Chemia medyczna. Antybiotyki informacje ogólne, wyodrębnianie

Transkrypt

1 Chemia medyczna Antybiotyki informacje ogólne, wyodrębnianie

2 Antybiotyki są to wytwarzane przez mikroorganizmy (głównie grzyby lub bakterie) substancje naturalne oraz produkty ich modyfikacji chemicznej lub transformacji mikrobiologicznej bądź syntetyczne analogi, które oddziałując w małym stężeniu wybiórczo na struktury bądź procesy biologiczne, zabijają inne mikroorganizmy (bakterie, grzyby i pierwotniaki) lub hamują ich podstawowe procesy życiowe (wzrost, rozmnażanie itp.). Dzięki takim właściwościom oraz małej toksyczności dla człowieka wykorzystywane są w lecznictwie jako leki przeciwko drobnoustrojom chorobotwórczym. Stanowią największe osiągnięcie medycyny XX w. Skutecznie leczą choroby wywołane przez drobnoustroje, np. gruźlicę, tyfus czy choroby weneryczne; w wielu przypadkach ratowały i ratują życie. Technologia antybiotyków - największym działem współczesnej biotechnologii leków. Na drodze biosyntezy wytwarza się obecnie ponad 50 tys. ton antybiotyków przeznaczonych do lecznictwa ludzi (z tego znaczna część jest modyfikowana chemicznie), około 30 tys. ton dla weterynarii.

3 Choroby bakteryjne - towarzyszą ludzkości od tysiącleci. Identyfikacja bakterii - r holenderski przyrodnik Antoni van Leeuwenhoek Teoria zarazków jako przyczyny chorób II poł. XIX w. - francuski chemik i mikrobiolog Ludwik Pasteur ( ) Nowe nauki bakteriologia, choroby zakaźne - II poł. XIX w. twórcą - łowca mikrobów Robert Koch lekarz niemiecki, potem prof. higieny na uniwersytecie w Berlinie ( ). Identyfikacja mikroorganizmów wywołujących gruźlicę (1882), cholerę, tyfus. W walce z infekcjami - szczepienia. W 1905 r. nagroda Nobla za udowodnienie roli bakterii w szerzeniu się chorób zakaźnych.

4 Chemioterapia zastosowanie środków leczniczych (chemioterapeutyków) przeciwko drobnoustrojom chorobotwórczym, w odróżnieniu od środków leczniczych działających na organizm (farmakoterapeutyków). Przełom XIX i XX wieku, niemiecki lekarz, chemik, bakteriolog Paul Ehrlich ( ) (idea magicznego pocisku ). Chemioterapeutykami są sulfonamidy i antybiotyki, syntetyczne leki przeciwbakteryjne, np. izoniazyd, nifuroksazyd, metronidazol, a dodatkowo - leki przeciwnowotworowe i przeciwbiałaczkowe. Indeks terapeutyczny wskaźnikiem selektywności działania chemioterapeutyku i miarą bezpieczeństwa leku. Jest to stosunek pożądanego do niepożądanego działania leku - stosunek dawki, prowadzącej do toksycznych efektów u 50% badanej populacji zwierząt do poziomu dawki wymaganej dla wywołania efektu terapeutycznego u 50% badanej populacji zwierząt. Im wyższa jest wartość indeksu, tym lek jest bezpieczniejszy.

5 Działanie antybiotyczne - działanie wytwarzanych przez mikroorganizmy związków, polegające na hamowaniu rozmnażania lub zabijaniu innych drobnoustrojów. Selman Waksman mikrobiolog amerykański, noblista (1952), odkrywca streptomycyny (1943) Era antybiotyków od 1928 r., gdy Aleksander Fleming szkocki lekarz i mikrobiolog zaobserwował hamujący wpływ pleśni pędzlaka - grzyba Penicillium notatum - na wzrost hodowli bakterii Staphylococcus. Czynnik produkowany przez pędzlaka, wywołujący to działanie, nazwany: penicillinum synteza pierwszego sulfonamidu. Sulfonamidy - skuteczne w leczeniu ograniczonej liczby infekcji bakteryjnych infekcji dróg moczowych, niektórych chorób, wywoływanych przez pneumokoki i meningokoki biochemik Ernst Chain podjął prace nad penicyliną. We współpracy z Floreyem i eatleyem (Uniwersytet xfordzki) opracował laboratoryjną metodę biosyntezy i wyodrębniania penicyliny G. poprzez ekstrakcję octanem amylu, oraz osiągnął liofilizat penicyliny. Publikacja wyników epokowych badań w czasopiśmie Lancet.

6 eksperymentalne zastosowanie penicyliny w lecznictwie - sukces. W Anglii firma Glaxo uruchamia chałupniczą produkcję penicyliny G w USA opracowano przemysłową technologię produkcji penicyliny w tankach penicylinę zastosowano do leczenia wojska podczas inwazji na Sycylię i w wojnie o Birmę leczenie żołnierzy alianckich poszkodowanych w czasie bitwy w Normandii. Do produkcji przystąpiły firmy w USA: Merck, Pfizer, Squibb i inne. Impuls do konstrukcji nowych maszyn i poszukiwań nowych rozwiązań technicznych Fleming, Chain i Florey otrzymują Nagrodę Nobla. Technologię produkcji rozdano krajom, zniszczonym drugą wojną światową, w ramach pomocy UNRRA Uruchomienie produkcji w Polsce (Tarchomin).

7 odkrycie streptomycyny, wynalezienie chloramfenikolu, tetracyklina i erytromycyna odkrycie szczepu Cephalosporium acremonium, a ~ 1950 ustalenie, że wytwarza on cefalosporynę C, którą uzyskano w 1959 r. (ang. f-ma Glaxo) pierwsze porcje kwasu 6AP. Pierwszą półsyntetyczną penicyliną- metycylina ampicylina pierwsza półsyntetyczna penicylina o szerokim zakresie działania. W tym samym czasie doszukano się analogii cefalosporyn i penicylin kwas 7AC, a w 1964 amerykańska firma Elli Lily wytwarza pierwszą półsyntetyczną cefalosporynę cefalotynę. Równoczesnie i potem dokonują się odkrycia w grupach antybiotyków makrocyklicznych (ryfamycyny), aminoglikozydowych, przeciwgrzybiczych i innych. becnie istotne zastosowanie w lecznictwie ma ok. 100 preparatów.

8 2 N As As Salwarsan N 2 x 2 Cl 2 N S N S N Sulfatiazol (sulfonamid) 3 C N N C 2 5 C Kwas naliksydowy (chinolon) 2 N C N N C Nifuroksazyd (pochodna nitrofuranu) C NN 2 N 2 N N C 3 C 2 C 2 N 3 C 3 C 3 C C 3 C3 C 3 N Izoniazyd metronidazol pochodna 5-nitroimidazolu Paklitaksel CEMITERAPEUTYKI

9 RN 3 C 3 C N S Penicyliny C Me Me C C 3 ( Laktamy) C 3 C 3 Erytromycyna (Makrolid) Me R 1 N 2' 1' 1'' 2'' 7 8 NMe 2 3' N 5 6 S C 2 Cefalosporyny C 3 C 3 Me 3 C 36 R C C Cl Me NMe 2 N 2 Chlorotetracyklina (Aueromycyna) (Tetracyklina) 25 3 C C 3 C 3 C C C ryfamycyna S (Ansamycyna) N C 3 Me 2 N C N C N C 2 MeN C 2 C C N 2 N C N 2 N Streptomycyna (Aminoglikozyd) N chloramfenikol C CCl 2

10 DRBNUSTRJE WYTWARZAJĄCE ANTYBITYKI (Przykłady) Penicillium chrysogenum Penicyliny G i V Cephalosporium acremonium Cefalosporyny grzyby Penicillium griseofulvum Gryzeofulwina Streptomyces griseus Streptomycyna Streptomyces erythraeus Erytromycyny Streptomyces aureofaciens Tetracykliny promieniowce Streptomyces venezuelae Chloramfenikol Streptomyces clavuligerus Cefamycyny Nocardia mediterranea Ryfamycyny Bacillus subtilis Bacytracyna promieniowce Bacillus polymyxa Polimyksyny

11 Stadia produkcji antybiotyków: 1. Przygotowanie (mycie, dezynfekcja lub wyjaławianie aparatury i pomieszczeń, sporządzanie i sterylizacja pożywek, 2. Namnożenie materiału posiewowego (inoculum) 3. Biosynteza, 4. Wydzielanie i oczyszczanie produktu, 5. Ewentualna modyfikacja antybiotyki półsyntetyczne. 6. Wytworzenie formy handlowej produktu, 7. Utylizacja ścieków i odpadów, regeneracja rozpuszczalników.

12 Substancją wyjściową w procesie izolacji antybiotyków - zawiesina pohodowlana (brzeczka pofermentacyjna) Lokalizacja antybiotyku - produktu biosyntezy - w brzeczce: 1. poza komórkami producenta wydzielony do podłoża, 2. jw., ale częściowo związany ze ścianą komórkową (streptomycyna), 3. całkowicie zgromadzony w komórkach (nystatyna, cykloseryna), 4. częściowo (1.), częściowo (3.) - gryzeofulwina (wydzielana oddzielnie z grzybni i oddzielnie z przesączu), amfoterycyna B (wydzielana z całości hodowli).

13 PRCEDURA GÓLNA WYDRĘBNIANIA ANTYBITYKÓW 1. bróbka wstępna zawiesiny pohodowlanej. 2. Filtracja lub wirowanie (oddzielenie biomasy). 3. Koncentracja i oczyszczanie antybiotyku. 4. Różne procesy chemiczne i fizykochemiczne - oddzielenie antybiotyku od zanieczyszczeń, przeprowadzenie w trwałą strukturę finalną. 5. peracje końcowe.

14 1. BRÓBKA WSTĘPNA Gdy antybiotyk zgromadzony we wnętrzu komórki wymagane zniszczenie błony (często i ściany komórkowej) poprzez: a) mechaniczne rozrywanie komórek, b) działanie czynnikami fizycznymi, c) działanie czynnikami chemicznymi. Następnym lub pierwszym elementem obróbki wstępnej - gdy antybiotyk wydzielany do podłoża, jest: - cieplna koagulacja białek, - regulacja p, - rozcieńczenie, - dodatek środka wspomagającego filtrację (ziemi okrzemkowej). 2. FILTRACJA LUB WIRWANIE aparatura: prasy ramowe ciśnieniowe, próżniowe filtry obrotowe (tutaj na powierzchni placek ziemi okrzemkowej lub gipsu), najnowsze rozwiązanie: wirówki samowyładowcze. (Niekiedy dodatkowo klarowanie filtratu).

15 3. KNCENTRACJA I CZYSZCZANIE Ekstrakcja rozpuszczalnikami w układzie ciecz-ciecz lub biomasa-ciecz, zazwyczaj po niej reekstrakcja (proces dwu- lub trzystopniowy). [penicyliny, erytromycyna, tetracykliny] Ekstrahenty organiczne: estry (octan butylu, amylu), butanol lub etanol, metanol, aceton. Do reekstrakcji bufory wodne roztwory soli Na, K, amoniaku, amin. Chromatografia kolumnowa jonowymienna lub sorpcyjna. Chromatografia jonowymienna (sorpcja na kationicie, np. Amberlite 50, tzw. antybiotyków zasadowych [streptomycyna] oraz na anionicie, np. Dowex 1x2 antybiotyków w postaci anionowej [cefalosporyna C]. Wytrącanie Ultrafiltracja

16 4. RÓŻNE PRCESY CEMICZNE I FIZYKCEMICZNE, których celem jest oddzielenie antybiotyku od zanieczyszczeń, przeprowadzenie w trwałą strukturę finalną. 5. PERACJE KŃCWE najczęściej krystalizacja, a po niej odsączenie/ odwirowanie produktu, suszenie, liofilizacja (alternatywnie suszenie rozpyłowe). Niekiedy dodatkowo mikronizacja produktu (młyn strumieniowy).

17 WYDRĘBNIANIE PENICYLINY BENZYLWEJ (G) C 2 C N 6 7 N 4 5 S Me Me C Penicylina benzylowa (G) Zakończenie procesu biosyntezy: Stężenie antybiotyku: 50 g/l bądź wyższe. Penicylina G (benzylowa) - hydrofobowa, mało stabilna w wodzie w p odległym od obojętnego, przy czym w miarę obniżania p przechodzi w formę niezdysocjowanego kwasu - maleje jej rozpuszczalność w wodzie, a rośnie w rozpuszczalnikach organicznych.

18 Procedura 1. Schłodzenie zawiesiny pohodowlanej do temp. 10 C, zakwaszenie do p 5,0 5-10% 2 S Filtracja, wirowanie 3. Ekstrakcja: (I) ekstraktor typu Podbielniak, p 2,0-3,0 ( 2 S 4 ) ekstrakcja przeciwprądowa octanem amylu (stosunek przesaczu do octanu: 4:1), (II) wirówki do pracy ciągłej Podbielniak, Luwesta, reekstrakcja do buforu fosforanowego (p = 7,0) (penicylina przechodzi w formę soli, stosunek buforu do octanu 1:3 do 1:5) (III) po zmianie p ekstrakcja do fazy organicznej (zatężenie krotne). 4. dwadnianie roztworu octanowego. 5. dbarwianie na węglu aktywnym. 6. Krystalizacja, przez wprowadzenie nasyconego roztworu octanu sodowego (potasowego) do roztworu penicyliny w octanie amylu i chłodzenie. 7. dfiltrowanie kryształów (wirówka), przemycie alkoholem butylowym lub izopropylowym. 8. Suszenie próżniowe. Wyd. około 90%.

19 WYDRĘBNIANIE CEFALSPRYNY C 2 N C C (C 2 ) 3 C N 7 8 N S C 2 CC 3 C 2 Cefalosporyna C Cefalosporyna C w zakresie p od kwaśnego do zasadowego nie ma właściwości hydrofobowych, toteż nie można ekstrahować jej do fazy organicznej.

20 PRCEDURA 1. Zakwaszenie zawiesiny pofermentacyjnej do p 5,5 dodanie ziemi okrzemkowej i filtracja. 2. bróbka kwaśna przesączu: obniżenie p do 2,8-3 kationitem Amberlite IR-20 ( + ), ogrzewanie 3 godz. w temp. 37 C (rozkład penicyliny N), schłodzenie do temp. około 0 C. 3. Sorpcja zanieczyszczeń na silnie zasadowym mikroporowatym anionicie, a następnie cefalosporyny C na słabo zasadowym makroporowatym anionicie. 4. Elucja cefalosporyny C buforem octan pirydyny-kwas octowy (p 5,0-5,5). 5. bróbka eluatu: zatężanie, rozcieńczenie koncentratu acetonem i wytrącenie surowej cefalosporyny C, odfiltrowanie osadu i suszenie próżniowe. 6. czyszczanie surowego produktu: Rozpuszczenie surowej cefalosporyny C w wodzie, neutralizacja rozcieńczonym Na, przepuszczenie roztworu przez kationit sulfonowy w formie sodowej usunięcie pirydyny, uzyskanie roztworu soli sodowej cefalosporyny C. 7. Zatężanie roztworu pod próżnią, krystalizacja soli sodowej cefalosporyny C, wirowanie, przemycie kryształu etanolem, suszenie. Produkt: sól sodowa cefalosporyny C.

21 WYDRĘBNIANIE RYFAMYCYN 3 C 37 3 C C C C 3 C 3 C C ryfamycyna B 31 C N C 2 C Na 2 S 2 8 (utlenianie) C C C 3 CCl 3 /Me/ C C N 2 S 4 (hydroliza) N + C 2 C W brzeczce pofermentacyjnej ryfamycyna B związek ten w formie kwasu karboksylowego nierozpuszczalny w wodzie. Stężenie: od kilkunastu do 20g/l.

22 PRCEDURA 1. Alkalizacja brzeczki wodnym roztworem węglanu sodu do p 7,8-8,0. W tym p antybiotyk w formie rozpuszczalnej w wodzie soli sodowej. 2. Filtracja - oddzielanie grzybni przy zastosowaniu wirówek samowyładowczych. 3. Utlenianie zawartej w przesączu brzeczki ryfamycyny B do ryfamycyny. Ryfamycyna B utleniana nadsiarczanem sodu do laktonu ryfamycyny. p początkowe: 6,8-6,9, końcowe: 4,0. Czas: 4-5 godz., 3x wzgl. stechiometrii nadmiar utleniacza. Ryfamycyna nierozpuszczalna w wodzie tworzy bezpostaciowy osad. 4. Separacja szlamu ryfamycyny (w stałej masie 50-60% antybiotyku) samowyładowcza wirówka BRPX. (W pierwotnym wariancie osad suszony przed następnym etapem wydzielania antybiotyku). 5. Ekstrakcja chloroformem ryfamycyny ze szlamu. Rozdział faz. 6. Koncentracja ekstraktu chloroformowego, dodanie 30% kwasu siarkowego. omogenizacja układu przy użyciu metanolu. ydroliza ryfamycyny do S. 7. Po zakończeniu hydrolizy rozcieńczenie układu wodą - wydzielenie chloroformowego roztworu ryfamycyny S. 8. ddestylowanie chloroformu. Krystalizacja ryfamycyny S z izopropanolu.

23 WYDRĘBNIANIE STREPTMYCYNY N 2 N C N N N C N 2 C Me C 2 MeN Streptomycyna (Aminoglikozyd) Streptomycyna oraz inne antybiotyki aminoglikozydowe mają charakter zasadowy, są dobrze rozpuszczalne w wodzie i stabilne w szerokim zakresie temp. i p.

24 PRCEDURA 1. Zakwaszenie brzeczki do p 4,0 ( 2 S 4 ), dodanie ziemi okrzemkowej, mieszanie koagulacja białek, dezintegracja ściany i błony komórkowej. Dodanie kwasu szczawiowego związanie jonów Ca bróbka termiczna ogrzanie zawiesiny pohodowlanej do temp C w p 4,0. 3. Zakwaszenie do p 2,0. 4. Filtracja w podwyższonej temp. 5. czyszczenie przesączu na węglu aktywnym (w p lekko kwaśnym). 6. Neutralizacja filtratu (po oddzieleniu C*). Chromatografia jonowymienna kolumna ze słabo kwaśnym kationitem karboksylowym (np. Amberlite IRC- 50, Wofatytem CP) w formie sodowej lub amonowej sorpcja streptomycyny. 7. Elucja antybiotyku rozcieńczonym roztworem kwasu solnego (siarkowego). 8. Demineralizacja na złożach mikroporowatych - (najpierw na kolumnie z anionitem (-), potem z kationitem (+, np. Amberlite IR-120). 9. dbarwianie eluatu. 10. Wytrącenie w postaci siarczanu lub chlorowodorku z układu woda/aceton woda/metanol lub woda/etanol. 11. Suszenie rozpyłowe lub liofilizacja.