Drobnoustroje jako biologiczne źródło nowych potencjalnych leków

Transkrypt

1 Drobnoustroje jako biologiczne źródło nowych potencjalnych leków Drobnoustroje prokariotyczne i eukariotyczne wytwarzają olbrzymią ilość małocząsteczkowych metabolitów wtórnych, z których wiele wykazuje selektywną toksyczność wobec innych drobnoustrojów (antybiotyki przeciwdrobnoustrojowe), działanie przeciwnowotworowe (antybiotyki przeciwnowotworowe), ale także obniżające ciśnienie, hamujące biosyntezę cholesterolu, o działaniu przeciwbólowym, immunosupresyjnym i innym. - wyizolowano i opisano około metabolitów wtórnych; - połowa z nich działa antybiotycznie lub cytostatycznie - zastosowanie medyczne około 150 Potencjalne dalsze możliwości: - z gatunków bakterii poznano około z 1,5 mln gatunków grzybów poznano około bardzo słabo poznane: drobnoustroje morskie, ekstremofilne

2 Przedmiot: TECHNOLOGIA CHEMICZNA Metabolizm wtórny przemiany peryferyjne Biosynteza metabolitów wtórnych rozpoczyna się w momencie wyczerpania źródeł substratu pokarmowego limitującego wzrost drobnoustrojów

3 ANTYBIOTYKI Substancje małocząsteczkowe wytwarzane przez organizmy żywe (głównie drobnoustroje) hamujące wzrost lub zabijające drobnoustroje

4

5 Promieniowce są głównymi producentami antybiotyków

6 NIETYPOWI PRODUCENCI Wytwarzane przez cis kalifornijski (Taxus brevifolia) Wytwarzane przez żabę afrykańską (Xenopus laevis) Wytwarzana przez rekina (Squalus acanthias)

7 CHEMOTERAPIA leczenie poprzez działanie chemoterapeutyku, czyli substancji chemicznej selektywnie toksycznej, tzn. takiej, która hamuje wzrost lub zabija czynniki inwazyjne (baterie, grzyby, komórki nowotworowe, wirusy), czyniąc jednocześnie jak najmniejsze szkody komórkom organizmu leczonego ANTYBIOTYKI substancje chemiczne pochodzenia naturalnego, tzn. produkowane przez organizmy, które hamują wzrost lub zabijają inne organizmy SELEKTYWNOŚĆ DZIAŁANIA oddziaływanie tylko z jednym rodzajem celu molekularnego w czynniku inwazyjnym CEL MOLEKULARNY biomakromolekuła (białko, kwas nukleinowy) lub struktura supramolekularna (błona biologiczna, ściana komórkowa), z którą oddziałuje chemoterapeutyk. Wynikiem tego oddziaływania jest efekt toksyczny wobec czynników inwazyjnych zawierających cel molekularny

8 Paul Ehrlich Urodzony w roku 1854 w Strzelinie (wówczas Strehlen) Wprowadził pojęcie magicznej kuli Pierwszy nowoczesny chemoterapeutyk arsfenamina - stosowany w latach w leczeniu syfilisu, odkryty został przez pracującego w zespole Ehrlicha Japończyka Sachahiro Hata Arsfenamina produkowana była przez koncern Hoetsch pod nazwą Salvarsan

9 Penicylina G została odkryta przez Aleksandra Fleminga 1921 odkrycie lizozymu 1929 odkrycie penicyliny G Pomnik Aleksandra Fleminga w Madrycie

10 Cefalosporyny Główne klasy antybiotyków Tetracykliny Penicyliny Aminoglikozydy Makrolidy

11 CEL- ŚCIANA KOMÓRKOWA (biosynteza i organizacja) Penicyliny Peptydoglikan

12 Penicylina G działa tylko na bakterie gramdodatnie, nie wytwarzające β-laktamazy. Rozpada się w żołądku. Ampicylina (u góry) i amoksycylina (u dołu) działają na bakterie gramujemne. Penicylina V jak Penicylina G, ale trwała w żołądku

13 CEL BIOSYNTEZA BIAŁKA

14

15 CEL DNA

16 Antybiotyki przeciwnowotworowe Antybiotyki antracyklinowe Daunorubicyna producent Streptomyces peuceticus. Łączą się DNA, hamując replikację Komórki nowotworowe rozmnażają się intensywnie, w sposób niekontrolowany Spośród normalnych: komórek organizmu Intensywnie namnażają się tylko komórki włosów i szpiku kostnego. Chemoterapia antybiotykami przeciwnowotworowymi może prowadzić do uszkodzenia szpiku

17 CEL BŁONA KOMÓRKOWA Walinomycyna

18 Antybiotyki przeciwgrzybowe Łączą się z ergosterolem, składnikiem grzybowej błony cytoplazmatycznej, powodując tworzenie kanałów W błonie komórek ludzkich występuje zamiast ergosterolu cholesterol, z którym antybiotyki przeciwgrzybowe łączą się nieco mniej chętnie Efekty uboczne chemoterapii Amfoterycyną B Wymioty, biegunka, bóle głowy, gorączka, uszkodzenie nerek i wątroby, neurotoksyczność, drastyczne obniżenie ilości erytrocytów

19 Oporność na antybiotyki oporność specyficzna wobec określonego związku lub grupy podobnych strukturalnie substancji oporność wielolekowa (krzyżowa, MDR) utrata wrażliwości na działanie wielu niepodobnych strukturalnie leków

20 OPORNOŚĆ SWOISTA Przedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNOLOGIA CHEMICZNA Przykład: aktywność enzymu β-laktamazy jest przyczyną oporności swoistej bakterii na działanie penicyliny G Floksacylina półsyntetyczna penicylina działająca na bakterie produkujące β-laktamazę Kwas klawulanowy inhibitor β-laktamazy

21 OPORNOŚĆ WIELOLEKOWA Do wyrzucania cząstek leku potrzebna jest energia Rodzaje transporterów wielolekowych Białka typu ABC Wykorzystują energię hydrolizy ATP do wyrzucania cząsteczek leku Białka typu MFS Wykorzystują energię gradientu protonowego do wyrzucania cząsteczek leku

22 Drobnoustroje jako źródło nowych substancji czynnych

23 Poszukiwanie antybiotyków Wysokowydajne techniki przesiewowe (high throughput screening) (próbki ze środowiska, biblioteki związków) - skrining chemiczny - skrining biologiczny - skrining ukierunkowany Racjonalne projektowanie: - de novo - modyfikacje istniejących związków

24 Przemysłowymi producentami antybiotyków są szczepy wysokowydajne Cechy szczepu wysokowydajnego maksymalna wydajność pożądanego produktu minimalizacja wytwarzania niepożądanych produktów ubocznych stabilność genetyczna odporność na zakażenia wirusowe Klasyczne metody otrzymywania i hodowli szczepów wysokowydajnych nieukierunkowane zmiany genetyczne - mutageneza wytwarzanie, fuzja i odnawianie protoplastów optymalizacja warunków wzrostu Przykład wyniku optymalizacji szczepu: Penicillium chrysogenum wytwarzający Penicylinę G oryginalny szczep producencki szczep zoptymalizowany 0.1 mg/ml 30 mg/ml

25 Mutagenizacja szczepów mutagen (1) (4) komórki zabite (5) genotyp wyjściowy genotyp uszkodzony (3) genotyp trwale zmutowany (2) (6) 1 mutacje pierwotne 2 mechanizm naprawczy; odtworzenie stanu pierwotnego 3 mechanizm naprawczy; mutacje wtórne 4 śmierć komórki 5 śmierć komórki 6 namnażanie zmutowanych komórek Kierunki i skutki zmian genotypu w wyniku mutagenezy populacja mutantów

26

27 Schemat etapów procesu fermentacyjnego wytwarzania idiolitu

28 Produkcja penicyliny G lub V Producent: Penicillum chrysogenum Szczepy produkcyjne wytwarzają do 70 g z litra hodowli. Wydajność szczepu wyjściowego 60 mg z litra Główny sposób konstrukcji szczepów wysokowydajnych powielenie genów biosyntezy (do 20 kopii) Prekursor kwas fenylooctowy lub fenoksyoctowy

29 Schemat procesu wyodrębniania penicyliny G

30 Antybiotyki β-laktamowe wytwarzane na drodze fermentacyjnej jako źródło półproduktów do otrzymywania penicylin i cefalosporyn półsyntetycznych Półprodukty do otrzymywania penicylin i cefalosporyn półsyntetycznych kwas 6-aminopenicylanowy (6-APA) kwas 7-aminocefalosporanowy (7-ACA)

31 Alternatywne możliwości otrzymywania 6APA z penicyliny G

32 Eliminacja chlorowcowanych rozpuszczalników organicznych, toksycznych odczynników i odpadów oraz potrzeby stosowania ciekłego azotu do chłodzenia; prowadzenie reakcji w umiarkowanych warunkach; łatwa kontrola ph, temperatury; zwiększenie wydajności, brak produktów ubocznych. Wykład 8 Biotechnologie otrzymywania antybiotyków i statyn Wytwarzanie kwasu 6-aminopenicylanowego (6APA) Możliwe metody: hydroliza chemiczna lub enzymatyczna Warunki hydrolizy enzymatycznej Biotransformacja 12-15% (w/v) roztworu soli penicyliny G lub V przez immobilizowaną amidazę penicylinową. Podczas reakcji utrzymuje się ph na poziomie 7 8 poprzez dodawanie KOH lub NaOH. Produkty: 6APA oraz odpowiedni kwas (fenylooctowy lub fenoksyoctowy). 6APA izoluje się poprzez zakwaszenie mieszaniny poreakcyjnej do ph = 4.0 w obecności rozpuszczalnika organicznego nie mieszającego się z wodą. W tych warunkach 6APA wytrąca się, a kwas prekursorowy przechodzi do fazy organicznej i jest zwykle zawracany jako dodatek do nowej fermentacji Korzyści z zastąpienia chemicznej hydrolizy penicyliny G do 6APA przez hydrolizę enzymatyczną

33 Antybiotyki makrolidowe Biosynteza erytromycyny Producent: Streptomyces erythreus Podłoża: kwas propionowy lub propanol jako prekursor i induktor Inne pochodne półsyntetyczne: klarytromycyna, cykliczny węglan (Davercin, opracowany w Polsce), Roksytromycyna, dirytromycyna Erytromycyna Klarytromycyna R = CH 3 R = H

34 Biosynteza i izolacja erytromycyny Producent: Streptomyces erythreus Podłoże produkcyjne: Skład: glukoza i/lub skrobia, mąka sojowa lub kukurydziana, drożdże, siarczan amonu, NaCl, CaCO 3, fosforany (5 15 mm), propanol lub kwas propionowy (dawki po 5 ml/l podłoża w pierwszej połowie procesu); Warunki: ph: 7 7,2, maleje do 6,0, potem rośnie do 8,0; temperatura: C w fazie wzrostu, C w fazie produkcji. Proces biosyntezy trwa h, Ograniczenie represji katabolicznej poprzez dozowanie glukozy z mniejszą szybkością w idiofazie i obecność skrobi. Ograniczenie represji azotowej poprzez dodatek zeolitu, dodatek WNK Wyodrębnianie produktu: produkt jest wydzielany pozakomórkowo; po zakończeniu biosyntezy zawiesinę pohodowlaną alkalizuje się do ph 7,5 8,0 lub zakwasza do ph 5,5, następnie oddzielenie grzybni na filtrze próżniowym z dodatkiem ziemi okrzemkowej; produkt z przesączu ekstrakcją octanem butylu lub ketonem metyloizobutylowym i reekstrakcją wodą o ph 5,5; zatężenie, krystalizacja z roztworu o ph 9,5, rekrystalizacja z roztworu wodno-acetonowego, suszenie. Alternatywnie wytrącenie z rozpuszczalnika organicznego w postaci kompleksu z KNCS. Ew. oczyszczanie chromatografia jonowymienna lub adsorpcyjna,

35 Statyny Statyny leki obniżające poziom cholesterolu wprowadzono do lecznictwa w latach 90- tych XX wieku. Należą do najczęściej stosowanych leków. Przyjmuje je na świecie około 80 milionów ludzi, a wartość ich sprzedaży wynosi około 30 miliardów dolarów. Powodują one udowodnione korzyści kliniczne, m.in. zmniejszają: - ryzyko nowych zdarzeń sercowych, - umieralność z przyczyn sercowo-naczyniowych, - umieralność całkowitą, - konieczność wykonywania zabiegów rewaskularyzacji serca oraz częstość hospitalizacji.

36 F HO N N O OH OH O Atorwastatyna (Lipitor) Statyny naturalne (szereg górny) i syntetyczne (szereg dolny)

37 Mikroorganizmy zdolne do biosyntezy statyn Producenci statyn to grzyby strzępkowe należące do rodzajów: - Penicillium - Aspergillus - Monascus Monascus ruber (lowastatyna) Penicillium citrinum (mewastatyna) Aspergillus terreus (lowastatyna)

38 Szczepy produkcyjne Produkcja i izolacja lowastatyny Produkt uboczny biosyntezy u Aspergillus terreus - sulochryna mykotoksyna zanieczyszczająca podłoża hodowlane, utrudniająca odzysk pożądanych metabolitów. Eliminacja problemu na drodze inżynierii metabolicznej usunięcie genów odpowiedzialnych za biosyntezę poliketydową antronowej pochodnej emodyny, prekursora sulochryny. Warunki hodowli Biosynteza w procesie okresowym z zasilaniem: fermentacja wgłębna w podłożu płynnym lub fermentacja powierzchniowa w podłożu stałym (SSF) źródło węgla (+) mąka owsiana (podłoże wzrostowe) (+) laktoza >100 g/l lub 48g/l, fruktoza, glicerol (podłoże produkcyjne) (-) glukoza (szybkie przyswajanie, wyczerpywanie) Ważny jest wysoki stosunek C:N. Optymalny wynosi Wydajność procesu: od kilkuset mg/l do kilkunastu g/l pożywki 16,65 mg/g dry solid Biocon (Indie) Aspergillus flavipes 16 g/l uzyskuje fińska firma Metkinen OY mutanty szczepu A. terreus ATCC20542 źródło azotu witaminy mikroelementy prekursory natlenienie (+) namok kukurydziany, pasta pomidorowa (podłoże wzrostowe) (+) mleko odtłuszczone + ekstrakt drożdżowy (podłoże hodowlane) (-) NH 4+ (zakwaszają podłoże) (+) z grupy B, np. nikotynamid żelazo, miedź, wapń, bor, cynk, magnez, molibden, mangan L,D-metionina (w różnych czasach hodowli) 20%

39 Produkcja i izolacja lowastatyny Kwas mineralny 20 o C Brzeczka pofermentacyjna ph 3,4-3,6 Filtracja Brzeczka pofermentacyjna ph 3,4-3,6 Układ dwufazowy Rozpuszczalnik organiczny Przepuszczenie gazu obojętnego Podgrzanie, o C Placek filtracyjny ph 3,4-3,6 Układ dwufazowy Przepuszczenie gazu obojętnego o Podgrzanie, C Separacja faz Separacja faz Faza organiczna Faza organiczna Faza organiczna Przemycie roztworem zasadowym Przemycie wodą Faza organiczna Przemycie roztworem zasadowym Przemycie wodą Odparowanie Krystalizacja Filtracja i suszenie próżniowe Odparowanie Krystalizacja Filtracja i suszenie próżniowe Surowa lowastatyna (94%) Surowa lowastatyna (94%)

40 Produkcja i izolacja lowastatyny Surowa lowastatyna (94%) dichlorometan/toluen Mieszanie, 10 min, 8-12 Filtracja o C Rozpuszczalnik organiczny Klarowny roztwór Wę giel aktywny Podgrzanie, 30 min, C o Klarowny roztwór Odparowanie Sch łodzenie Filtracja i suszenie pró żniowe Lowastatyna oczyszczona (99%) Produkt poddawany jest jeszcze rekrystalizacji z izopropanolu lub acetonu