie małej dostępności terapii farmakologicznych skutecznie hamujący dysfunkcję i przerost mięśnia sercowego. Podstawowa koncepcja rozprawy oparta jest na fakcie, iż przerost lewej komory wiąże się nie tylko ze zmianą wielkości i kształtu mięśnia sercowego, ale przede wszystkim ze zmianami w jego metabolizmie energetycznym. W warunkach fizjologicznych kwasy tłuszczowe pokrywają ok. 60% zapotrzebowania energetycznego serca, natomiast źródłem pozostałych 40% energii jest glukoza. W stanach chorobowych, takich jak niewydolność mięśnia sercowego, otyłość czy cukrzyca, zużycie substratów energetycznych przesuwa się w stronę zwiększonego utlenienia kwasów tłuszczowych. Sugeruje się, że to właśnie ta zmiana prowadzi do rozwoju kardiomiopatii i przebudowy lewej komory o charakterze patologicznym. Zwiększenie zużycia glukozy zwiększa odporność mięśnia sercowego na niedotlenienie i chroni je przed 1

2 negatywnymi skutkami wywołanymi przez nadmiar nagromadzonych lipidów. Badania ostatnich lat wykazały, że białka zaangażowane w innych tkankach w procesy związane z metabolizmem lipidów, w sercu mogą wpływać na aktywność szlaków sygnałowych. Jednym z takich białek jest desaturaza stearoilo-coa 1 (SCD1), która katalizuje przemianę nasyconych w jednonienasycone kwasy tłuszczowe, a w sercu bierze dodatkowo udział w regulacji metabolizmu poprzez kontrolę ekspresji genów kodujących białka biorące udział w transporcie i syntezie kwasów tłuszczowych oraz zwiększenie użycia glukozy jako substratu energetycznego z jednoczesnym obniżeniem tempa wykorzystania kwasów tłuszczowych. Regulatorowa funkcja kwasów tłuszczowych w kardiomiocytach oraz molekularne mechanizmy biorące udział w regulacji metabolizmu energetycznego mięśnia sercowego podczas rozwoju przerostu lewej komory nie zostały jeszcze poznane, w co doskonale wpisują się badania doktoranta. Dlatego właśnie podjęcie przez Mgr Tomasza Bednarskiego badań wnikliwie charakteryzujących białka uczestniczące w przemianach kwasów tłuszczowych i ich regulacji oraz podjęcie próby wstępnych badań mechanistycznych in vivo i in vitro w kardiomiocytach jest szczególnie cenne. W szczególności, na uznanie zasługuje wielostronne podejście do trudnego tematu biologii przemian lipidowych w przeroście serca, wymagające ekspertyzy i umiejętności nie tylko w zakresie nie tylko badań poziomów i produkcji poszczególnych białek, lecz także zagłębienia się w mechanizmy opisywanych zjawisk w tym w mechanizmy związane z ekspresją poszczególnych szlaków metabolicznych. Licząca 175 stron, obszerna rozprawa ma klasyczną budowę. składa się ze spisu publikacji i prezentacji autora związanych z rozprawą, wykazu skrótów, rycin i tabel, wstępu, celów i założeń pracy, materiału i metodyki, wyników, dyskusji, wniosków, aktualnego piśmiennictwa oraz streszczenia w języku polskim i angielskim. Praca jest wzbogacona aż stu trzydziestoma pięcioma starannie przygotowanymi, czasem wielopanelowymi rycinami oraz 14 zamieszczonymi w metodyce oraz wynikach Tabelami. Sposób przedstawienia pracy jest czytelny i nie budzi zastrzeżeń. Pracę czyta się z przyjemnością. Tak obszerna praca i liczba rycin i Tabel wskazuje na wnikliwość i bardzo szeroki zakres jak i żmudność podjętych badań, co należy już na początku tej Recenzji szczególnie podkreślić. Na uwagę zasługuje sprawne posługiwanie się autora szeroką metodologią specjalistyczną zarówno w kontekście aspektów molekularnych i czynnościowych, choć doktorantowi nie udało się uniknąć kilku nieścisłości językowych i terminologicznych. We wstępie Doktorant opisuje najpierw zagadnienia podstawowej biologii i patogenezy przerostu mięśnia serca tak w warunkach fizjologicznych jak i patologicznych, aby następnie zagłębić się w znaczenie czynników metabolicznych w tym procesie, ze szczególnym 2

3 uwzględnieniem metabolizmu lipidów. W kolejnej części omawia procesy syntezy i przemian kwasów tłuszczowych, aby krótko wprowadzić problematykę zaburzeń mitochondrialnego łańcucha oddechowego oraz ważne w fizjologii i patologii kardiomiocytów aspekty obiegu jonów wapnia w tych komórkach. Wstęp jest niezwykle rozbudowanym podsumowaniem dostępnej literatury dotyczącej często bardzo skomplikowanych przemian biochemicznych. Wskazuje na dużą wiedzę doktoranta w tym zakresie i zdolność jej syntetyzowania. Wstęp w dobry sposób wprowadza do przeprowadzonych badań i stanowi odpowiednie uzasadnienie dla podjętej tematyki badawczej i wyznaczonych celów. Cele badań są przedstawione jasno i zostały zrealizowane w toku rozprawy doktorskiej. Są one sformułowane szczegółowo, w pewnym sensie opisując również podstawowe założenia badania. Celem pracy Mgr Tomasza Bednarskiego było określenie roli szlaków sygnałowych regulujących metabolizm lipidów w rozwoju fizjologicznego i patologicznego przerostu lewej komory mięśnia sercowego. Szczegółowe cele sformułowane przed doktoranta obejmowały: (1) Określenie wpływu długołańcuchowych kwasów tłuszczowych metabolizowanych przez SCD1 (18:0 i 18:1) na metabolizm, strukturę i funkcję mięśnia sercowego; (2) Analizę możliwej zależności pomiędzy SCD1 oraz receptorami aktywowanymi przez proliferatory peroksysomówα (PPARα) w regulacji metabolizmu lipidów w kardiomiocytach; (3) Identyfikację szlaków sygnałowych regulujących metabolizm lipidów w fizjologicznym oraz patologicznych modelach przerostu lewej komory serca, ze szczególnym uwzględnieniem wzajemnych zależności pomiędzy lipolizą a utlenianiem kwasów tłuszczowych w kardiomiocytach; (4) Określenie roli zaburzeń w funkcjonowaniu procesów związanych z metabolizmem lipidów, tj. szlaków lipogenezy, lipolizy oraz utleniania kwasów tłuszczowych, w rozwoju patologicznego przerostu lewej komory mięśnia sercowego u szczurów ze spontanicznie rozwijającym się wraz z wiekiem nadciśnieniem tętniczym (SHR). Opis metodyki badań jest rzetelny i dokładny. Wskazuje na samodzielność wykonanej pracy, a także na świadomy wybór wiarygodnych i dostępnych technik badawczych. Na uwagę zasługuje wszechstronność podjętych badań oraz fakt, iż aby zrealizować nadrzędny cel rozprawy doktorskiej, Pan dr Bednarski wykorzystał pięć różnych modeli zwierzęcych, odpowiednio dobranych do stawianych pytań. W celu zbadania wpływu długołańcuchowych kwasów tłuszczowych wykorzystano model dietetyczny, szczurów karmionych paszą wzbogaconą w tłuszcz, kwas stearynowy lub oleinowy. Do analizy roli szlaków związanych z metabolizmem lipidów w przeroście mięśnia sercowego związanym z nadciśnieniem tętniczym wykorzystano samce szczurów spontanicznie rozwijających nadciśnienie tętnicze (SHR). Do określenia roli szlaków związanych z metabolizmem lipidów oraz ich wpływu na powstawanie 3

4 patologicznego przerostu lewej komory oraz dysfunkcji mięśnia sercowego wykorzystano model przeciążenia ciśnieniowego poprzez zabieg zwężenia aorty brzusznej (ang. abdominal aortic banding, AAB). W celu analizy roli szlaków związanych z metabolizmem lipidów oraz ich wpływu na powstawanie fizjologicznego przerostu lewej komory mięśnia sercowego szczury stada Wistar zostały poddane treningowi wytrzymałościowemu (ang. endurance training, ET). W celu zbadania wpływu szlaków regulowanych przez SCD1 oraz PPARα na metabolizm i funkcję mięśnia sercowego wykorzystano myszy z wyciszoną ekspresją genu Scd1 (SCD1-/-), myszy z wyciszoną ekspresją genu Ppara (PPARα-/-) oraz myszy z podwójnym, globalnym nokautem genów Scd1 i PPARalfa (SCD1-/-/PPARα-/-). Wykorzystując w/w modele doświadczalne określono rolę zaburzeń w lipogenezie, lipolizie i utlenianiu kwasów tłuszczowych, w fizjologicznym oraz patologicznym przeroście lewej komory serca, ze szczególnym uwzględnieniem ekspresji genów oraz szlaków sygnałowych regulujących te procesy. Należy natomiast podkreślić szeroki zakres badań charakteryzujących badane szlaki metaboliczne z wykorzystaniem dużej ilości prawidłowo zoptymalizowanych metod oceny szczególnie poziomu białek z zastosowaniem Western blotting a także mrna (RT-PCR), aż po pomiary czynnościowe produkcji reaktywnych form tlenu oraz czynności skurczowej o obiegu wapnia w kardiomiocytach. Takie połączenie badań czynnościowych z biologią molekularną zasługuje na szczególnie wysoką ocenę. Cenne jest ilustrowanie wykonywanych oznaczeń zapisami zdjęć żelów i danych z aparatury typu raw data, choć w przypadku przedstawiania danych Western blotting za wskazane uznałbym pokazywanie wielkości paska (bandu) w kda, a nie tylko jego przypisaną nazwę, szczególnie że trudno było do każdego z oznaczeń używać kontroli negatywnej (np. komórek pozbawionych tego białka). W takiej sytuacji jasne wskazywanie jakiej wielkości (kda) jest każdy z analizowanych pasków jest bardzo ważne. Podczas gdy większość wybranych przez Doktoranta technik pomiarowych należy do szeroko stosowanych i wiarygodnych, warto zauważyć, iż ostatnio ukazujące się zalecenia metodologiczne pomiarów wolnych rodników tlenowych wskazują na celowość zastosowania prawdziwie ilościowych i co najmniej dwóch, jeśli nie trzech niezależnych metod pomiaru produkcji tych wyjątkowo niestabilnych w materiałach biologicznych cząsteczek. A zastosowana w rozprawie technika jest w doświadczeniu Recenzenta dość orientacyjna. Poza tymi pomniejszymi uwagami jakie się zrodziły podczas lektury, większość metod opisanych w rozdziale nie budzi żadnych wątpliwości, a ich wielostronność i żmudność optymalizacji zasługuje na podkreślenie i uznanie. Podsumowując, szczegółowy opis metodyczny stosowanych technik badawczych wskazuje, iż badania zarówno molekularne jak i czynnościowe były dobrane i przeprowadzone przez doktoranta dokładnie, ze szczególnym zrozumieniem poszczególnych technik. Wyniki badań obejmują aż 109 dobrze przygotowanych i wyraźnie opisanych Rycin oraz szereg 4

5 Tabel. W kolejnych częściach Wyników Mgr Tomasz Bednarski charakteryzuje lipidowe aspekty struktury mięśnia sercowego w kolejnych badanych przez siebie modelach przeprowadzając szczegółową analizę poziomów białek poszczególnych szlaków metabolizmu kwasów tłuszczowych. Przeprowadzone badania wykazały, że kwas oleinowy powoduje zwiększenie wymiaru poprzecznego kardiomiocytów, spadek ich zdolności wczesnoskurczowej oraz przerost lewej komory mięśnia sercowego. Proces ten związany jest z aktywacją szlaku kinazy białkowej C izoformy α, zmianami w gospodarce wapniowej regulowanymi przez białko NCX oraz wzrostem zawartości łańcuchów ciężkich miozyny izoformy β w kardiomiocytach. Wywołane przez kwas oleinowy zmiany w metabolizmie i funkcji mięśnia sercowego związane były ze wzrostem ekspresji genów zaangażowanych w syntezę triacylogliceroli oraz zahamowaniem zależnej od ATGL lipolizy, czego efektem było stłuszczenie kardiomiocytów. Następnie wykazano, że zahamowanie ekspresji/aktywności SCD1 obniża zawartość lipidów w kardiomiocytach niezależnie od czynnika transkrypcyjnego PPARα poprzez redukcję lipogenezy oraz aktywację lipolizy. W obecnej pracy, po raz pierwszy pokazano także, że podwyższony poziom ekspresji SCD1, zwiększona lipogeneza oraz aktywacja szlaku oksydacyjnego regulowanego przez PPARα w mięśniu sercowym są związane z rozwojem fizjologicznego przerostu lewej komory serca i mogą być częścią mechanizmu biorącego udział w adaptacji serca do wysiłku fizycznego. Natomiast akumulacja triacylogliceroli związana z patologicznym przerostem lewej komory serca wywołanym przeciążeniem ciśnieniowym oraz wrodzonym nadciśnieniem tętniczym jest efektem obniżonej lipolizy w kardiomiocytach, a brak aktywacji lipogenezy może być jednym z mechanizmów prowadzącym do rozwoju patologicznego przerostu lewej komory w nadciśnieniu tętniczym. Podsumowując, wyniki przeprowadzonych badań wskazują, że zmiany w metabolizmie kwasów tłuszczowych i lipidów są zaangażowane w powstawanie zarówno patologicznego jak i fizjologicznego przerostu lewej komory serca. Natomiast, co istotne, jedynie przerost patologiczny związany jest z nadmierną akumulacją triacylogliceroli w kardiomiocytach. Wyniki te mogą sugerować, że terapia celowana na wewnątrzkomórkowe szlaki regulujące metabolizm lipidów w kardiomiocytach mogłaby być wykorzystana w leczeniu zaburzeń pracy serca towarzyszących otyłości i nadciśnieniu. Dla wyciągnięcia takiego wniosku konieczne jednak będą dalsze badania z zastosowaniem modeli pozbawionych poszczególnych elementów szlaków regulujących metabolizm lipidów w kontekście modeli patologii otyłości i nadciśnienia. Podczas gdy większość wyników jest opisana jasno, kilka aspektów wzbudziło moje dodatkowe zainteresowanie oraz szereg pytań. Szereg zmian molekularnych i czynnościowych może być w znaczącym stopniu regulowane 5

6 przez stres oksydacyjny, szczególnie w kontekście zwiększonej aktywności PKCa. Zrozumienie roli np. oksydaz NADPH w tym procesie mogłoby wskazać nowe wartościowe cele terapeutyczne. Jak wspomniałem powyżej zastosowane metody pomiaru ROS nie pozwalają na wiarygodną ocenę ilościową i cenne byłoby wzbogacenie badan o bardziej ilościowe metody pomiaru. Bardzo ciekawe byłoby w przyszłości zbadanie zmian w nasierdziowej tkance tłuszczowej a nie tylko kardiomiocytach, jako że jej metabolizm może w znaczący sposób wpływać na zmiany patologiczne w sercu i naczyniach wieńcowych. Czy poszczególne formy karmienia kwasami tłuszczowymi różniły się we wpływie na masie tłuszczu nasierdziowego i jak różni się metabolizm lipidów w tych tkankach w porównaniu z tkanką tłuszczową najądrzową. Stłuszczenie w tkankach serca jest bardzo interesujące i może wpływać na obserwowane wyniki. Może to mieć znaczenie tak w modelu karmienia dieta wysokotłuszczowa jak i w nadciśnieniu tętniczym w którym obserwujemy często ekotopową akumulację tkanki tłuszczowej w sercu. Autor stwierdza, iż krople lipidowe prezentowane w histologii zlokalizowane sa w kardiomiocytach tymczasem skąd pewność ze nie mamy do czynienia z ektopowymi adipocytami? Za wyjątkowo ciekawą z punktu widzenia etapów przerostu mięśnia sercowego w nadciśnieniu tętniczym uważam obserwacje dotyczącą gromadzenia kropli lipidowych w sercu szczurów SHR młodych ale nie na etapie już wykształconej hipertrofii. Zbadanie tego zjawiska w przyszłości wydaje się bardzo interesujące. W modelu in vitro jaki stanowiły kardiomiocyty HL-1, zahamowano aktywność białka SCD1 z użyciem inhibitora A939572, a aktywność PPARα z użyciem GW6471. Użycie takich inhibitorów zawsze budzi istotne pytanie o efekty typu off-target i w związku z tym rodzi pytanie dlaczego nie podjęto badan z zastosowaniem shrna? Dlaczego doktorant pominął w badaniach czynnościowych KO - AMPK/ACC. Odwrotne zachowanie się fosfo-ampk w nadciśnieniu i diecie wysokotłuszczowej wydaje się być bardzo interesujące. Jakie jest w opinii doktoranta znaczenie zwiększonej fosforylacji AMPK u myszy karmionych dietą wysokotłuszczową i mniejsza odpowiedz w grupach TO i TS. W echokardiografii natomiast bardzo ciekawym parametrem byłoby określenie E/A parametru oddającego dysfunkcje rozkurczowa m. sercowego, która w ostatnich latach stała się wyjątkowo istotnym problemem klinicznym. Podsumowując, praca jest bardzo rozbudowaną i cenną, opisową charakteryzacją szczegółowych szlaków regulacyjnych metabolizmu kwasów tłuszczowych w kontekście szeregu patologii związanych z przerostem i dysfunkcją mięśnia serca. W ostatnim etapie badan podjęto próbę określenia znaczenia mechanistycznego zidentyfikowanych kluczowych szlaków metabolicznych z wykorzystaniem myszy z wyciszonymi genami dla 6

7 SCD1 i PPARg oraz zastosowaniem inhibitorów tych cząsteczek in vitro. Jednakże badania te tylko wstępnie wyjaśniają związki między metabolizmem lipidów a patologią mięśnia sercowego i zastosowanie poszczególnych modelów przeciążenia serca w odpowiednich KO dopiero pozwoliłoby to ustalić, co może stanowić idealną kontynuację tej tak ciekawej rozprawy doktorskiej. Rodzi się też pytanie, dlaczego autorzy nie podjęli analizy metabolomicznej mięśnia serca w poszczególnych grupach co pozwoliłoby na kompleksową identyfikacje zmian i skoncentrowanie się na ekspresji wybranych, najważniejszych enzymów i białek sygnałowych w zidentyfikowanych zmianach metabolicznych. Podsumowując, należy jeszcze raz docenić i podkreślić ogromy wkład pracy doktoranta w systematyczna analizę poszczególnych cząsteczek uczestniczących w metabolizmie lipidów w kilku tak ciekawych modelach zwierzęcych. W kontekście ogromu wykonanej pracy i licznych pomiarów bardzo cenne dla czytelnika byłoby podsumowanie graficzne i/lub tabelaryczne porównujące i podsumowujące zmiany poszczególnych elementów szlaków metabolizmu lipidów w badanych typach przerostu i dysfunkcji mięśnia sercowego. Wnioski i podsumowanie wyników przedstawione są prawidłowo. Są klarowne i odpowiadają postawionym przez Doktoranta celom badania, w pewnych miejscach wykraczając poza postawione cele. Dyskusja pracy jest przeprowadzona w sposób interesujący. Omówione zostały wszystkie główne obserwacje poczynione przez Doktoranta, w kontekście opublikowanej literatury. Mgr Tomasz Bednarski czasem nazbyt ostrożnie odnosi się do wagi uzyskanych przez siebie interesujących wyników. Autor cytuje aż 343 prac, właściwie dobierając piśmiennictwo, obejmujące najważniejsze publikacje, w tym szereg prac najnowszych. Dyskusję charakteryzuje świadoma i krytyczna analiza uzyskanych wyników oraz zasługująca na uwagę ostrożność w ich interpretacji. Uważam, że obserwacje poczynione w obecnej pracy będą stanowić cenną podstawę do przyszłych badań i już na tym etapie dostarczyły wielu cennych informacji na temat biologii i metabolizmu kardiomiocytów w warunkach fizjologicznych i patologicznych. Podsumowując, przedstawiona mi do oceny Rozprawa Doktorska Pana magistra Tomasza Bednarskiego wskazuje na dojrzałość naukową doktoranta, zarówno w podejmowaniu tematyki i celów badań jak i w ich konsekwentnej realizacji przy pomocy starannie dobranej metodyki, a przedstawione uwagi są wyrazem zainteresowania tematem jakie we mnie lektura Rozprawy wzbudziła, i nie umniejszają jej wartości. Uważam, iż praca ta stanowi cenny i unikalny wkład do światowego piśmiennictwa w tym zakresie. W związku z tym z całą pewnością stwierdzam, iż przekazana mi do oceny praca spełnia 7

8 wszystkie wymogi rozprawy na stopień doktora nauk biologicznych i mam zaszczyt przedstawić Wysokiej Radzie Instytutu Biologii Doświadczalnej im M. Nenckiego o dopuszczenie Mgr Tomasza Bednarskiego do dalszych etapów przewodu doktorskiego, a także wnioskuję o wyróżnienie prezentowanej rozprawy doktorskiej. Prof. dr hab. med. Tomasz Guzik Laboratorium Medycyny Translacyjnej oraz Katedra Chorób Wewnętrznych i Medycyny Wsi Collegium Medicum Uniwersytetu Jagiellońskiego w Krakowie 8