TECHNIKI DIAGNOSTYCZNE (A) w hematologii i biochemii klinicznej

Transkrypt

1 TECHNIKI DIAGNOSTYCZNE (A) w hematologii i biochemii klinicznej ZAKŁAD PATOFIZJOLOGII ZWIERZĄT Katedra Patologii i Diagnostyki Weterynaryjnej Wydział Medycyny Weterynaryjnej SGGW prof. dr hab. Anna Winnicka, dr Magdalena Żmigrodzka, lek. wet. Agnieszka Turło, lek. wet. Alicja Miśkiewicz Wykłady: wtorki s. 103 b.22, począwszy od Ćwiczenia: grupa 1 środy ; grupa 2 czwartki ; grupa 3 piątki s. 104 b.22, począwszy od Zły sprzęt Niedostosowany do wykonywanych oznaczeń: analizator hematologiczny skalibrowany do wykonania oznaczeń krwinek innej wielkości niż potrzebne MCV różnych gatunków zwierząt Nieprawidłowa obsługa i konserwacja sprzętu Nieprawidłowa kalibracja analizatorów Kontrola stanu analizatora czystość elementów optycznych laminarny przepływ w celi pomiarowej Kontrola ustawienia analizatora regulacja czułości detektorów regulacja wzmocnienia toru detekcji kompensacja widmowa fluorochromów Kontrola metody jakość badanego materiału biologicznego dobór przeciwciał monoklonalnych i fluorochromów dobór specyficznych barwników DNA dobór właściwych standardów precyzja wykonania 1

2 Złe materiały Niedostosowane do wykonywanych oznaczeń Przeterminowane Złe metody badawcze Metoda Salhiego do oznaczania stężenia hemoglobiny Liczenie płytek krwi z rozmazu Źle przygotowany personel Zła organizacja pracy Błędy przypadkowe (precyzji) Mała czułość aparatu Sugestia pracownika Ocena precyzji: Powtarzalność: zgodność wyników tych samych pomiarów w tym samym cyklu analitycznym Odtwarzalność: zgodność wyników tych samych pomiarów w różnym czasie Porównanie między laboratoriami: zgodność wyników tych samych pomiarów w różnych laboratoriach 2

3 to różnica między wartością rzeczywistą a średnią wartością uzyskaną w wyniku oceny powtarzalności (kilku pomiarów) Błąd dopuszczalny nie może być większy niż ¼ zakresu wartości referencyjnych Proponowane zakresy dopuszczalnego błędu precyzji i dokładności: Analiza Dopuszczalny błąd (%) precyzji dokładności Ht 1,0 0,9 Białko 1,4 1,5 Bilirubina 11,3 9,8 Na 0,3 0,2 Wartość graniczna Swoistość i czułość testu Test referencyjny Krzywa ROC Wartości predykcyjne testu 3

4 Określenie arbitralne testy ELISA dopasowanie do gęstości optycznej 0,15/0,20 Wyliczenie statystyczne na podstawie rozkładu normalnego średnia + 2 lub 3 wartości odchylenia standardowego Obliczenie średniej wartości dla populacji wyłącznie zwierząt zdrowych + 2 lub 3 odchylenia standardowe liczba Wartość graniczna ujemna dodatnia zwierzęta zdrowe zwierzęta chore wyniki Swoistość diagnostyczna (%) = x 100% Oznaczanie glukozy Oznaczanie TSH, T3, T4 testem ELISA w laboratoriach medycznych Czułość diagnostyczna (%) = x 100% 4

5 Współczynnik chorobowości rzeczywistej (trafność użytego testu wynosi 100%) = liczba zwierząt rzeczywiście chorych liczba zwierząt w narażonej populacji Współczynnik chorobowości obliczonej (trafność użytego testu jest mniejsza od 100%) = liczba zwierząt, u których test dał wynik dodatni liczba zwierząt w narażonej populacji Współczynnik chorobowości rzeczywistej dla konkretnej swoistości i czułości = współczynnik chorobowości obliczonej + (swoistość -1) czułość + (swoistość -1) Złoty standard Metoda odwoławcza, błąd metody Zależność między swoistością a czułością dla danej wartości granicznej Wybór testu na podstawie pola (w %) pod krzywą Czułość (%) Trafność testu % 50-60% ndst 61-70% dop 71-80% dst 81-90% db % bdb Swoistość (%) Wartość predykcyjna dodatnia (prawdopodobieństwo choroby u zwierzęcia z wynikiem dodatnim) = liczba zwierząt chorych, ocenionych przez test jako chore liczba zwierząt w danej populacji, ocenionych przez test jako chore Wartość predykcyjna ujemna (prawdopodobieństwo zdrowia u zwierzęcia z wynikiem ujemnym) = liczba zwierząt zdrowych, ocenionych przez test jako zdrowe liczba zwierząt w danej populacji, ocenionych przez test jako zdrowe 5

6 Przykład: test o swoistości i czułości 90%, współczynnik chorobowości 0,01, n=1000 Rzeczywista liczba chorych = 10 Rzeczywista liczba zdrowych = 990 Wartość predykcyjna dodatnia = 8,33% (niska pewność choroby) Wartość predykcyjna ujemna = 99,89% (wysoka pewność zdrowia) test o swoistości i czułości 90%, współczynnik chorobowości 0,90, n=1000 Rzeczywista liczba chorych = 900 Rzeczywista liczba zdrowych = 100 Wartość predykcyjna dodatnia = 98,79% (wysoka pewność choroby) Wartość predykcyjna ujemna = 50,00% (pewność zdrowia 1:1) Formułowanie wyniku Jednostki Współczynniki przeliczeniowe Wartości prawidłowe / wskazanie wyniku nieprawidłowego Wartość referencyjna jest pojęciem statystycznym obejmującym 95% badanej populacji zwierząt zdrowych określonego gatunku. Zakresy wartości zależą od: Rasy Wieku Stanu fizjologicznego, np. ciąża, laktacja Cyklu okołodobowego Pory roku Regionu Metody i precyzji badań laboratoryjnych Wartość prawidłowa (fizjologiczna) opisuje wskaźnik zgodnie ze stanem rzeczywistym 6

7 Techniki pomiarowe w hematologii Metoda impedancyjna Anna Winnicka Metoda cytometryczna 7

8 Konstrukcja kanału przepływowego Kanał przepływowy w miejscu preparatu: przepływ laminarny niskie stężenie komórek w koncentrycznej warstwie cieczy Źródło światła Kanał o oświetleniu epiluminescencyjnym wiązka światła wzbudzonego wpada przez obiektyw imersyjny o dużej aperturze numerycznej światło fluorescencji wraca tym samym obiektywem i przez układ światłodzielący oraz zestaw filtrów pasmowych pada na detektory Kanał o oświetleniu laserowym skupionym Wysokociśnieniowe lampy rtęciowe, typu HBO-100 Lasery: argonowe (dł.fali - 488nm) kryptonowe helowo-neonowe wiązka światła wzbudzonego pada na kwarcowy, cylindryczny fragment z boku kanału od ścianek kanału odchodząświatłowody przenosząc światło fluorescencji, rozproszenia w przód lub rozproszenia wstecznego Możliwości badawcze FSC/SSC ocena komórek płynących wieloparametrowa ocena ilościowa i jakościowa duża liczba pomiarów duża prędkość pomiarów wysoka dokładność FL1/FL2 Sortowanie komórek Rozdzielanie przepływającej zawiesiny komórkowej na frakcje w zależności od natężenia fluorescencji Ładowanie elektrostatyczne jednokomórkowych kropelek zawiesiny i odchylanie ich w odpowiednio ukształtowanym i sterowanym polu elektrycznym Zbieranie do osobnych probówek komórek różniących się mierzonymi parametrami 8

9 Oznaczanie zawartości DNA Jodek propidyny (PI), oranż akrydyny (AO) G 2 S M G 1 Histogram zawartości DNA: wyższy szczyt odpowiada komórkom w fazie G 1, niższy - komórkom w fazie G 2 i M, pole między szczytami to komórki w fazie S cyklu komórkowego G 2 S G 1 Zależność całkowitej fluorescencji od wartości alfat [FL1: (FL1+FL2)], komórki w mitozie są oddzielone od komórek w fazie G 2 DNA jednoniciowy czerwony DNA dwuniciowy - zielony Ocena proliferacji komórek Proporcja komórek dzielących się w danej populacji Proporcja komórek w poszczególnych fazach cyklu mitotycznego Czas potrzebny na dokonanie podziału Fluorochromy do pomiaru zawartości całkowitego DNA Fluorochromy do pomiaru zawartości całkowitego DNA Jodek propidyny (PI) Jodek propidyny (PI) 7-aminoaktynomycyna D (7-AAD) 7-aminoaktynomycyna (7-AAD) Oranż akrydyny (AO) Oranż akrydyny (AO) 4,6-dwuamidino-2-fenyloindol (DAPI) 4,6-dwuamidino-2-fenyloindol (DAPI) Hoechst Hoechst Sposoby oceny intensywności replikacji DNA Sposoby oceny intensywności replikacji DNA Bromo-deoksyurydyna (BrUdR) Bromo-deoksyurydyna (BrUdR) Przeciwciała monoklonalne i fluorochromy Przeciwciała monoklonalne i fluorochromy Tioizycyjanian fluoresceiny (FITC) Tioizycyjanian fluoresceiny (FITC) Fikoerytryna (PE) Fikoerytryna (PE) Ocena proliferacji w chwili oznaczania Ocena wbudowania znakowanej trytem tymidyny w nowe DNA Ocena proliferacji komórek obserwowana w czasie Barwnik do znakowania komórek dzielących się: CFDA-SE Barwnik carboxyfluorescein do znakowania diacetate komórek succinimidyl dzielących ester się: CFDA-SE carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (Lyons A.B., Divided we stand: Tracking cell profiferation with carboxyfluorescein (Lyons diacetate A.B., Divided succinimidyl we ester. stand: Immunology Tracking cell and profiferation Cell Biology, 1999, with 77: ) carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Immunology and Cell Biology, 1999, 77: ) Trwałe znakowanie fluorescencyjne białek w żywych komórkach Każdemu podziałowi towarzyszy zmniejszenie do połowy ilości znacznika co odpowiada zmniejszeniu ilości fluorescencji Możliwość ustalenia liczby cykli komórkowych wraz z ustaleniem fenotypu danej komórki Ustalenie długości fazy G0 G1 dla badanej populacji Możliwość sortowania komórek z kolejnych podziałów do dalszej analizy 9

10 Normalny Ocena ploidii DNA Znakowanie DNA: oranż akrydyny. Pomiar wobec wzorca komórek Materiał: zawiesina komórek pozyskanych z tkanek śródoperacyjnie lub w drodze biopsji cienkoigłowej Materiał z tkanek zmienionych nowotworowo cechuje aneuploidia DNA. Guzy aneuploidalne charakteryzuje szybka miejscowa progresja i tworzenie przerzutów Pomocne w rozpoznaniu i prognozowaniu: -Nowotworów przewodu pokarmowego, układu oddechowego -Raka sutka, prostaty, jajników, narządu rodnego -Raka pęcherza moczowego, nerki -Mięsaka tkanek miękkich Proliferacja Aneuploidia blisko diploidii Aneuploidia Hiperdiploidia Aneuploidia Hipodiploidia Multiploidia Apoptoza Komórki apoptotyczne w barwieniu oranżem akrydyny Apoptoza Znakowanie: aneksyną V FITC / PI lub 7-AAD/aneksyną V PE 7-AAD Komórki żywe Anty Fas 6h późna R8 apoptoza 7-AAD R6 apoptoza komórki żywe R4 wczesna apoptoza R5 7-AAD Anty Fas 72h Aneksyna V PE 10

11 Apoptoza w badaniu toksyczności leków Znakowanie komórek jodkiem propidyny R3 R3 R2 R2 R1 R1 Region Events % Total X Mean R R R R1 komórki prawidłowe R2 komórki apoptotyczne R3 komórki nekrotyczne Region Events % Total X Mean R R R Badanie retikulocytów Barwienie błękitem brylantowokrezylowym Barwienie oranżem tiazolowym (TO) Fenotypowanie komórek Zawiesina komórek - krew pełna, mleko, płyny z jam ciała, bioptaty, izolowane z narządów Przeciwciała monoklonalne i fluorochromy Znakowanie bezpośrednie: przeciwciało monoklonalne z tioizocyjanianem fluoresceiny (FITC) lub fikoerytryną (PE) Znakowanie pośrednie: Przeciwciało monoklonalne + FITC Przeciwciało monoklonalne biotynylowane + SA-PE Przeciwciało monoklonalne + koniugaty Ig i fluorochromów Liza erytrocytów 11

12 Kompleksy różnicowania Człowiek Paryż, testowanych przeciwciał, 15 CD Kobe, CD Przeżuwacz Pullman, 1992: VMRD Inc., Serotec Davis W.C.,100 testowanych przeciwciał, 11 CD Budapeszt, 1994 Compton Institute for Animal Health, 1995 Świnia Compton Institute for Animal Health, 1995 Koń ELAW I - Cambridge, 1991 ELAW II - California, 1995 Kot Shimoijima, Vet Immunol Immunopathol, 1998 Pies Gebhard, Vet Immunol Immunopathol, 1992 Podstawowe antygeny leukocytarne Markery linii komórkowych Wspólne antygeny leukocytarne: CD45 (CD45RA, CD45RB, CD45RO) Markery limfocytów T: TCR1 - γδ, TCR2 - αβ, CD3, CD1, CD2, CD5, CD6 Markery subpopulacji limfocytów T: CD4, CD8, WC1 CD4: Th1 - IL-2, INFγ; Th2 - IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 CD8: Tc - CD28+ (IL-2), Ts - CD28- WC1 (CD2-CD4-CD8-CD5+TCR γδ+) Markery limfocytów B: IgM, CD79 αβ, WC3, WC4 (CD19), WC6, WC10 Markery komórek K, NK i LAK: CD16CD56, CD4-CD5-CD6- WC1-, CD2+CD4-CD8- Markery dojrzewania: CD1, CD45R, rec. dla L-selektyny Markery aktywacji: IL-2, CD25, WC5, WC8 Komórka pnia - limfoidalna Komórka pnia CD34 Komórka pnia - mieloidalna CD34 Pro-B Wczesny tymocyt Mieloblast Monoblast Megakarioblast Erytroblast HLA-DR CD2 HLA-DR HLA-DR HLA-DR HLA-DR CD19 CD3 CD13 CD13 CD41 CD71 CD22 cytoplazmatyczne CD33 CD14 CD42 glikoforyna A cytoplazmatyczne CD7 CD33 CD61 glikoforyna B TdT TdT Pre-B Średni tymocyt Pro-mielocyt Pro-monocyt Normoblast HLA-DR CD1 CD13 HLA-DR CD71 CD10 CD2 CD15 CD13 glikoforyna A CD19 CD3 CD33 CD14 glikoforyna B CD20 CD4 CD33 CD22 CD5 CD7 CD8 TdT Niedojrzały Dojrzały Mielocyt B tymocyt Megakariocyt HLA-DR CD2 CD13 CD41 CD10 CD3 CD15 CD42 CD19 CD4/CD8 CD33 CD61 CD20 CD5 CD21 CD6 CD22 CD7 Ig B T Neutrofil Monocyt Płytka Erytrocyt HLA-DR CD2 CD11b HLA-DR CD41 glikoforyna A CD19 CD3 CD13 CD11b CD42 glikoforyna B CD20 CD5 CD15 CD11c CD61 CD21 CD6 CD33 CD13 CD22 CD7 CD43 CD14 CD23 CD4/CD8 CD33 aktywowane B CD25 CD37 aktywowane T Ig CD43 Komórki macierzyste Diagnostyka: -Choroby rozrostowe układu krwiotwórczego -Chemioterapia nowotworów -Monitorowanie procesu przeszczepiania tkanki krwiotwórczej Fenotyp: CD34 + CD7 - CD10 - CD1 - CD19 - CD3 - CD38 - CD71-12

13 Granulocyty obojętnochłonne Hipersegmentacja Granulocyty Monocyty Limfocyty Nieprawidłowość Pelger Hueta Granulocyty Monocyty Limfocyty Receptory adhezyjne LAM-1dla L-selektyny (CD62L) Integrynowe: LFA-1 (CD11a/CD18) dla ICAM-1, 2, 3 CR3 (CD11b/CD18) dla ic3b, ICAM-1, fibrynogenu, zymosanu CR4 (CD11c/CD18) dla ICAM-1, 2, 3 Dla fibronektyny Dla lamininy VLA-4 dla VCAM-1 Ocena ekspresji wybranych cząsteczek adhezyjnych, np. ICAM-1 na powierzchni komórek (makrofagi pęcherzyków płucnych, komórki śródbłonka naczyń) oraz obecnych w postaci rozpuszczonej (sicam-1) Znakowanie przeciwciałem anty-icam-1(fitc) Aktywność fagocytarna granulocytów obojętnochłonnych i monocytów Phagotest: E. coli lub S. aureus znakowane FITC, opsonizowane przeciwciałami i składowymi dopełniacza Inkubacja 10 min 0 0 C Inkubacja 10 min 37 0 C 13

14 Pomiar wybuchu oddechowego dioctan 2,7-dichlorofluorescyny (DCFH-DA) po aktywacji neutrofila DCFH-DA utleniany jest do DCF, emitującego fluorescencję w zielonym zakresie widma Cytometryczna ocena chemotaksji Zmiany w FSC i SSC: po pobudzeniu komórki, np. fmlp, IL-8 lub LTB4 wynikają ze zmiany kształtu komórek Granulocyty zasadochłonne Basotest BD: ocena odsetka bazofilów ulegających degranulacji pod wpływem badanych antygenów ekspresja gp53 (CD63) 3% aktywowanych bazofilów 30% 95% gp53 (FITC) 14

15 Ocena ekspresji antygenów płytek krwi Markery linii komórkowej: CD61/CD41 CD29/CD49b receptor dla kolagenu CD29/CD49e receptor dla fibronektyny CD29/CD49f receptor dla lamininy CD42a/CD42b receptor dla czynnika Willebranda Markery aktywacji: CD62P receptor dla P-selektyny CD63 (gp53) Komórki dendrytyczne Odsetek komórek dendrytycznych we krwi obwodowej człowieka 0,65±0,29% PBMC Proporcje między komórkami mieloidalnymi o fenotypie: BDCA-1+/CD19- i limfoidalnymi o fenotypie: BDCA-2+/CD123-0,41 ±0,21%; 0,24 ±0,0,14% Izolacja krążących komórek nowotworowych z krwi obwodowej Metoda negatywnego sortowania komórek krwi obwodowej znakowanych przeciwciałem anty-cd45 pozwala na izolację komórek linii nowotworowych Obecność komórek nowotworowych, zawieszonych w koncentracji 1/10 7, we krwi zdrowych dawców potwierdzana jest oceną morfologiczną i fenotypowaniem z przeciwciałami anty-cytokeratyna 18 Stwierdzenie obecności komórek nowotworowych we krwi obwodowej może być dodatkowym czynnikiem rokowniczym w przebiegu choroby 15

16 Wykrywanie wewnątrzkomórkowych cytokin w limfocytach Aktywacja limfocytów Lektyny: Con A, PHA Induktory sygnału: PHA, jonomycyna Kostymulatory: anty-cd3 i anty-cd28 Superantygeny Blokowanie transportu białek w komórkach Brefeldyna Monensyna Znakowanie antygenów powierzchniowych Utrwalanie i permeabilizacja komórek Znakowanie cytokin wewnątrz komórek Odczyt cytometryczny FL1-INFγ FL2-CD8 FL1-IL-2 FL2-CD8 FL1-CD25 FL2-WC1 Badanie cytotoksyczności limfocytów Tc i NK w stosunku do komórek docelowych Barwniki fluorescencyjne wnikające do komórek martwych (analogicznie do błękitu trypanu): bromek etydyny (EB) jodek propidyny (PI) Barwniki fluorescencyjne wnikające do komórek żywych: dwuoctan fluoresceiny (FITC) Ocena właściwości biologicznych plemników Żywotność: znakowanie jodkiem propidyny (PI) Ruchliwość, morfologia, zmiany w obrębie błony komórkowej podczas procesu kapacytacji i reakcji akrosomalnej: znakowanie chlorotetracykliną (CTC) i aneksyną V - zmiany związane ze wstawką, rzadziej główką, zwykle PI - pozytywne Ocena zawartości DNA jako czynnik prognostyczny skuteczności zapłodnienia (% zapłodnionych oocytów): znakowanie oranżem akrydyny (AO), jodkiem propidyny (PI) Ocena masy i potencjału energetycznego mitochondriów za pomocą Mito Tracker Green FM i JC-1 16

17 Ocena żywotności bakterii Znakowanie bakterii wyhodowanych na standardowym podłożu i inkubowanych z antybiotykami Analiza cytometryczna zastępuje godzinną hodowlę, która ma miejsce przy rutynowym oznaczaniu antybiogramu Zastosowanie GFP Green fluorescent protein GFP - Pik niebieski: komórki, w których badana jest obecność określonego genu GFP+ Pik zielony: komórki transfekowane z białkiem GFP Pik czerwony: komórki nietransfekowane z dodatkiem 5% komórek transfekowanych z białkiem GFP Zastosowanie cytometrii Analiza cyklu komórkowego Apoptoza Obecność i ekspresja receptorów powierzchniowych oraz gęstość receptorów związanych z chemotaksją, adhezją i agregacją Fagocytoza i ocena metabolizmu tlenowego Kinetyka uwalniania cytokin wewnątrzkomórkowych i ich aktywność Kinetyka zmian wewnątrzkomórkowego ph i Ca 2+ Badania płynności i depolaryzacji błony komórkowej 17