Metody biologii komórki

Transkrypt

1 Wybrane, współczesne metody badań struktury i funkcji komórek Materiał do badań biologii komórek (organizmów) Chemiczne składniki komórek Metody biologii komórki Współczesne badania mikroskopowe Barwienia cytochemiczne Wizualizacja cząsteczek w Ŝywej komórce Hodowle komórkowe Badania biochemiczne i molekularne w biologii komórki 1

2 BADANIA MIKROSKOPOWE MIKROSKOPY gr. mikros = mały; gr. skopein = patrzeć przyrządy do obserwacji pod duŝym powiększeniem przedmiotów blisko umieszczonych świetlne elektronowe nieoptyczne np. AFM Mikroskopy świetlne wykorzystują widzialne pasmo fal elektromagnetycznych Zespół optyczny: źródło światła przesłona kondensor obiektyw oświetlacz pośrednie układy optyczne okular obraz mikroskopowy: pozorny, silnie powiększony, odwrócony 2

3 Mikroskopy świetlne Zespół mechaniczny: podstawa statyw stolik przedmiotowy rewolwer tubus śruba makro- i mikrometryczna Mikroskopy świetlne Zdolność rozdzielcza mikroskopu λ d = κ A A = n x sin α A = apertura numeryczna λ = długość fali światła tworzącego obraz κ = współczynnik zaleŝny od stosunku A kondensora do A obiektywu α = kąt między osią optyczną a skrajnym promieniem wpadającym do obiektywu n = współczynnik załamania fali w środowisku 2α Ob K gdy A = 1,4 i λ = 0,45µm d = 0,2 µm 3

4 Wizualizacja komórek przejrzystych Kontrastowanie komórek: barwienia odmiany mikroskopów: kontrastowo-fazowe polaryzacyjno-interferencyjne (z układem optycznym Nomarskiego) Mikroskop kontrastowo-fazowy Fizyk holenderski Frits Zernike - opracował zasadę kontrastu-faz; nagroda Nobla bezpośrednie przekształcenie zmian fazowych fali świetlnej w badanym preparacie na zmiany natęŝenia światła w obrazie mikroskopowym tego preparatu przesłona pierścieniowa kondensora płytka fazowa w obiektywie Układ optyczny, który przesuniecie fazy fali świetlnej przekształca w zmianę amplitudy 4

5 śywe komórki zwierzęce: zdjęcie spod mikroskopu: a) jasnego pola, b) kontrastu-faz, Mikroskopy świetlne specjalne odmiany mikroskopów Fibroblast (HSF) z hodowli; zdjęcie spod mikroskopu: A) jasnego pola, B) kontrastu-faz, C) kontrastu róŝnicowego Nomarskiego, D) ciemnego pola 5

6 Mikroskop fluorescencyjny wykorzystuje zjawisko fluorescencji substancji : obecnych w komórce: chlorofil, witamina A, porfiryny, lipofuscyny wprowadzonych (znaczniki fluorescencyjne): fluoresceina, rodamina, oranŝ akrydyny, DAPI, Hoechst, bromek etydyny, Alexa, Cyto... Mikroskop fluorescencyjny oświetlenie epi epi fluorescencja 6

7 Mikroskop fluorescencyjny Wrzeciona mitotyczne w metafazie u embriona muszki owocowej Drosophila (DNA wybarwione na zielono; mikrotubule wrzeciona na czerwono). Mitoza w komórkach płuc traszkiw hodowli (DNA wybarwione na niebiesko; mikrotubule wrzeciona na zielono). uniwersalny mikroskop badawczy wykorzystanie róŝnych odmian mikroskopii świetlnej przy uŝyciu 1 przyrządu wizualizacja i analiza procesów biologicznych z wykorzystaniem zautomatyzowanych systemów mikroskopowych (chłodzone kamery CCD); moŝliwości poklatkowej rejestracji obrazów; cyfrowy zapis obrazów i analiza. 7

8 Mikroskopy elektronowe transmisyjny mikroskop elektronowy (TME) cewki magnetyczne próŝnia TME dla preparatów biologicznych: d- 2nm, pow. do 1mln razy Mikroskopy elektronowe transmisyjny mikroskop elektronowy 8

9 Mikroskopy elektronowe skaningowy mikroskop elektronowy SME dla preparatów biologicznych: d od 3 do 20 nm Mikroskopy elektronowe skaningowy mikroskop elektronowy 10µm Mikrografia szczurzych fibroblastów z hodowli in vitro ( na podłoŝu plastikowym) 10µm Mikrografia komórek droŝdŝy piekarskich 9

10 1. Utrwalanie Mikroskopy elektronowe przygotowanie materiału do mikroskopii 2. Osmowanie (utrwalanie wtórne) 3. Odwadnianie 4. Zatapianie - Ŝywice epoksydowe; Ŝywice akrylowe 5. Krojenie skrawków i nakładanie na siatki grubość: nm (noŝe szklane lub diamentowe) 6. Kontrastowanie skrawków - octan uranylu (białka, kwasy nukleinowe) cytrynian ołowiu (lipidy, wielocukry) Wizualizacja struktury komórki Klasyczne barwienia cytologiczne (histologiczne) Metody immunocytochemiczne oparte na wysokiej swoistości wiązania antygenu z przeciwciałem Autoradiografia metoda wykrywania izotopów promieniotwórczych dzięki ich zdolności do zaczerniania emulsji światłoczułej 10

11 Barwienia cytologiczne (histologiczne) Hematoksylina (jądra) powinowactwo do struktur zasadochłonnych, ujemnie naładowanych (DNA, RNA, kwaśne białka) Eozyna (substancja międzykomórkowa) powinowactwo do cząsteczek kwasochłonnych Komórki zbiorczego kanalika moczowego nerki Immunocytochemia Znaczniki: fluorochromy enzymy metale cięzkie antygen -kaŝda substancja w komórce, która ma właściwości immunogenne przeciwciało - immunoglobulina skierowana przeciw danemu antygenowi róŝnorodność swoistość przeciwciał 11

12 Immunocytochemia Metody wizualizacji cząsteczek w Ŝywej komórce Genetyczne znakowanie białek GFP (green fluorescent protein) - zielono białko fluoryzujące (z cyklicznym trójpeptydem ser-tyr-glic ) 238 aa wprowadzanie genu kodującego GFP do komórki i łączenie z genem kodującym badane białko (technika rekombinacji DNA) śledzenie znakowanych białek w Ŝywych komórkach (białka fuzyjne) Aequorea vicotria Nagroda Nobla 2008 Osamu Shimomura Martin Chalfie Roger Y. Tsien 12

13 Materiał do badań biologii komórki Pobieranie materiału z organizmów Hodowle komórkowe Organizmy modelowe Hodowla komórek i tkanek utrzymanie przy Ŝyciu oddzielonych od organizmu komórek (w warunkach sztucznych), in vitro hodowla dostarczenie wszystkich składników i odpowiednich warunków niezbędnych do wzrostu i rozwoju - poŝywki: odpowiedni skład, ph, osmolarność poŝywki naturalne (osocze, wyciągi tkankowe) poŝywki sztuczne (zdefiniowane; z dodatkiem surowicy) - temperatura, %CO 2 13

14 zachowanie jałowości - jałowość całej procedury hodowli - naczynia hodowlane - antybiotyki Hodowla komórek i tkanek Zdjęcie mioblastów w hodowli Zdjęcie fibroblastów w hodowli Zdjęcie komórek prekursorowych oligodendrocytów w hodowli 14

15 Organizmy modelowe w badaniach Cecha małe rozmiary i proste poŝywienie duŝa liczba potomstwa krótki cykl Ŝyciowy mały genom duŝe chromosomy dostępność informacji i technik badawczych Zalety hodowla nie wymaga duŝo miejsca, jest łatwa i tania w utrzymaniu pozwala na wiarygodną analizę statystyczną wzorów dziedziczenia umoŝliwia obserwację wzorów dziedziczenia w kolejnych pokoleniach mała ilość DNA do analizy; łatwiej badać chromosomy w mikroskopie świetlnym wiele genetycznych mutantów jest dostępnych do analiz Organizmy modelowe -Prokarionty Escherichia coli (pałaczka okręŝnicy) (Enterobacteriaceae) Gram-ujemna bakteria flora bakteryjna jelita grubego symbiont podział co 20min Poznanie mechanizmów replikacji, transkrypcji i 2µm; 0,8µm translacji 1 kolista cząsteczka DNA 4,6 mln par zasad; 4300 białek od 15 tys. do 30 tys. rybosomów 15

16 Organizmy modelowe -Eukarionty Organizmy jednokomórkowe Saccharomyces cerevisiae - droŝdŝe piekarskie DNA 12,1 mln par zasad (2,5 x więcej) genów (5800 funkcjonalnych) 23% genomu droŝdŝy - jak u ludzi kompletna sekwencja genomu (1-szy eukariont) Poznanie mechanizmów cyklu komórkowego komórki eukariotycznej Rośliny modelowe bliskie pokrewieństwo ewolucyjne roślin kwiatowych (200mln lat) z gatunków Arabidopis thaliana - rzodkiewnik pospolity 5-30 cm Łatwość hodowli w szklarniach hydroponiczna Genom -110 mln par zasad, znana sekwencja Badania mechanizmów rozwoju i róŝnicowania roślin kwiatowych 16

17 Zwierzęta modelowe Caenorhabditis elegans - nicień Genom 97 mln par zasad genów sekwencja znana 959 komórek 70% białek człowieka ma odpowiedniki u C. elegans Poznanie mechanizmów rozwoju embrionalnego i działania wielu genów (apoptozy) Drosophila melanogaster - muszka owocowa Samiec i samica genom (4 chromosomy) 185 mln par zasad białek Poznanie podstaw genetyki klasycznej i mechanizmów rozwoju zarodkowego i larwalnego 17

18 Kręgowce modelowe Danio rerio Danio pręgowany (ryby) Genom 1,527,000,581par zasad genów białek sekwencja znana Szybki rozwój Łatwość uzyskiwania mutantów Poznanie mechanizmów rozwoju embrionalnego i działania wielu genów kręgowców Mus musculus Mysz domowa (ssaki) Prosta i tania hodowla DuŜa liczba potomstwa Zarodki myszy moŝna łatwo hodować in vitro Zarodki hodowane in vitro moŝna poddawać licznym manipulacjom np. nokauty genowe Uzyskiwanie myszy transgenicznych (z ekspresją obcego genu) Linie myszy z mutacjami genowymi lub skonstruowanymi genami Izolacja i hodowla in vitro komórek ES Genom: sekwencja poznana mysz ma 2,7 mld par zasad, człowiek ok. 3,1 mld par zasad, mysz ma 20 par chromosomów, człowiek - 23 pary Poznanie mechanizmów działania wielu genów na poziomie komórki i całego organizmu 18

19 Homo sapiens człowiek (ssaki) Badania na róŝnorodnych komórkach ludzkich w hodowlach in vitro ( defekt w genie kit - komórki barwnikowe) PoniewaŜ geny człowieka mają ścisłe odpowiedniki u organizmów prostszych, to badania tych organizmów (modelowych) mogą być kluczem do zrozumienia jak skonstruowane są i jak funkcjonują organizmy zwierzęce i organizm człowieka. Chemiczne składniki komórek Zbudowane z takich samych związków jak materia nieoŝywiona 65% 96,5% masy komórek H, O, C i N Pierwiastki chemiczne w komórkach: - makroelementy (pierwiastki biogenne) H, O, C, N, S, P Ca, Mg, K, Na, Cl >1% suchej masy - mikroelementy Fe, Cu, Mn, Mo, B, Zn, Co, J, F 0,01% - 0,00001% suchej masy 18% - ultraelementy Ra, Au, Ag, Pt, Se <10-6 % suchej masy 3% 19

20 Komórki wykorzystują prawa fizyki i chemii, aby przeŝyć Chemia komórki opiera się na związkach C (związki organiczne) zaleŝy od reakcji przebiegających w środowisku wodnym, wąskim zakresie temperatur wykazuje ogromną złoŝoność zdominowana przez cząsteczki polimerowe zachodzące reakcje są ściśle kontrolowane (miejsce, czas) Chemiczne składniki komórek DNA RNA białka jony nieorganiczne 1% małe cząsteczki organiczne 3% makrocząsteczki 26% polisacharydy ogromne zagęszczenie cząsteczek dynamika ruchu i oddziaływań cząsteczek 20

21 Skład chemiczny komórki bakteryjnej % masy komórki liczba rodzajów cząsteczek jony nieorganiczne 1 20 małe cząsteczki organiczne cukry i ich prekursory aminokwasy i prekursory 0,4 100 nukleotydy i prekursory 0,4 100 kwasy tłuszczowe i prekur inne 0,2 300 makrocząsteczki Małocząsteczkowe związki organiczne: masa cząst do ok. 30 atomów C cukry, aminokwasy, nukleotydy, kwasy tłuszczowe ok rodzajów cząsteczek w komórce eukariotycznej wolne cząsteczki w cytoplazmie jednostki monomeryczne makrocząsteczek elementy konstrukcyjne makrocząsteczek i struktur komórkowych źródło energii inne funkcje (sygnałowe) 21

22 Cukry - małocząsteczkowe związki Monosacharydy (CH 2 O) n n = 3 7 C 6 H 12 O 6 - róŝnorodność stereoizomeria n- liczba C 2 n - stereoizomerów D- galaktoza D- glukoza D-mannoza izomeria optyczna L- glukoza D- glukoza Monosacharydy - pochodne cukrów glukozy kwas glukuronowy glukozoamina N-acetyloglukozoamina Disacharydy (dwucukry) - róŝnorodność 11 róŝnych disacharydów z kondensacji 2 cząsteczek glukozy 22

23 Małocząsteczkowe związki organiczne - aminokwasy R łańcuch boczny forma niezjonizowana forma zjonizowana 20 aminokwasów powszechnych (α-amiokwasów) biogennych kwaśne (Asp, Glu) zasadowe (Lys, Arg, His) polarne bez ładunku (Asn, Gln, Ser, Thr, Tyr) niepolarne (Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met, Trp, Cys) aminokwasy izomeria optyczna formy D- i L- aminokwasów D i L-alanina L- aminokwasy białka D- aminokwasy ściany komórek bakterii antybiotyki jednostki monomeryczne peptydów, polipeptydów, białek 23

24 Małocząsteczkowe związki organiczne - nukleotydy adenina Nukleotydy: rybonukleotydy deoksyrybonukleotydy film ryboza adenozyna ATP trifosforan Zasady azotowe: pirymidynowe: cytozyna (C), tymina, (T) uracyl (U) Purynowe: adenina (A), guanina (G) Małocząsteczkowe związki organiczne - nukleotydy krótkotrwałe nośniki energii chemicznej (ATP, GTP) nośniki innych grup chemicznych cząsteczki sygnałowe (camp) połączone z innymi cząsteczki (CoA) monomery kwasów nukleinowych (przekaz informacji biologicznej) 24

25 Małocząsteczkowe związki organiczne kwasy tłuszczowe R-COOH (R oznacza łańcuch węglowodorowy), C: zwykle łańcuchy nasycone łańcuchy nienasycone (cis) cząsteczka amfipatyczna kwasu palmitynowego kwasy tłuszczowe C 18; 1= C 18 kwas oleinowy kwas stearynowy C 18; 2= kwas linolenowy C18; 3= w komórkach (zwykle) : estry lub amidy; kwas linolowy 25

26 Makrocząsteczki Ogólna reakcja uzyskiwania/degradacji makrocząsteczek H- -OH + H H 2 O hydroliza - H 2 O kondensacja H wiązania kowalencyjne glikozydowe peptydowe fosfodiestrowe podjednostka - makrocząsteczka Makrocząsteczki róŝnorodność sekwencji Białko o łańcuchu 150 aminokwasów kombinacji DNA o łańcuchu nukleotydów kombinacji Trisacharyd - setki kombinacji (łańcuchy rozgałęzione) róŝnorodność konformacji (elastycznośc łańcuchów) łączenie podjednostek w odpowiedniej kolejności = sekwencja reakcje katalizowane przez enzymy 26

27 unikatowy układ przestrzenny makrocząsteczek - wiązania niekowalencyjne: wodorowe jonowe van der Waalsa hydrofobowe własności biologiczne Makrocząsteczki wiązania niekowalencyjne -wybiórcze wiązanie innych cząsteczek powierzchnie nie pasują, ruchy termiczne rozdzielają cząsteczki powierzchnie pasują, cząsteczki związane - wiązania niekowalencyjne 27

28 aminokwasy - peptydy/ polipeptydy/ białka polarność strukturalna wiązanie peptydowe α-helisa; β-harmonijka; superhelisa; oligomeryzacja sekwencja peptydu: Phe-Ser-Glu-Lys kwasy nukleinowe wiązanie fosfodiestrowe DNA; RNA peptyd G-A-T-C 28