(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2015/07 EP B1 (13) (51) T3 Int.Cl. C07K 16/30 ( ) C07K 16/28 ( ) C07K 16/46 ( ) A61P 35/02 ( ) (54) Tytuł wynalazku: Leczenie pediatrycznej ostrej białaczki limfoblastycznej (30) Pierwszeństwo: US P US P US P (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2011/29 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 2015/07 (73) Uprawniony z patentu: Amgen Research (Munich) GmbH, München, DE (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 GERHARD ZUGMAIER, München, DE (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Aleksandra Twardowska-Czerwińska KANCELARIA PATENTOWA KULIKOWSKA & KULIKOWSKI SP.J. SKR. POCZT Warszawa 12 Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 25016/PE/15 EP B1 Opis [0001] Wynalazek ten dotyczy konstruktu bispecyficznego przeciwciała jednołańcuchowego skierowanego przeciw CD19 i CD3 (CD19xCD3) do stosowania w metodzie leczenia, łagodzenia lub eliminacji dziecięcej ostrej białaczki limfoblastycznej (ALL) u wymagających tego pediatrycznych pacjentów z ALL. [0002] Przy obecnym leczeniu dziecięcej ALL, wskaźnik przeżycia bez niekorzystnych medycznie zdarzeń wynosi około 75%. Dlatego też, nadal częste są nawroty. Problemami w leczeniu nawrotów ALL są oporność komórek białaczkowych i zmniejszona tolerancja pacjentów na drugą rundę leczenia, po otrzymaniu już intensywnej terapii pierwszoplanowej, co powoduje niższy odsetek remisji, jak również częstsze występowanie kolejnego nawrotu i ogólnie gorsze wyniki. Wzmożona polichemioterapia jest obecnie niezbędna dla indukcji drugiej całkowitej remisji. W zależności od wielu czynników prognostycznych, remisję można utrzymywać za pomocą samej chemioterapii i naświetlania czaszki lub przez intensyfikację leczenia przez przeszczep komórek macierzystych (Henze G, von Stackelberg A, Relapsed acute lymphoblastic leukemia. W: Childhood Leukemias, C-H Pui red. Cambridge: Cambridge University Press; 2006, str ). [0003] Chociaż poczyniono ogromny postęp w leczeniu dzieci z ostrą białaczkę limfoblastyczną (ALL) (patrz np. Möricke i in., Blood 111 (2008), str. 4477; Moghrabi i in., Blood 109

3 2 (2007), str. 896), nawroty ALL są nadal czwartym z najczęstszych nowotworów złośliwych u dzieci (Gaynon, Cancer 82 (1998), str. 1387). Szczególnie w przypadku pacjentów z wczesnym nawrotem w szpiku kostnym, w ciągu trzech lat od rozpoznania, leczenie tych pacjentów jest niesatysfakcjonujące i przeszczep allogenicznych komórek macierzystych jest do tej pory jedynym znanym podejściem terapeutycznym. Nawrót oporny na chemioterapię po przeszczepie hematopoetycznych komórek macierzystych (HSCT) wiąże się ze złym rokowaniem, chociaż infuzje limfocytów dawcy (DLI) po przeszczepie mogą indukować remisję u nielicznych pacjentów poprzez indukcję efektu przeszczep przeciw białaczce (GvL) (Loren i in., BMT 41 (2008), str. 483). Wyjściem może być drugi HSCT i donoszono o przypadkach długiego przeżycia. Jednakże, status choroby przed HSCT jest prognostyczny dla wyników po przeszczepie i wiadomo, że w przypadku pacjentów z chorobą morfologiczną lub przewlekle występującymi poziomami MRD >10-4 blastycznych komórek białaczkowych, istnieje bardzo wysokie ryzyko nawrotu i są bardzo złe rokowania (Bader i in., J Clin Oncol. 27 (2009), str ). W świetle tego, status choroby przed drugim HSCT jest bardzo istotny i powinno dołożyć się wszelkich starań, aby osiągnąć kolejną remisję. Pomimo stosowania ostatnio wprowadzonych czynników chemioterapeutycznych dla opornych na leczenie białaczek (Jeha, Semin Hematol. 46 (2009), 76-88), u pacjentów z nawrotami po HSCT często pojawia się choroba oporna na chemioterapię i pacjenci ci są bardzo wrażliwi na toksyczność związaną z chemioterapią. Dla takich pacjentów, potrzebne są inne niż chemioterapia i mniej toksyczne strategie, aby indukować u pacjentów remisję.

4 3 [0004] Biorąc pod uwagę powyżej wymienione wady konwencjonalnych terapii pediatrycznych ALL, ciągle istnieje potrzeba ulepszania schematu leczenia. [0005] Wynalazek ten dotyczy konstruktu bispecyficznego przeciwciała jednołańcuchowego skierowanego przeciw CD19 i CD3 (CD19xCD3) do stosowania w metodzie leczenia, łagodzenia lub eliminacji dziecięcej ostrej białaczki limfoblastycznej (ALL) u wymagających tego pediatrycznych pacjentów z ALL. To podejście immunologiczne, wykorzystujące przeciwciała angażujące komórki T, po raz pierwszy zapewnia inne niż chemioterapia i mniej toksyczne leczenie pediatrycznych ALL. [0006] Ostatnio, I faza badań wykazała znaczącą aktywność kliniczną bispecyficznego przeciwciała jednołańcuchowego skierowanego przeciw CD19 i CD3 (blinatumomab) w przypadku nawrotu chłoniaka nie-hodgkina z komórek B (NHL), pozytywnych pod względem CD19, w którym obserwowano imponującą częściową i całkowitą regresję nowotworu (Bargou i in., Science 321 (2008): 974-7). Anderson i in. (Blood J. 80 (1992): ) opisują bispecyficzny heterokoniugat pomiędzy przeciwciałem skierowanym przeciw CD19 i przeciwciałem skierowanym przeciw CD3, który jak się uważa wyzwala lizę komórek ostrej białaczki limfoblastycznej. [0007] W kolejnym, nadal trwającym badaniu klinicznym, leczenie za pomocą wspomnianego bispecyficznego przeciwciała jednołańcuchowego skierowanego przeciw CD19 i CD3, spowodowało eliminację opornych na chemioterapię komórek białaczkowych u dorosłych MRD-pozytywnych pacjentów z ALL CD19+, którzy nie otrzymali przeszczepu. [0008] Obecnie niespodziewanie stwierdzono w ramach dwóch indywidualnych stosowań, że wspomniane bispecyficzne

5 4 przeciwciało jednołańcuchowe skierowane przeciw CD19 i CD3 jest odpowiednie nie tylko do leczenia ALL u dorosłych pacjentów, którzy nie otrzymali przeszczepu, ale również pediatrycznych (lub dziecięcych) nawracających ALL opornych na konwencjonalną terapię ALL, obejmującą chemioterapię i allogeniczny przeszczep hematopeotycznych komórek macierzystych (HSCT). [0009] W tym opisie, autorzy wynalazku donoszą o silnym wpływie przeciwbiałaczkowym bispecyficznego przeciwciała skierowanego przeciw CD19 i CD3 u dwojga dzieci (dalej określanych jako pacjent 1 i 2) z ostrą białaczką limfoblastyczną (ALL) z komórek prekursorowych B, u których pojawił się oporny na chemioterapię nawrót po allogenicznym przeszczepie hematopeotycznych komórek macierzystych (HSCT) od zgodnych dawców niespokrewnionych i haploidentycznych. [0010] Przed leczeniem za pomocą bispecyficznego przeciwciała jednołańcuchowego skierowanego przeciw CD19 i CD3, pacjenta 1 leczono wcześniej stosując allogeniczny HSCT i wiele chemioterapii. Jednakże, te konwencjonalne terapie pediatrycznej ALL nie powiodły się, tak, że u pacjenta występowały powtarzające się nawroty i w konsekwencji jego rokowania były złe. Następnie, pediatryczny pacjent z ALL otrzymywał 15 mikrogramów/m 2 /24 godziny bispecyficznego przeciwciała jednołańcuchowego skierowanego przeciw CD19 i CD3, jako infuzję ciągłą przez pięć tygodni. Podczas leczenia z zastosowaniem przeciwciała, u pacjenta występowała ekspansja pochodzących od dawcy limfocytów T CD8+, bez żadnych objawów choroby przeszczep przeciw gospodarzowi (GvHD). Ta ekspansja komórek T była związana z szybką eliminacją blastycznych komórek białaczkowych pacjenta i 10

6 5 dni po rozpoczęciu leczenia przeciwciałem, w szpiku kostnym pacjentów nie można było wykryć żadnych komórek blastycznych, ponad minimalną chorobą resztkową (MRD) o poziomie wykrywalności 1 komórka na Pacjent pozostawał MRD negatywny w czasie leczenia przeciwciałem. Pacjent przeszedł drugi przeszczep komórek macierzystych od swojej haploidentycznej matki 2 tygodnie po zakończeniu leczenia bispecyficznym przeciwciałem jednołańcuchowym skierowanym przeciw CD19 i CD3 i od tej pory pozostawał MRD negatywny (status listopad 2009). [0011] W kwietniu 2001 roku, u piętnastoletniego pacjenta 2 zdiagnozowano ALL z prekursorowych komórek B, z chromosomem Philadelphia i pozytywnych pod względem CD19. Po chemioterapii, pacjent otrzymał HSCT od identycznego pod względem HLA rodzeństwa w październiku W 2002, zdiagnozowano nawrót w szpiku kostnym i kolejną remisję uzyskano stosując matinib i chemioterapię. Następnie otrzymał on drugi HSCT od identycznego pod względem HLA niespokrewnionego dawcy w październiku W marcu 2008, zdiagnozowano drugi nawrót i leczono go stosując niską dawkę chemioterapii i Dasatinib, z powodu oporności na Imatinib. Po dodatkowej chemioterapii z zastosowaniem klofarabiny oraz cytozyny/arabinozydu, osiągnął remisję molekularną i otrzymał trzeci allogeniczny HSCT od swojego haploidentycznego ojca, z 3 spośród 6 niedopasowanych alleli HLA, z leczeniem po przeszczepie za pomocą Dasatinib. Ze względu na krwawienia z przewodu pokarmowego i kardiomiopatię rozstrzeniową, przerwano podawanie Dasatinib 5 miesięcy po przeszczepie. W kwietniu 2009, zdiagnozowano nawrót zarówno w ośrodkowym układzie nerwowym (CNS) z 7x10 9 /litr komórek blastycznych,

7 6 jak i w szpiku kostnym z 3% komórek blastycznych. Pacjenta leczono następnie stosując Nilotinib, chemioterapię dokanałową i frakcjonowane napromieniowanie OUN w dawce 18 Gy. Trzy miesiące po tym leczeniu, szpik kostny pacjenta pozostawał dodatni pod względem MRD, na poziomie 1,1 x 10-3, podczas gdy OUN był wolny od komórek blastycznych. Analiza chimeryzmu krwi obwodowej ujawniła pełną hematopoezę pochodzącą od dawcy, jego haploidentycznego ojca. [0012] Następnie pacjenta leczono jednoskładnikowym preparatem blinatumomab w dawce 15 g/m 2 /dzień przez 4 tygodnie, przez ciągłą infuzję, bez żadnych skutków ubocznych. Aspiracja szpiku kostnego pod koniec leczenia wykazała całkowitą remisję z niewykrywalną MRD w szpiku kostnym, poniżej <1x10-4. Jak pacjent 1, pacjent 2 nie wykazywał żadnych objawów GvHD podczas i po leczeniu za pomocą blinatumomabu. Obecnie czuje się dobrze i uczęszcza do szkoły. [0013] Dane te w sposób imponujący wykazują, że bispecyficzne przeciwciała angażujące komórki T mogą indukować silny efekt przeszczep przeciw białaczce (GvL) przy braku GvHD u pacjentów pediatrycznych z nawracającą i oporną na terapię ALL z komórek prekursorowych B po HSCT. A zatem, korzystne jest w opisanym tu leczeniu pacjentów pediatrycznych, aby konstrukt bispecyficznego przeciwciała jednołańcuchowego skierowanego przeciw CD19 i CD3 indukował efekt przeszczep przeciw białaczce (GvL). Ponadto, leczenie jest dobrze tolerowane przez pacjentów pediatrycznych. W świetle tego, metody według tego wynalazku zapewniają zaskakująco lepsze opcje leczenia pediatrycznej ostrej białaczki limfoblastycznej (ALL), w szczególności, w przypadkach, w

8 7 których pediatryczna ALL jest oporna na konwencjonalne leczenie pediatrycznej ALL, obejmujące chemioterapię i/lub allogeniczny HSCT. Zgodnie z tym i w kolejnym wykonaniu tego wynalazku, wykorzystywane w tym opisie konstrukty bispecyficznych jednołańcuchowych przeciwciał (skierowane przeciw CD19 i CD3) można również stosować u pacjentów pediatrycznych, którzy przeszli przeszczep (allogeniczny) hematopoetycznych komórek macierzystych (HSCT). Jak zilustrowano w tym opisie, nawet pacjentów pediatrycznych, u których wystąpił nawrót ich ALL po HSCT od dopasowanych niespokrewnionych lub haploidentycznych dawców i/lub pacjentów pediatrycznych, którzy byli oporni na chemioterapię, można z powodzeniem leczyć stosując ujawnione w tym opisie metody. Przykładowi pacjenci, jak udokumentowano w tym opisie, wykazali imponującą odpowiedź przeciwbiałaczkową dzięki ujawnionej w tym opisie interwencji farmaceutycznej i stali się negatywni pod względem MRD, przy braku jakichkolwiek objawów GvHD (choroby przeszczep przeciw gospodarzowi). Chociaż przeżywalność u dzieci z ALL znacząco poprawiła się w ostatnich dziesięcioleciach, nawroty ALL są nadal główną przyczyną niepowodzenia terapeutycznego. Do tej pory, dla pacjentów z drugim nawrotem, jedynym podejściem terapeutycznym jest HSCT. Jednym z głównym przeciwbiałaczkowych działań HSCT jest indukcja efektu GvL. Niestety, występowanie GvL jest często związane z GvHD, która jest nadal główną przyczyną zachorowalności i śmiertelności po HSCT. Dlatego też, indukowanie GvL przy braku GvHD jest przedmiotem intensywnych badań. Jednym z podejść do indukowania efektu GvL jest infuzja limfocytów dawcy (DLI) po przeszczepie, którą preferencyjnie stosuje się do leczenia

9 8 nawrotów ALL po HSCT. Chociaż DLI jest bardzo skuteczna w leczeniu CML (Kolb, Blood 76 (1990), 2462), jest mniej skuteczna w leczeniu po przeszczepie nawrotów ALL (Loren, BMT 41 (2008), 483) i często prowadzi do rozwinięcia się GvHD. [0014] Farmaceutyczne i medyczne metody według tego wynalazku zapewniają nowe podejście do indukowania GvL bez GvHD. To podejście polega na aktywacji in vivo limfocytów pochodzących od dawcy po HSCT z zastosowaniem niskich dawek bispecyficznego przeciwciała jednołańcuchowego skierowanego przeciw CD19 i CD3, angażującego komórki T, które kieruje limfocyty T przeciw komórkom blastycznym CD19+ ALL pacjenta. To przeciwciało wykazywało imponującą aktywność przeciwchłoniakową i przeciwbiałaczkową w sytuacjach autologicznych, ale nigdy nie testowano go w przypadkach nawracających pediatrycznych ALL po HSCT. Dwóch pacjentów pediatrycznych opisanych w poniższych przykładach miało nawrót swojej ALL po HSCT od dopasowanego niespokrewnionego dawcy lub dawcy haploidentycznego i byli oporni na chemioterapię. Pacjenci ci wykazali znakomitą odpowiedź przeciwbiałaczkową po rozpoczęciu leczenia i stali się negatywni pod względem MRD, przy braku jakichkolwiek objawów GvHD. Immunologiczne działanie bispecyficznego przeciwciała jednołańcuchowego skierowanego przeciw CD19 i CD3 jest niezależne od prezentacji antygenu białkowego, i to jest najprawdopodobniej przyczyna tego, że pomimo intensywnej ekspansji komórek T pochodzących od dawcy in vivo, nie następuje indukcja GvHD. Niskie dawki bispecyficznego przeciwciała jednołańcuchowego skierowanego przeciw CD19 i CD3 były wystarczające do eliminacji komórek blastycznych ALL u pacjentów, ponad poziomy wykrywalności MRD. A zatem, sposób

10 9 działania tego przeciwciała polegający na angażowaniu komórek T bardzo różni się od konwencjonalnych przeciwciał, które wymagają dużo wyższych dawek i, które nie mogą angażować komórek T za pośrednictwem swojej części Fc cząsteczki przeciwciała, ze względu na brak receptorów Fc na komórkach T. Za pośrednictwem bispecyficznego przeciwciała jednołańcuchowego skierowanego przeciw CD19 i CD3, wysoce skuteczne komórki efektorowe T mogą stawać się cytotoksyczne wobec komórek blastycznych ALL, bez indukowania alloreaktywnej odpowiedzi immunologicznej, której wynikiem jest GvHD. Twórcy wynalazku zdecydowali się przeprowadzić drugi allogeniczny HSCT od haploidentycznego dawcy u pacjenta 1 po tym jak stał się negatywny pod względem MRD. Do tej pory (listopad 2009), pacjent ten jest nadal negatywny pod względem MRD. [0015] Na podstawie tych początkowych doświadczeń klinicznych z tymi dwoma pacjentami z nawrotem opornej na chemioterapię ALL po przeszczepie, można wnioskować, że bispecyficzne przeciwciało jednołańcuchowe skierowane przeciw CD19 i CD3 może indukować imponującą całkowitą remisję bez GvHD. Dlatego też, leczenie za pomocą bispecyficznego przeciwciała jednołańcuchowego skierowanego przeciw CD19 i CD3 przed przeszczepem w celu immunologicznego zmniejszenia obciążenia białaczką i leczenie nawrotów po przeszczepie oferuje nową szansę terapeutyczną dla pacjentów pediatrycznych z zaawansowaną ALL. [0016] Metody według tego wynalazku posiadają następujące główne zalety: 1. Jak wykazano w poniższych przykładach, podawanie bispecyficznego przeciwciała jednołańcuchowego skierowanego

11 10 przeciw CD19 i CD3 można stosować do leczenia pediatrycznej ostrej białaczki limfoblastycznej (ALL), która jest nawrotem i/lub jest oporna. Bispecyficzne przeciwciało jednołańcuchowe skierowane przeciw CD19 i CD3 może nie tylko zastępować konwencjonalnie terapie pediatrycznej ostrej białaczki limfoblastycznej (ALL) (takie jak chemioterapia) u pacjentów pediatrycznych nie kwalifikujących się do allogenicznego przeszczepu komórek macierzystych. Można je także stosować do zmiany statusu pediatrycznych pacjentów z ALL, kwalifikujących się do przeszczepu, na negatywny pod względem MRD. Ten aspekt wynalazku jest ważny dlatego, że w przypadku pacjentów negatywnych pod względem MRD istnieje mniejsze ryzyko nawrotu po przeszczepie, niż w przypadku pacjentów pozytywnych pod względem MRD. W najlepszym przypadku, leczenie pediatrycznej ALL z zastosowaniem bispecyficznego przeciwciała jednołańcuchowego skierowanego przeciw CD19 i CD3 powoduje, że chemioterapia i/lub HSCT są zbędne. 2. Wiadomo, że w przypadku pacjentów pediatrycznych z chorobą morfologiczną lub przewlekle występującymi poziomami MRD>10-4 blastycznych komórek białaczkowych, istnieje bardzo wysokie ryzyko nawrotu i są bardzo złe rokowania (Bader i in., J Clin Oncol. 27 (2009), str ). Dzieci leczone z zastosowaniem bispecyficznego przeciwciała jednołańcuchowego skierowanego przeciw CD19 i CD3 wykazywały znakomitą odpowiedź przeciwbiałaczkową po rozpoczęciu leczenia i stawały się negatywne pod względem MRD podczas leczenia, przy braku jakichkolwiek objawów GvHD. Dlatego też metody farmaceutyczne według wynalazku zapewniają podejście terapeutyczne do leczenia, łagodzenia

12 11 lub eliminacji MRD w pediatrycznej ALL, dzięki czemu zmniejsza się lub znosi dla pacjenta ryzyko wystąpienia nawrotu. Potencjał leczniczy allogenicznego HSCT zależy od poziomu MRD przed przeszczepem. Leczenie za pomocą bispecyficznego przeciwciała jednołańcuchowego skierowanego przeciw CD19 i CD3 można stosować do zmiany statusu pacjentów pediatrycznych wysokiego ryzyka na status negatywny pod względem MRD. Zgodnie z tym, MRD w opornej dziecięcej ALL można leczyć po raz pierwszy stosując bispecyficzne przeciwciało jednołańcuchowe skierowane przeciw CD19 i CD3. 3. Metody farmaceutyczne według wynalazku wykazują nie tylko silny efekt przeciwbiałaczkowy, ale są również mniej toksyczne i powodują mniej skutków ubocznych, niż konwencjonalne terapie pediatrycznej ALL, obejmujące chemioterapię i/lub allogeniczny HSCT. Do tej pory nie obserwowano żadnych długoterminowych skutków ubocznych po leczeniu za pomocą bispecyficznego jednołańcuchowego przeciwciała skierowanego przeciw CD19 i CD3. W przeciwieństwie do tego, konwencjonalne terapie pediatrycznej ALL są bardzo agresywne i dlatego też wiążą się ze znaczącym ryzykiem dla zdrowia pacjentów pediatrycznych. Ponadto, donoszono o późnych skutkach po konwencjonalnej terapii ALL w dzieciństwie (patrz np. Hudson MM, Late complications after leukemia therapy. W: Childhood Leukemias, C-H Pui red. Cambridge: Cambridge University Press; 2006, str ; Schmoll, Höffken, Possinger: Kompendium Internistische Onkologie, S ff.; 4. Auflage, Springer Medizin Verlag Heidelberg;

13 12 s/healthprofessional). W rzeczywistości, konwencjonalne sposoby leczenia pediatrycznej ALL wykorzystują schematy leczenia nawet bardziej agresywne, niż podejścia stosowane w przypadku ALL dorosłych. Jednakże, jak wynika na podstawie około 25% wskaźnika nawrotów w pediatrycznej ALL, nawet te agresywne terapie nie są wystarczające do ostatecznego wyleczenia wszystkich pacjentów. W świetle tego, jest nawet bardziej zaskakujące, że leczenie pacjentów pediatrycznych z oporną i/lub nawracającą ALL za pomocą bispecyficznego jednołańcuchowego przeciwciała skierowanego przeciw CD19 i CD3 jest w stanie zmienić status tych pacjentów na negatywny pod względem MRD, co oferuje nowe szanse terapeutyczne dla takich pacjentów wysokiego ryzyka. Jest to wynik, którego nie można osiągnąć przy konwencjonalnej terapii pediatrycznej, takiej jak chemioterapia i/lub HSCT. 4. Na przykład, u pacjentów ALL Ph+ (bcr/abl) występuje bardzo wysokie ryzyko nawrotu wśród wszystkich pacjentów w obrębie podtypów ALL (patrz poniżej). Chociaż allogeniczny HSCT uważa się obecnie za leczenie z wyboru w przypadku pediatrycznej ALL Ph+, w przybliżeniu u jednej trzeciej pacjentów po przeszczepie pojawia się nawrót. Ponadto, jak przedstawiono bardziej szczegółowo poniżej, u niemowląt (<12 miesięcy) z ALL występuje wyższe ryzyko niepowodzenia konwencjonalnego lub standardowego leczenia ALL, z najgorszym rokowaniem w przypadku tych z rearanżacją genu MLL (t(4;11)). Wyniki przedstawione dla pacjenta 2 w poniższych przykładach i dane uzyskane w powyżej wspomnianych trwających badaniach klinicznych dotyczących leczenia dorosłych pacjentów z ALL (którzy nie otrzymali

14 13 przeszczepu), sugerują, że nawet ALL Ph+ (bcr/abl) oraz ALL z rearanżacją genu MLL można z powodzeniem leczyć przez podawanie bispecyficznego przeciwciała jednołańcuchowego skierowanego przeciw CD19 i CD3. Podawanie bispecyficznego przeciwciała jednołańcuchowego skierowanego przeciw CD19 i CD3 oferuje dlatego nowe podejście terapeutyczne w przypadku pediatrycznych ALL Ph+ lub ALL z translokacją t(4;11), szczególnie dla pacjentów pediatrycznych z ALL z minimalną chorobą resztkową (MRD). Minimalną chorobę resztkową (MRD) definiuje się np. przez PCR lub analizę FACS. 5. Ze względu na ich bardzo wysoką aktywność cytotoksyczną, jedynie niskie dawki bispecyficznego przeciwciała jednołańcuchowego skierowanego przeciw CD19 i CD3 są wystarczające do udanego leczenia pediatrycznej ALL, które umożliwiają eliminację komórek białaczkowych nawet w szpiku kostnym. 6. Krótszy czas leczenia za pomocą bispecyficznego przeciwciała jednołańcuchowego skierowanego przeciw CD19 i CD3 w porównaniu z konwencjonalną terapią pediatrycznej ALL. Konwencjonalna chemioterapia przy pediatrycznej ALL trwa zazwyczaj 2 do 3 lat, podczas gdy można było obserwować bardzo szybką odpowiedź na bispecyficzne przeciwciało jednołańcuchowe skierowane przeciw CD19 i CD3 u pacjentów pediatrycznych przedstawionych w poniższych przykładach. Ponadto, odpowiedź jest długotrwała: u pacjenta 1 status negatywny pod względem MRD utrzymywał się dłużej niż 12 miesięcy po przeszczepie; patrz poniższe przykłady.

15 14 7. U pediatrycznych pacjentów z nawrotem ALL często występuje choroba oporna na chemioterapię i pacjenci ci są bardzo wrażliwi na toksyczność związaną z chemioterapią. Dla tych pacjentów, leczenie za pomocą bispecyficznego przeciwciała jednołańcuchowego skierowanego przeciw CD19 i CD3 zapewnia po raz pierwszy nie-chemioterapeutyczną i mniej toksyczną strategię do indukowania remisji u takich pacjentów. 8. Jak stwierdzono w powyżej opisanym, trwającym badaniu klinicznym u dorosłych pacjentów z ALL, leczenie za pomocą bispecyficznego przeciwciała jednołańcuchowego skierowanego przeciw CD19 i CD3, spowodowało eliminację opornych na chemioterapię komórek białaczkowych u dorosłych MRDpozytywnych pacjentów z ALL CD19+, którzy nie otrzymali przeszczepu. Chociaż u tych pacjentów zaangażowane cytotoksyczne komórki T pochodzą od pacjenta, nie ma do tej pory danych dotyczących stosowania bispecyficznego przeciwciała jednołańcuchowego skierowanego przeciw CD19 i CD3 po allogenicznym HSCT w układzie, gdzie angażowane komórki T pochodzą od dawcy. W tym opisie, twórcy wynalazku po raz pierwszy donoszą o silnej indukcji efektu GvL, przy braku GvHD, przy czym indukcja zachodzi pod wpływem bispecyficznego przeciwciała jednołańcuchowego skierowanego przeciw CD19 i CD3 angażującego komórki T pochodzące od dawcy, u dwóch pediatrycznych pacjentów z nawrotem opornej na chemioterapię ALL CD19+ po allogenicznym HSCT. [0017] Podsumowując, leczenie z zastosowaniem bispecyficznego przeciwciała jednołańcuchowego skierowanego przeciw CD19 i CD3 zapewnia nową i ulepszoną terapię pediatrycznej ALL, w szczególności opornej i/lub nawracającej pediatrycznej ALL.

16 15 [0018] W korzystnym wykonaniu metod farmaceutycznych według wynalazku, pediatryczna lub dziecięca ostra białaczka limfoblastyczna (ALL) jest pediatryczną ALL wywodzącą się z komórek B, korzystnie pediatryczną ostrą białaczką limfoblastyczną ALL z komórek prekursowych B, korzystniej pediatryczną ALL z komórek pro-b, ALL z komórek pre-b, lub powszechną ALL (call). Nawet jeszcze korzystniejszą niż pediatryczna ALL z komórek prekursorowych B jest powszechna ALL (call). [0019] Zdecydowaną większość przypadków pediatrycznej lub dziecięcej ALL (>85%) stanowi fenotyp z prekursorowych komórek B (Schultz i in., Blood 109 (2007): ). Ponieważ bispecyficzne przeciwciało jednołańcuchowe skierowane przeciw CD19 i CD3 opisane w tym opisie jest skierowane przeciw markerowi CD19, związanemu z komórkami B, wspomniane przeciwciało jest szczególnie odpowiednie jako czynnik terapeutyczny ostrej białaczki limfoblastycznej wywodzącej się z komórek B, korzystniej pediatrycznej ALL z komórek prekursorowych B. Pediatryczną ALL z komórek prekursorowych B można dalej podzielić na pediatryczną ALL z komórek pro-b, ALL z komórek pre-b i powszechną ALL (call) (patrz np. Behm F.G., Immunophenotyping. W: Childhood Leukemias, C-H Pui red. Cambridge: Cambridge University Press; 2006, str ). Przegląd na temat pediatrycznej ostrej białaczki limfoblastycznej (ALL), obejmującej pediatryczną ostrą białaczkę limfoblastyczną z komórek prekursorowych B i inne typy pediatrycznych ALL wywodzących się z komórek B, oraz ich leczenia można znaleźć np. w Pui CH, Clin Adv Hematol Oncol. 4 (2006): 884-6; Pui CH, Evans WE, N Engl J Med 354 (2006): ; Pui CH i in., Lancet

17 (2008): ; Pui CH, Jeha S, Nat Rev Drug Discov 6 (2007): ). Kolejne informacje odnoszące się do pediatrycznych ALL można również znaleźć np. na stronach lub [0020] Z historycznego punktu widzenia, Pediatric Oncology Group (POG) i Children s Cancer Group (CCG) przyjęła wspólny zestaw kryteriów ryzyka na międzynarodowej konferencji wspieranej przez National Cancer Institute (Smith M, i in., J Clin Oncol 14 (1996), 18-24), w 1993 roku. Kryteria NCI opierały się na czynnikach, które miały międzynarodową akceptację i powtarzalność: wiek, początkowa liczba białych krwinek (WBC) oraz obecność choroby pozaszpikowej w momencie rozpoznania. W celu dalszego dopracowania terapii, zarówno POG jak i CCG wykorzystywały również dodatkowe czynniki ryzyka, które jak się okazało mają wpływ na rokowanie pacjentów (np. liczba chromosomów, kariotyp komórek blastycznych i wczesna odpowiedź morfologiczna). W 2000 roku, CCG oraz POG połączyły się, tworząc Children s Oncology Group (COG). To połączenie pozwoliło na analizę danych klinicznych, biologicznych i wczesnego reagowania, prognostycznych dla przeżycia wolnego od zdarzeń (EFS) w ostrej białaczce limfoblastycznej (ALL), w celu opracowania nowego systemu klasyfikacji i algorytmu leczenia. Spośród dzieci (w wieku od 1 do 21,99 lat) z nowo rozpoznaną ALL z komórek prekursorowych B, kolejno zarejestrowanych przez CCG (od grudnia 1988 roku do sierpnia 1995 roku, n = 4986) i POG (od stycznia 1986 roku do listopada 1999 roku, n = 6793), w badaniach retrospektywnych przeanalizowano 6238 pacjentów (CCG, 1182; POG, 5056), na podstawie informacyjnych danych cytogenetycznych (Schultz i in Blood 109 (2007): ).

18 17 Zdefiniowano cztery grupy ryzyka, takie jak, bardzo wysokiego ryzyka (VHR; 5-letnia EFS, 45% lub mniej), mniejszego ryzyka (5-letnia EFS, co najmniej 85%), oraz standardowego i wysokiego ryzyka (tych pozostających w odpowiadających grupach ryzyka National Cancer Institute [NCI]). Kryteria VHR obejmowały ekstremalną hipodiploidalność (mniej niż 44 chromosomy), t(9;22) i/lub BCR/ABL, oraz indukcję uszkodzeń. Pacjenci z mniejszym ryzykiem, mieścili się w standardowym ryzyku według NCI, z albo t(12;21) (TEL/AML1) albo jednoczesnymi trisomiami chromosomów 4, 10 i 17. Nawet przy różnicach w leczeniu, występowała duża zgodność między analizami CCG oraz POG. Schemat klasyfikacji ryzyka COG stosuje się do podziału na grupy ryzyka w obrębie ALL z komórek prekursorowych B: niższego ryzyka (27%), standardowego ryzyka (32%), wysokiego ryzyka (37%) i bardzo wysokiego ryzyka (4%), na podstawie wieku, liczby białych krwinek (WBC), cytogenetyki, 14-dniowej odpowiedzi szpiku kostnego i końca indukcji minimalnej choroby resztkowej (MRD) określanych przez cytometrię przepływową w badaniach COG. [0021] Obecnie, ustalanie leczenia opierające się na ryzyku stosuje się w przypadku dziecięcej lub pediatrycznej ostrej białaczki limfoblastycznej (ALL). To podejście umożliwia leczenie dzieci, które historycznie miały dobre wyniki, z zastosowaniem umiarkowanej terapii i oszczędzenie im bardziej intensywnego i toksycznego leczenia, a dzieci z historycznie niższym prawdopodobieństwem długoterminowego przeżycia z zastosowaniem bardziej intensywnej terapii, która może zwiększyć ich szanse na wyleczenie. Stwierdzono, że w momencie diagnozy starsze dzieci i młodzież ( 10 lat) oraz niemowlęta (<12 miesięcy) mają mniej korzystne wyniki, niż

19 18 dzieci w wieku od 1 do 9 lat, i w przypadku tych pacjentów stosuje się na ogół bardziej agresywne leczenie (Nachman J, Br J Haematol 130 (2005): ). Leczenie z zastosowaniem bispecyficznego przeciwciała jednołańcuchowego skierowanego przeciw CD19 i CD3 zapewnia teraz ulepszoną, mniej toksyczną terapię dla takich populacji pacjentów pediatrycznych, tj. starszych dzieci i młodzieży ( 10 lat) oraz niemowląt (<12 miesięcy), wykazujących mniej korzystne wyniki przy zastosowaniu konwencjonalnej terapii ALL, takiej jak chemioterapia i/lub HSCT. [0022] Skuteczne leczenie dzieci z ALL wymaga kontrolowania choroby układowej (np., szpiku kostnego, wątroby i śledziony, węzłów chłonnych), jak również zapobiegania lub leczenia choroby pozaszpikowej, w szczególności ośrodkowego układu nerwowego (CNS). Tylko u 3% pacjentów stwierdza się w momencie diagnozy wykrywalne zajęcie OUN przy stosowaniu konwencjonalnych kryteriów ( 5 WBC/mikrolitr z obecnością komórek limfoblastycznych). O ile specyficzna terapia nie jest ukierunkowana na OUN, u 50% do 70% lub więcej dzieci może ewentualnie rozwinąć się jawna białaczka OUN. Dlatego też, obecnie zaleca się, aby wszystkie dzieci z ALL otrzymywały układową kombinację chemioterapii razem z jakąś formą profilaktyki OUN. Obecnie, większość grup leczy pacjentów z udokumentowaną białaczką OUN w momencie diagnozy (>5 WBC/ l z komórkami blastycznymi; CNS3), oraz tych z fenotypem komórek T i wysoką liczbą WBC w momencie diagnozy, stosując terapię dokanałową, a następnie naświetlanie czaszki. Zgodnie z tym, leczenie za pomocą bispecyficznego przeciwciała jednołańcuchowego skierowanego przeciw CD19 i

20 19 CD3 przeprowadza się korzystnie w połączeniu z profilaktyką OUN, taką jak terapia dokanałowa i/lub naświetlania czaszki. [0023] Konwencjonalne lub standardowe leczenie dla dzieci z ALL podzielone jest na etapy: indukcja remisji, konsolidacja lub intensyfikacja, oraz terapia podtrzymująca (lub kontynuacja terapii), z terapią ochronną OUN generalnie zapewnioną na każdym etapie. Fazę intensyfikacji terapii po indukcji remisji stosuje się u wszystkich pacjentów. Intensywność obydwu terapii, indukcyjnej i poindukcyjnej, określa się na podstawie klinicznych i biologicznych czynników prognostycznych stosowanych do ustalania leczenia w oparciu o ryzyko i ocenę niektórych typów wczesnej odpowiedzi. Ta ocena może obejmować procent komórek blastycznych w szpiku kostnym w dniu 7 i/lub 14, liczbę komórek blastycznych w krwi obwodowej w dniu 8, i określanie minimalnej choroby resztkowej w szpiku kostnym i/lub krwi obwodowej podczas lub pod koniec indukcji (Pui CH, Evans WE, N Engl J Med 354 (2006): ). Czas trwania terapii dla dzieci z ALL pozostaje w zakresie pomiędzy 2 a 3 lata. W przeciwieństwie do tego, można obserwować bardzo szybką odpowiedź u pacjentów pediatrycznych na bispecyficzne przeciwciało jednołańcuchowe skierowane przeciw CD19 i CD3, jak przedstawiono w poniższych przykładach. Ponadto, pacjent 1 jest MRD-negatywny do tej pory (listopad 2009), co wskazuje, że można osiągnąć długotrwałe wyleczenie. [0024] Podgrupy pacjentów, którzy mają złe rokowania według obecnych standardów lub konwencjonalnego leczenia mogą wymagać innego leczenia. Na przykład, u niemowląt z ALL występuje wyższe ryzyko niepowodzenia terapeutycznego, z najgorszym rokowaniem dla tych z rearanżacją genu MLL

21 20 (Rubnitz JE, i in.: Blood 84 (1994): 570-3; Biondi A, i in., Blood 96 (2000): 24-33; Pui CH, i in., Lancet 359 (2002): ; Silverman LB, i in.: Cancer 80 (1997): ). Dzieci te leczy się na ogół zgodnie ze schematem zaprojektowanym specjalnie dla niemowląt (Silverman, i in., (1997), loc. cit., Chessells JM, i in., J Haematol 117 (2002): ; Reaman GH, i in., J Clin Oncol 17 (1999): ; Pieters R, i in., Lancet 370 (2007): ). Obecne schematy dla niemowląt wykorzystują podejścia ze zintensyfikowanym leczeniem i mogą oferować lepsze kontrolowanie choroby w porównaniu z wcześniejszymi mniej intensywnymi podejściami, ale długoterminowy wynik i toksyczność są nieznane (Reaman (1999), loc. cit.; Pieters (2007), loc. cit.; Kosaka Y, i in., Blood 104 (2004): ; Hilden JM, i in., Blood 108 (2006): ). W przypadku niektórych dzieci (starszych niż 1 rok) z ALL prawdopodobieństwo długotrwałej remisji przy stosowaniu aktualnych terapii wynosi 50% (np., ALL z t[9;22] i dodatnia pod względem chromosomu Philadelphia, pacjentów hipodiploidalnych oraz tych z początkowym niepowodzeniem indukcji). Dla tych pacjentów rozważa się podczas pierwszej remisji, allogeniczny przeszczep szpiku kostnego od rodzeństwa dopasowanego pod względem antygenu ludzkich leukocytów (HLA) (Snyder DS, i in., Leukemia 13 (1999): ; Aricň M, i in., N Engl J Med 342 (2000): ; Schrauder A, i in., J Clin Oncol 24 (2006): ). Jednakże, przeszczep od dawcy będącego rodzeństwem dopasowanym pod względem HLA, nie okazał się być korzystny u pacjentów ocenionych jako wysokiego ryzyka wyłącznie na

22 21 podstawie liczby WBC, płci i wieku (Ribera JM, i in., J Clin Oncol 25 (2007): 16-24). [0025] Ponieważ mielosupresja i uogólniona immunosupresja są przewidywaną konsekwencją zarówno białaczki jak i jej leczenia z zastosowaniem chemioterapii, pacjenci muszą być monitorowani podczas konwencjonalnego leczenia pediatrycznej ALL. Odpowiednie udogodnienia muszą być natychmiast dostępne zarówno dla wsparcia hematologicznego jak i leczenia powikłań zakaźnych i innych, we wszystkich fazach leczenia białaczki. W przybliżeniu 1% pacjentów umiera podczas terapii indukcyjnej, a kolejne 1% do 3% umiera podczas pierwszej remisji z powodu powikłań związanych z leczeniem (Christensen MS, i in., Br J Haematol 131 (2005): 50-8). [0026] Leczenie z zastosowaniem bispecyficznego przeciwciała jednołańcuchowego skierowanego przeciw CD19 i CD3 zapewnia alternatywną i mniej toksyczną terapię dla pediatrycznej ALL, w szczególności opornej i/lub nawracającej pediatrycznej ALL. Wspomniane leczenie pozwala uniknąć wad konwencjonalnych terapii dziecięcej ALL, takich jak niepowodzenie leczenia, toksyczność i długotrwałe skutki uboczne. Dlatego też jest ono wysoce skuteczną, ale mniej toksyczną i ryzykowną dla zdrowia alternatywą dla chemioterapii i/lub allogenicznego HSCT. [0027] A zatem, w kolejnym wykonaniu metod farmaceutycznych według wynalazku, wspomniana ostra białaczka limfoblastyczna (ALL) jest oporną i/lub nawracającą ALL. [0028] Pediatryczna ALL może być oporna na chemioterapię lub allogeniczny przeszczep hematopoetycznych komórek macierzystych (HSCT) bądź na chemioterapię i allogeniczny przeszczep hematopoetycznych komórek macierzystych (HSCT).

23 22 ALL może być nawracającą ALL lub nawracającą ALL oporną na konwencjonalną terapię ALL, obejmującą chemioterapię i/lub allogeniczny przeszczep hematopoetycznych komórek macierzystych (HSCT). Jednakże, w zakres wynalazku wchodzi również ALL, która jest nowo zdiagnozowaną ALL. W tym układzie, leczenie za pomocą bispecyficznego przeciwciała jednołańcuchowego skierowanego przeciw CD19 i CD3 można stosować jako pierwszą (pierwszej linii) terapię, albo samą, albo w kombinacji z HSCT. [0029] Termin oporna pediatryczna ALL jak stosuje się w tym opisie oznacza oporność pediatrycznej ALL na konwencjonalną lub standardową terapię pediatrycznej ALL, taką jak chemioterapia i/lub HSCT. Obecnie, wskaźnik nawrotów w pediatrycznej ALL wynosi około 25%. Innymi słowy: Konwencjonalna lub standardowa terapia pediatrycznej ALL nie jest w stanie zapewnić ostatecznego wyleczenia wszystkim pacjentom pediatrycznym. [0030] Termin nawrót pediatrycznej ALL, jak stosuje się w tym opisie, oznacza powrót oznak i objawów choroby ALL, po okresie remisji u pacjenta pediatrycznego. Na przykład, po konwencjonalnym leczeniu ALL z zastosowaniem chemioterapii i/lub HSCT, pacjent pediatryczny z ALL może wejść w remisję bez żadnych oznak lub objawów ALL, pozostawać w remisji przez parę lat, ale następnie może wystąpić u niego nawrót i musi być znów leczony z powodu ALL. [0031] Pacjenci pediatryczni z nawrotem ALL często mają chorobę oporną na chemioterapię. Pacjenci ci są bardzo wrażliwi na toksyczność związaną z chemioterapią, której można uniknąć stosując leczenie za pomocą bispecyficznego

24 23 przeciwciała jednołańcuchowego skierowanego przeciw CD19 i CD3. [0032] Termin terapia standardowa lub terapia konwencjonalna, jak stosuje się w tym opisie, odnosi się do terapii pediatrycznej ALL z zastosowaniem chemioterapii i/lub HSCT. Przegląd na temat pediatrycznej ostrej białaczki limfoblastycznej (ALL), obejmującej pediatryczną ostrą białaczkę limfoblastyczną z komórek prekursorowych B, i innych typów pediatrycznej ALL wywodzących się z linii komórek B, oraz ich leczenia można znaleźć np. w Pui CH, Clin Adv Hematol Oncol. 4 (2006): 884-6; Pui CH, Evans WE, N Engl J Med 354 (2006): ; Pui CH i in., Lancet 371 (2008): ; Pui CH, Jeha S, Nat Rev Drug Discov 6 (2007): ); Henze G, von Stackelberg A, Relapsed acute lymphoblastic leukemia. W: Childhood Leukemias, C-H Pui red. Cambridge: Cambridge University Press; 2006, str ). Dalsze informacje odnoszące się do pediatrycznej ALL można również znaleźć np. na stronach lub [0033] Terminy bispecyficzne przeciwciało jednołańcuchowe lub jednołańcuchowe przeciwciało bispecyficzne lub zbliżone terminy, zgodnie z tym wynalazkiem oznaczają konstrukty przeciwciał powstające w wyniku połączenia co najmniej dwóch regionów zmiennych przeciwciała w pojedynczy łańcuch polipeptydowy pozbawiony części stałej(łych) i lub Fc obecnych w pełnych immunoglobulinach. Bispecyficzne przeciwciało jednołańcuchowe, jak określa się w tym opisie, jest funkcjonalne, tj. aktywne cytotoksycznie, jako monomer i dlatego też łatwo odróżnialne od opisanych w nauce diciał lub tzw. tand-abs, które są funkcjonalne jedynie jako dimery lub

25 24 multimery. Łącznik, jak stosuje się w tym opisie, łączy domeny V o tej samej specyficzności, podczas gdy odstępnik, jak stosuje się w tym opisie, łączy domeny V o różnej specyficzności. Na przykład, bispecyficzne przeciwciało jednołańcuchowe może być konstruktem zawierającym w całości dwa regiony zmienne przeciwciała, na przykład dwa regiony V H, każdy zdolny do specyficznego wiązania z oddzielnym antygenem i połączone jeden z drugim przez krótki (zazwyczaj mniej niż 10-cio aminokwasowy) syntetyczny polipeptydowy odstępnik tak, że dwa regiony zmienne przeciwciała z umieszczonym między nimi odstępnikiem występują jako pojedynczy ciągły łańcuch polipeptydowy. Innym przykładem bispecyficznego przeciwciała jednołańcuchowego może być pojedynczy łańcuch polipeptydowy z trzema regionami zmiennymi. W tym wypadku, dwa regiony zmienne przeciwciała, na przykład jeden V H i jeden V L, mogą tworzyć scfv, w którym dwa regiony zmienne przeciwciała są połączone ze sobą przez syntetyczny łącznik polipeptydowy, przy czym ten ostatni jest często przygotowany technikami inżynierii genetycznej tak, aby był minimalnie immunogenny ale zachowywał maksymalną oporność na proteolizę. Ten scfv jest zdolny do specyficznego wiązania z określonym antygenem i jest połączony z kolejnym regionem zmiennym przeciwciała, na przykład regionem V H, zdolnym do wiązania z innym antygenem niż jest wiązany przez scfv. Jeszcze kolejnym przykładem bispecyficznego przeciwciała jednołańcuchowego może być jednołańcuchowy polipeptyd z czterema regionami zmiennymi. W tym wypadku, pierwsze dwa regiony zmienne, na przykład region V H i region V L, mogą tworzyć jeden scfv zdolny do wiązania jednego antygenu, podczas gdy drugi region V H i region V L mogą tworzyć drugi scfv zdolny do wiązania z

26 25 innym antygenem. W obrębie pojedynczego ciągłego łańcucha polipeptydowego, indywidualne regiony zmienne o jednej specyficzności mogą korzystnie być oddzielone przez syntetyczny łącznik polipeptydowy jak opisano powyżej, podczas gdy odpowiednie scfvs mogą korzystnie być rozdzielone przez krótkie odstępniki polipeptydowe, jak opisano powyżej. Nieograniczające przykłady bispecyficznych przeciwciał jednołańcuchowych, jak również metody ich wytwarzania są przedstawione w WO 99/54440, WO 2004/106381, WO 2007/068354, Mack, J. Immunol. (1997), 158, ; Mack, PNAS, (1995), 92, ; Kufer, Cancer Immunol. Immunother., (1997), 45, 193-7; Löffler, Blood, (2000), 95, 6, ; Brühl, J. Immunol., (2001), 166, [0034] Jak stosuje się w tym opisie, CD3 oznacza antygen, który ulega ekspresji na komórkach T, korzystnie ludzkich komórkach T, jako część wielocząsteczkowego kompleksu receptorów komórek T, przy czym CD3 składa się z pięciu różnych łańcuchów: CD3-epsilon, CD3-gamma, CD3-delta, CD3-eta i CD3 zeta. Gromadzenie się CD3 na komórkach T np. przez przeciwciała skierowane przeciw CD3 prowadzi do aktywacji komórek T podobnej do wiązania antygenu, ale niezależnej od klonalnej specyficzności podgrupy komórek T. A zatem, termin bispecyficzne przeciwciało jednołańcuchowe skierowane przeciw CD19 i CD3, jak stosuje się w tym opisie, dotyczy konstruktu specyficznego wobec CD3, zdolnego do wiązania się z ludzkim kompleksem CD3 ulegającym ekspresji na ludzkich komórkach T i zdolnego do indukowania eliminacji/lizy komórek docelowych, przy czym takie komórki decelowe niosą/prezentują antygen, który jest wiązany przez inną, nie wiążącą CD3 część bispecyficznego przeciwciała jednołańcuchowego. Wiązanie

27 26 kompleksu CD3 przez czynniki wiążące specyficzne wobec CD3 (np. bispecyficzne przeciwciało jednołańcuchowe, jak podaje się zgodnie z metodami farmaceutycznymi według wynalazku) prowadzi, jak wiadomo w nauce, do aktywacji komórek T; patrz, np. WO 99/54440 lub WO 2007/ Zgodnie z tym, konstrukt odpowiedni dla metod farmaceutycznych według wynalazku jest korzystnie zdolny do eliminacji/lizy komórek docelowych In vivo i/lub in vitro. Odpowiadające komórki docelowe obejmują komórki, w których zachodzi ekspresja antygenu nowotworowego, takiego jak CD19, który jest rozpoznawany dzięki drugiej specyficzności (tj. części bispecyficznego przeciwciała jednołańcuchowego nie wiążącej CD3) wymienionego konstruktu. Korzystnie, wspomniana druga specyficzność dotyczy ludzkiego CD19, który opisano już w WO 99/54440, WO 2004/ lub WO 2007/ Zgodnie z tym wykonaniem, każda specyficzna wobec antygenu część bispecyficznego przeciwciała jednołańcuchowego zawiera region V H przeciwciała i region V L przeciwciała. Korzystne warianty tego bispecyficznego jednołańcuchowego przeciwciała zawierają od końca N do końca C: V L (CD19)-V H (CD19)-V H (CD3)-V L (CD3). [0035] W rozumieniu wynalazku, termin specyficzne wiązanie lub zbliżone terminy, takie jak specyficzność należy rozumieć jako charakteryzowane głównie przez dwa parametry: parametr jakościowy (epitop wiązania, czyli gdzie przeciwciało się wiąże) oraz parametr ilościowy (powinowactwo wiązania, czyli jak silnie wiąże się przeciwciało jeśli to robi). Jaki epitop jest wiązany przez przeciwciało można korzystnie określać stosując np. metodologię FACS, ELISA,

28 27 mapowanie epitopów przez spot peptydów lub spektroskopię masową. Siłę wiązania przeciwciała z określonym epitopem można korzystnie określać stosując np. znane metodologie Biacore i/lub ELISA. Kombinacje takich technik umożliwiają obliczanie stosunku sygnał : szum, jako reprezentatywnego pomiaru specyficzności wiązania. W takim stosunku sygnał:szum, sygnał odpowiada sile wiązania przeciwciała z epitopem, który jest przedmiotem zainteresowania, podczas gdy szum odpowiada sile wiązania przeciwciała z innymi, niezbliżonymi epitopami, różniącymi się od epitopu będącego przedmiotem zainteresowania. Stosunek sygnał : szum wynoszący, na przykład co najmniej 50, ale korzystnie około 80 dla odpowiedniego epitopu będącego przedmiotem zainteresowania, jak określono np. stosując Biacore, ELISA lub FACS można uznać jako wskazanie, że oceniane przeciwciało wiąże epitop będący przedmiotem zainteresowania w specyficzny sposób, tj. jest specyficznym czynnikiem wiążącym. Termin wiążący się z/oddziaływujący z może również dotyczyć epitopu konformacyjnego, epitopu strukturalnego lub epitopu nieciągłego składającego się z dwóch regionów ludzkich cząsteczek docelowych lub ich części. Epitop konformacyjny jest zdefiniowany przez dwie lub więcej odrębnych sekwencji aminokwasowych oddzielonych w sekwencji pierwszorzędowej, które zbliżają się do siebie na powierzchni cząsteczki, gdy polipeptyd ulega sfałdowaniu do natywnego białka (Sela, (1969) Science 166, 1365 oraz Laver, (1990) Cell 61, 553-6). Termin epitop nieciągły oznacza epitopy nieliniowe, które składają się z reszt pochodzących z odległych części łańcucha polipeptydowego. Reszty te łączą się na powierzchni cząsteczki, gdy łańcuch polipeptydowy ulega sfałdowaniu do

29 28 struktury trójwymiarowej, tworząc epitop konformacyjny/ strukturalny. [0036] Termin leczenie, jak stosuje się w tym opisie, oznacza w najszerszym znaczeniu procedury lub zastosowania medyczne, które mają złagodzić chorobę. W tym przypadku, podawanie bispecyficznego przeciwciała jednołańcuchowego skierowanego przeciw CD19 i CD3 (przygotowane do podawania pediatrycznym pacjentom z ALL), jak opisano w tym opisie, ma na celu leczenie, łagodzenie lub eliminację choroby, pediatrycznej ALL. [0037] Termin łagodzenie, jak stosuje się w tym opisie, jest synonimem poprawy. Jeśli stan pacjentów pediatrycznych z ALL wykazuje polepszenie, pacjent jest wyraźnie w lepszym stanie jest pewna poprawa w jej lub jego stanie klinicznym. Na przykład, o poprawie stanu klinicznego pacjentów z ALL można mówić jeśli można osiągnąć stabilizację choroby ALL, tj. choroba ALL nie postępuje dalej. To stadium choroby określa się również chorobą stabilną. Łagodzeniem może być również poprawa statusu MRD pediatrycznych pacjentów z ALL. Na przykład, przed leczeniem z zastosowaniem bispecyficznego przeciwciała jednołańcuchowego skierowanego przeciw CD19 i CD3, u pacjentów pediatrycznych z ALL wykrywalnych może być 100 komórek białaczkowych na 10 4 komórek szpiku kostnego. W wyniku leczenia z zastosowaniem bispecyficznego przeciwciała jednołańcuchowego skierowanego przeciw CD19 i CD3, liczba komórek białaczkowych może zmniejszyć się do 10 komórek białaczkowych lub nawet mniej komórek białaczkowych (np. mniej niż jedna komórka białaczkowa) na 10 4 komórek szpiku kostnego, w tym przykładowym przypadku.

30 29 [0038] Termin eliminacja, jak stosuje się w tym opisie, oznacza usunięcie komórek białaczkowych z organizmu pediatrycznego pacjenta z ALL. Jak przedstawiono w poniższym przykładzie, podawanie bispecyficznego przeciwciała jednołańcuchowego skierowanego przeciw CD19 i CD3 jest zdolne do zmiany statusu pozytywnego pod względem MRD ostrej białaczki limfoblastycznej (ALL) w status negatywny pod względem MRD, tj. status, w których w ogóle nie wykrywa się MRD (<10-4, tj. wykrywalna mniej niż jedna komórka białaczkowa na 10 4 komórek szpiku kostnego). W tym przypadku, osiąga się całkowitą remisję molekularną. [0039] Termin podawanie, jak stosuje się w tym opisie, oznacza podawanie osobnikowi, tj. człowiekowi- pacjentowi pediatrycznemu, terapeutycznie skutecznej dawki powyżej wymienionego bispecyficznego przeciwciała jednołańcuchowego skierowanego przeciw CD19 i CD3 (korzystnie takiego jak przedstawiono w SEQ ID NO.1). Przez terapeutycznie skuteczną ilość rozumie się dawkę, która powoduje efekt, dla którego się ją podaje, tj. wystarczająca do zabicia komórek ostrej białaczki limfoblastycznej. Korzystnie, podawanie dawki bispecyficznego przeciwciała jednołańcuchowego skierowanego przeciw CD19 i CD3 prowadzi do eliminacji wszystkich komórek ostrej białaczki limfoblastycznej z organizmu pacjenta pediatrycznego, czego wynikiem jest status ALL negatywny pod względem MRD, jak zdefiniowano w tym opisie. Dokładna dawka będzie zależała od celu leczenia i będzie możliwa do ustalenia przez specjalistę w tej dziedzinie przy zastosowaniu znanych technik. Schemat dawkowania będzie zależeć od lekarza prowadzącego i czynników klinicznych. Jak wiadomo w naukach medycznych, dawki dla każdego pacjenta

31 30 pediatrycznego zależą od wielu czynników, w tym od wielkości pacjenta, powierzchni ciała, wieku, danego związku, który ma być podawany, płci, czasu i drogi podawania, ogólnego stanu zdrowia i innych leków podawanych równocześnie. [0040] Typowa dawka może, na przykład, pozostawać w zakresie przedstawionym w wykonaniach metod wynalazku i dołączonych przykładach; jednakże, przewiduje się dawki niższe lub wyższe niż przykładowy zakres, zwłaszcza biorąc pod uwagę wyżej wymienione czynniki. [0041] Termin infuzja ciągła dotyczy infuzji, która odbywa się w sposób ciągły w okresie czasu, tj. bez przerw. Infuzja ciągła odnosi się do infuzji podawanej w sposób ciągły. Zgodnie z tym, w kontekście wynalazku, terminy permanentna i ciągła stosuje się jako synonimy. W znaczeniu według wynalazku, np. termin podawanie przez ciągłą infuzję przez (co najmniej) 4 tygodnie lub podobny oznacza sytuację, w której bispecyficzne przeciwciało jednołańcuchowe skierowane przeciw CD19 i CD3, stosowane w metodach farmaceutycznych według wynalazku podaje się w sposób ciągły do organizmu pacjenta przez okres (co najmniej) 4 tygodni w przedłużony, stały sposób przez cały czas wymagany w przypadku środków farmaceutycznych oraz w metodach według wynalazku. Schematy ciągłego podawania bispecyficznego przeciwciała jednołańcuchowego skierowanego przeciw CD19 i CD3 opisano bardziej szczegółowo w WO 2007/ Unika się przerywania wprowadzania bispecyficznego jednołańcuchowego przeciwciała skierowanego przeciw CD19 i CD3, to znaczy, że nie występuje lub zasadniczo nie występuje przejście ze stanu, w którym przeciwciało podaje się do organizmu pacjenta pediatrycznego, do stanu, w którym przeciwciała już się nie podaje przez cały