Spektroskopia emisyjna. Fluorescencja i Fosforescencja

Transkrypt

1 Spektroskopia emisyjna Fluorescencja i Fosforescencja

2 Reguły wyboru przejścia między termami cząsteczkowymi =0, 1 S=0 g u g g u u

3 Reguła Francka-Condona Najbardziej prawdopodobne są przejścia do takich stanów oscylacyjnych wyższego stanu elektronowego, dla których cząsteczka ma taką geometrię, jak w stanie równowagi dla podstawowego stanu elektronowego. =6 =5 lub =2 =20 lub =18 =0

4 Losy stanów wzbudzonych elektronowo Proces w wyniku którego cząsteczka oddaje energię wzbudzenia w postaci fotonu nazywany jest zanikiem promienistym Częściej jednak zachodzi proces zwany zanikiem bezpromienistym: (zamiana energii wzbudzenia w energię ruchów termicznych otoczenia czyli ciepło)

5 Rozpraszanie energii wygaszanie emisji Bezpromieniste w formie wzbudzenia drgań, wzrostu temperatury, kontaktu z rozpuszczalnikiem. Taki proces obecny jest zawsze. Gaszenie wewnętrzne - zmiany strukturalne wewnątrz cząsteczkowe Gaszenie zewnętrzne - oddziaływanie cząsteczki w stanie wzbudzonym z inną cząsteczką lub absorpcja zarówno promieniowania wzbudzającego jak i emitowanego przez inne chromofory obecne w próbce.

6 Zanik promienisty Fluorescencja Fosforescencja

7 Fluorescencja Fluorescencja emisja promieniowania przez naświetlaną substancję, która jest związana z powrotem cząsteczek do stanu podstawowego o tej samej multipletowości spinowej co stan wzbudzony Oba stany są na ogół singletami Promieniowanie emitowane spontanicznie w procesie fluorescencji zanika natychmiast po wyłączeniu promieniowania wzbudzającego

8 Fluorescencja Geometria cząsteczki nie ulega zmianie w trakcie emisji więc może zostać obsadzony jeden z wyższych poziomów oscylacyjnych podstawowego stanu elektronowego Pasmo fluorescencji wskazuje strukturę oscylacyjną odzwierciedlającą odległości poziomów oscylacyjnych podstawowego stanu elektronowego. Jest ono na ogół przesunięte w kierunku niższych częstości. Wynika to z bezpromienistego (utrata energii na rzecz otoczenia ) zaniku wzbudzenia oscylacyjnego na wyższym poziomie elektronowym przed powrotem cząsteczki do stanu podstawowego

9 Mechanizm fluorescencji S 1 S 0 1. Absorpcja promieniowania wzbudza przejścia sigletsinglet, którym towarzyszy wzbudzenie poziomów oscylacyjnych 2. Następuje bezpromienista utrata energii na rzecz otoczenia 3. Emisja promieniowania następuje z podstawowego poziomu oscylacyjnego wzbudzonego stanu elektronowego Singlet (S 1 ) Singlet (S 0 )

10 Typowe wzbudzenie fluorescencyjne Wysoka energia, krótkie fale C-C wiązanie Wysoka energia oscylacyjna C=C wiązanie Wzrost energii potencjalnej Niska energia oscylacyjna

11 Typowa emisja fluorescencyjna C-C wiązanie Wysoka energia oscylacyjna Ciepło C-C Wzrost energii potencjalnej wiązanie Niska energia oscylacyjna C=C wiązanie Niska energia oscylacyjna Dłuższe fale, niższa energia światła

12 Fluorescencja

13 Fluorescencja Widmo absorpcyjne (a) wykazuje strukturę oscylacyjną charakterystyczną dla stanu wzbudzonego Widmo fluorescencyjne (b) ukazuje strukturę charakterystyczną dla niższego stanu. Jest przesunięte do niższych energii Przejścia oscylacyjne 0-0 pokrywają się Energia 0-0 Przejście

14 Intensywność fluorescencji Fluorescencja Przesunięcie Stokesowskie W 1852 roku na podstawie takich obserwacji zostało sformułowane prawo, od nazwiska odkrywcy, nazwane prawem Stokesa, które mówi, że długość fali promieniowania fluorescencyjnego jest zawsze większa od długości fali promieniowania wzbudzającego fluorescencję. Różnica energii pomiędzy pikiem absorpcji a pikiem emisji to przesunięcie Stokesa Fluoresceina Przesunięcie Stokesa 25 nm 495 nm 520 nm

15 Widmo fluoresceiny

16 Fluorescencja Fluorofory są składnikami cząsteczki, które absorbują energie Są to na ogół pierścienie aromatyczne

17 Charakterystyka fluorescencji 1. Ze względu na to, że cząsteczka może być na różnych stanach rotacyjnych, oscylacyjnych i elektronowych piki są SZEROKIE 2. Każde widmo jest charakterystyczne dla danej cząsteczki 3. Przed powrotem do swojego podstawowego stanu, elektron pozostaje w stanie wzbudzonym przez ok sekund. 4. Ze względu na to, że stan wzbudzony jest WYSOCE REAKTYWNY może reagować z inną cząsteczką 5. Światło rozchodzi się we wszystkich kierunkach

18 Wydajność kwantowa fluorescencji Q = ilość fotonów emitowanych/ilość fotonów absorbowanych

19 Tryptofan Charakterystyczne pasmo absorpcji i emisji. A 2 Maksimum intensywności Intensywność Fluorescencji (Q) λ max

20 Fluorescencja Fluorescencję obserwuje się dla: Sztywnych struktur Delokalizowanych elektronów Intensywnych pasm absorpcyjnych UV (π π* przejścia, Try m -1 cm -1 ) Krótkich czasów wzbudzenia (<10 9 sec). Wewnętrzne fluorofory w białkach to Tryptofan (Try), Tyrozyna (Tyr) i Fenyloalanina (Phe) Try i Tyr emisja znacznie silniejsza niż Phe, Zasady DNA,nukleotydy

21 Zastosowanie Podobne jak spektroskopii UVVIS Analityczne Strukturalne lokalne konformacje (aromatyczne aminokwasy), struktura trzeciorzędowa białek, denaturacja. Kompleksowanie, tworzenie wiązań. Chemiluminescencja. Mikroskopia fluorescencyjna. Fluorescencja jest znacznie wrażliwsza na zmianę środowiska fluoroforu niż spektroskopia absorpcyjna w zakresie UV/Vis.

22 Metody pomiaru fluorescencji Widmo emisji- wzbudzająca długość fali λ stała, pomiar intensywności fluorescencji (emisji) w zależności od długości fali widmo Widmo wzbudzenia pomiar intensywności fluorescencji dla różnych długości fal wzbudzenia λ, podobne do widm absorpcyjnych. próbka Io λ1 Przepuszczone promieniowanie Źródło światła Monochromator Emisja λ2 Detektor

23 Źródła wzbudzające Lampy Lasers Ksenon Ksenon/Rtęć Argon (Ar) Krypton (Kr) Hel Neon (He-Ne) Hel Cadm (He-Cd) Krypton-Argon (Kr-Ar)

24 Mikroskop fluorescencyjny Niektóre substancje obecne w komórkach i tkankach mają zdolność do własnej fluorescencji: porfiryny, chlorofil, hemoglobina, witamina A. Barwniki fluorescencyjne używane są do znakowania interesujących nas molekuł, poprzez wiązanie się z nimi, w utrwalonych i żywych komórkach (fluoresceina, rodamina, DAPI) DNA w jądrze wybarwione DAPI

25 Zasady interpretacji widm fluorescencyjnych białek W białkach fluoryzują tylko 3 aminokwasy: Try, Phe, Tyr Jeśli położenie maksimum emisji Try przesuwa się w kierunku fal krótszych i intensywność rośnie to oznacza, że aminokwas znajduje się w środowisku mniej polarnym W roztworze polarnym przesunięcie oznacza, że tryptofan znajduje się wewnątrz struktury białkowej. Identyczne przesunięcie w roztworze niepolarnym wskazuje na taka zmianę struktury, że Try znajduje się na powierzchni Jeśli obecne są zewnętrzne wygaszacze (jon jodkowy, azotany) i obserwuje się zanik fluorescencji oznacza to, że tryptofan znajduje się na powierzchni. W przypadku braku wygaszania aminokwas jest wewnątrz struktury niedostępnej dla wygaszacza.

26 Zasady interpretacji widm fluorescencyjnych białek Emisję Try wygaszają zprotonowane grupy karboksylowe stąd można ocenić sąsiedztwo tego aminokwasu Jeśli wolny aminokwas zmienia intensywność fluorescencji w obecności substratu a w białku substrat nie oddziałuje oznacza to, że substrat wprowadza zmiany konformacyjne, w których Try zostaje ukryty wewnątrz struktury Jeśli substancja wiąże się z białkiem i fluorescencja tryptofanu maleje to można wnioskować albo o zmianie konformacyjnej albo, że Try znajduje się bardzo blisko centrum wiążącego

27 Fosforescencja T 1 S 0 Emisja promieniowania związana jest z dezaktywacją cząsteczek, znajdujących się w stanie o innej multipletowości niż stan podstawowy. A F FP

28 Mechanizm fosforescencji Absorpcja promieniowania wzbudza przejście singlet-singlet, któremu towarzyszy wzbudzenie poziomu oscylacyjnego W trakcie bezpromienistego wygaszania oscylacyjnego może dojść do przejścia interkombinacyjnego (konwersji międzysystemowej) z krzywej stanu singletowego na krzywą stanu trypletowego spowodowanego oddziaływaniem spin-orbita.

29 Mechanizm fosforescencji Przejście to jest ułatwione obecnością wspólnego poziomu oscylacyjnego elektronowych stanów wzbudzonych Stan trypletowy cząsteczki bezpromieniście przechodzi na zerowy poziom oscylacyjny i pozostaje na nim tak długo aż złamanie reguły S=0 pozwoli na powrót do stanu podstawowego i emisję promieniowania elektromagnetycznego Pozostawanie cząsteczek w stanie wzbudzonym przejawia się nieraz długotrwałym świeceniem substancji po ustaniu naświetlania

30 Mechanizm fosforescencji T 1 S 0 1. Absorpcja promieniowania wzbudza przejście singletsinglet 2. Przejście interkombinacyjne z krzywej stanu singletowego na krzywą stanu trypletowego (przemiana wzbroniona T S) 3. Stan trypletowy cząsteczki bezpromieniście przechodzi na zerowy poziom oscylacyjny 4. Cząsteczka w stanie wzbudzonym przejawia nieraz długotrwałe świecenie

31 Doświadczalna różnica pomiędzy fluorescencją i fosforescencją. I Fluorescencja zanika natychmiast, gdy usuniemy źródło wzbudzenia, podczas gdy fosforescencja trwa przez dłuższy okres czasu a jej intensywność zanika powoli Intensywność emisji T

32 Diagram Jabłońskiego (1933) Diagram Jabłonskiego (dla naftalenu) w uproszczeniu przedstawia obraz względnego położenia poziomów elektronowych cząsteczki. IC: Konwersja wewnętrzna ISC: Konwersja międzysystemowa

33 Schemat Jabłońskiego S stany singletowe T stany trypletowe A absorpcja F fluorescencja P fosforescencja IC konwersja wewnętrzna ISC konwersja interkombinacyjna Energia Wzbudzone stany oscylacyjne Stan elektronowy podstawowy

34 Czasy w jakich zachodzą procesy dezaktywacji cząsteczki Absorpcja: s Relaksacja wibracyjna: s Czas życia w pierwszym stanie wzbudzonym S s, fluorescencja Konwersja wewnętrzna: s Konwersja międzysystemowa: s Czas życia stanu wzbudzonego T s, fosforescencja

35 Reguła Kashy Obserwowana fluorescencja lub fosforescencja niemal wyłącznie pochodzi od przejść z najniższego stanu wzbudzonego o danej multipletowości tzn. ze stanu S 1 lub T 1. Wynika to z dużej szybkości bezpromienistej dezaktywacji (10 12 s -1 ), znacznie większej niż szybkość przejść promienistych rzędu 10 9 s -1

36 Charakterystyka zachodzących procesów w czasie wzbudzenia Konwersja wewnętrzna Jest to bezpromieniste przejście pomiędzy dwoma elektronowymi stanami o tej samej multipletowości (2S+1). W roztworze proces ten zachodzi jako relaksacja wibracyjna z wysokich stanów wibracyjnych do podstawowego wibracyjnego. Dzieje się tak na skutek kolizji z cząsteczkami rozpuszczalnika

37 Charakterystyka zachodzących procesów w czasie wzbudzenia Kiedy cząsteczka zostaje wzbudzona do wyższego stanu wibracyjnego pierwszego wzbudzonego elektronowego to poprzez procesy wibracyjnej relaksacji lub konwersji wewnętrznej i wibracyjnej relaksacji gdy są to stany elektronowe wyższe przechodzi do stanu podstawowego oscylacyjnego pierwszego stanu wzbudzonego elektronowego w czasie około s. Przejście ze stanu elektronowego 1 do 0 jest już mniej prawdopodobne ze względu na największa różnicę energii.

38 Luminiscencja Zjawisko to, zwane jarzeniem lub niekiedy zimnym świeceniem polega na emitowaniu światła, które powstaje kosztem innych rodzajów energii niż energia cieplna.

39 Rodzaje luminescencji Fotoluminescencja (świecenie spowodowane promieniowaniem UV lub widzialnym VIS). Fotoluminescencję dzieli się na: fluorescencję i fosforescencję Fluorescencja jest świeceniem krótkotrwałym, trwającym nie dłużej niż 10-8 s Fosforescencja to świecenie długotrwałe, dochodzące do kilku godzin a nawet dni

40 Fotoluminescencja Fotoluminescencję wykazuje wiele substancji, jak choćby organiczne barwniki stosowane w odblaskowych flamastrach czy luminofory stosowane w świetlówkach-rurach fluorescencyjnych.

41 Rodzaje luminescencji Termoluminescencja luminescencja następuje po uprzednim naświetleniu substancji i następnie jej ogrzaniu. Mamy tu do czynienia z gromadzeniem energii świetlnej i wypromieniowaniu jej gdy tego chcemy- w momencie podgrzania.

42 Rodzaje luminescencji Chemiluminescencja to świecenie wywołane reakcjami chemicznymi, np. podczas utleniania fosforu białego lub luminolu.

43 Luminofory nieorganiczne Siarczki takie jak siarczek cynku ZnS i siarczek kadmu. Cechuje je wysoka wydajność świetlna. Luminofory siarczkowe są dobrymi katodoluminoforami, elektroluminoforami i rentgenoluminoforami Tlenosiarczek itru aktywowany europem okazał się bardzo dobrym luminoforem czerwonym, stosowanym w telewizji kolorowej Luminofory z grupy halofosforanów wapnia znalazły zastosowanie w świetlówkach. Mają dobrą wydajność świetlną, są aktywowane manganem. Wolframian wapnia aktywowany srebrem i tantalan itru aktywowany niobem są dobrymi rentgenoluminoforami stosowanymi do folii wzmacniających w rentgenodiagnostyce

44 Luminofory nieorganiczne Luminofory siarczkowe (siarczki metali) najwolniej gasnące-siarczki wapniowców CaS, SrS: Cu, Bi, Pb. kadmu i cynku ZnS, CdS: Ag, Cu, Co, Mn tlenosiarczkowe Y 2 O 2 S: Eu

45 Luminofory organiczne-przykłady -fluoresceina -eozyna -uranina -niektóre polimery

46 Przykłady fosforów i luminoforów Materiał luminescencyjny: NaI(Tl), np. licznik scyntylacyjny, detekcja promieni X oraz gamma po absorpcji kwantu elektron przechodzi do pasma przewodnictwa NaI, emisję światła (410 nm) powoduje przejście na poziom domieszkowy talu. Fosfory siarczkowe- ZnS:Ag; ZnS:Cu; CdS:Ag kiedyś popularne w farbie świecącej w budzikach składniki luminoforów telewizyjnych, ponieważ ZnS jest półprzewodnikiem, łatwiej następuje przeniesienie e - w paśmie przewodnictwa na domieszkę. Wydajność przenoszenia energii w izolatorach (fosforany) jest mniejsza.