Warszawski Uniwersytet Medyczny Centrum Biostruktury

Transkrypt

1 Warszawski Uniwersytet Medyczny Centrum Biostruktury mgr Zofia Felicja Bielecka Trójwymiarowe modele normo- i hipoksyjne lekoopornych komórek macierzystych raka nerkowokomórkowego praca doktorska Praca wykonana pod kierunkiem Prof. dr hab. n. med. Cezarego Szczylika w Studium Medycyny Molekularnej Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego oraz w Laboratorium Onkologii Molekularnej Wojskowego Instytutu Medycznego w Warszawie Warszawa, 2018

2 Streszczenie Wstęp Rak nerkowokomórkowy (RCC) należy do najbardziej śmiertelnych nowotworów układu moczowo-płciowego, obejmując jednocześnie szereg typów histologicznych, różniących się pomiędzy sobą na poziomie molekularnym. Przykładowo, unikatową cechą raka jasnokomórkowego (ccrcc) jest tworzenie się tzw. pseudo-hipoksji w konsekwencji mutacji genu vhl (von Hippel-Lindau), co prowadzi do utraty prawidłowego funkcjonowania tego genu, i - w konsekwencji - stałej, nieprzerwanej aktywacji czynnika 1- α indukującego hipoksję (hif-1α). Z kolei w rakach brodawkowatych (papilarnych, prcc) nerki, vhl nie ulega mutacji w ogóle (1), a stosunkowo wciąż niewielka wiedza na temat jego szlaków sygnałowych sprawia, że według aktualnych wytycznych wciąż jednym w preferowanych postępowań przy diagnozie prcc pozostaje włączenie do badania klinicznego. Hipoksja jest kluczowym czynnikiem mającym wpływ na proces transkrypcji poprzez modulację ekspresji białek, co zostało udowodnione w raku trzustki (2). Do tej pory uważano, że obecność hipoksji nowotworowej jest powiązana z gorszym rokowaniem oraz indukowaniem lekooporności na chemioterapię guzów litych (3). Pomimo odkrycia i wdrożenia nowych terapii antyangiogennych (m.in. inhibitorów kinaz tyrozynowych, TKI), u pacjentów w dalszym ciągu obserwuje się lekooporność zarówno typu pierwotnego, jak i lekooporność nabytą. W maju 2018 roku na najnowszej, zaktualizowanej liście leków refundowanych w Polsce pojawiły się co prawda nowe terapie, a wśród nich immunoterapia niwolumab, oraz kolejny TKI kabozantynib, oba dostępne w drugiej linii leczenia. Jednak, przełamywanie oporności na stosowane terapie wciąż stanowi wyzwanie zarówno naukowe, jak i kliniczne. Jedną z możliwości jest poszukiwanie białek o zmienionej ekspresji u chorych z lekoopornością. Wprowadzenie do praktyki badawczej trójwymiarowych modeli in vitro wydaje się być kluczowe dla odtworzenia w największym możliwym zakresie szlaków molekularnych typowych dla niższego ciśnienia parcjalnego tlenu, jak i oddziaływań międzykomórkowych charakterystycznych dla struktury guza. Mimo że w przypadku TKI, które są lekami antyangiogennymi, niemożliwa jest ocena efektu podobnego do klinicznego in vitro bez utworzenia modelu angiogenezy, bezpośredni efekt TKI na komórki RCC został już zaobserwowany (50) i wniósł nową wiedzę do mechanizmów lekooporności, m.in. na sunitynib. Na użytek niniejszej pracy, autorka używa terminu lekooporności komórkowej w celu opisania efektu cytostatycznego TKI na komórki RCC w hodowli in vitro.

3 Cel badania Celem pierwszym była ocena molekularnych efektów hipoksji na komórki ccrcc oraz prcc traktowane TKI, w tym linię komórkową z subpopulacją komórek macierzystych. Celem drugim była analiza bezpośredniej odpowiedzi komórek raka jasno- i niejasnokomórkowego, oraz komórek macierzystych raka nerki na TKI w niskim ciśnieniu parcjalnym tlenu. Celem trzecim było stworzenie pierwotnej wersji nowego modelu do badań RCC in vitro, który uwzględniałby jednocześnie: trójwymiarowość guza, warunki hipoksyjne oraz subpopulację nowotworowych komórek macierzystych, aby w sposób bardziej zbliżony do rzeczywistości aniżeli hodowle 2D odtworzyć warunki panujące w RCC in vivo. Materiały i metody Do badania użyto linii komórkowych ccrcc oraz linii prcc, w tym linii prcc z subpopulacją komórek macierzystych HKCSCs (Celprogen, Inc.). Aby ocenić wpływ warunków hodowli RCC w 2D i 3D oraz wpływ hipoksji, zastosowano jeden model hodowli RCC w monowarstwie oraz dwa modele 3D: w miękkim agarze oraz w zawiesinie. Do celów optymalizacji procesu przetestowano szereg pożywek do hodowli trójwymiarowych lub dedykowanych komórkom macierzystym. Żywotność komórek w strukturach 3D oceniono przy użyciu czerwieni obojętnej. Wpływ hipoksji na cykl komórkowy oceniono za pomocą reagentu zawierającego barwnik wybarwiający jądrowe DNA interkalujące, jodek propidyny oraz RNAzę A (Muse Cell Cycle Assay). Wpływ hipoksji na udział procentowy komórek proliferujących oceniono za pomocą zestawu Muse Ki67 Proliferation Assay, który wykorzystuje ekspresję Ki67. Modulację ekspresji białek poprzez hipoksję i dodanie TKI zbadano przy użyciu analizy spektrometrii mas; wyniki potwierdzono za pomocą reakcji Western blot. Zbadano także ekspresję określonych genów związanych z macierzystością oraz kluczowych genów wyłonionych do dalszej analizy po MS: cd105, cd133, eif4b, map2k1, a także targetów TKI: vegfr-1, braf and c-kit, za pomocą qreal-time PCR. Warunki hodowli komórek w normoksji: 37 C, 5% CO 2, 95% O 2 oraz atmosfera nasycona H 2 O produkująca 17,8% O 2 ; warunki hipoksji wygenerowano poprzez zastąpienie powietrza czystym N 2 aby osiągnąć 1% O 2.. Wyniki Hipoksja wpływa na ekspresję receptorów TKI w komórkach RCC oraz markerów powierzchniowych komórek macierzystych. Co więcej, odmienne wartości ciśnienia parcjalnego tlenu indukują odmienną odpowiedź na TKI. Komórki prcc (HKCSCs), hodowane w hipoksji, wyindukowały reakcję określoną jako pierwotna lekooporność komórkowa na sorafenib; hodowane w normoksji, wyindukowały pierwotną lekooporność komórkową na aksytynib. Oba zjawiska zaobserwowano wyłącznie w komórkach papilarnego raka nerki z subpopulacją komórek macierzystych.

4 Analiza metodą cytometrii przepływowej wykazała, że hipoksja powoduje spadek tempa proliferacji we wszystkich liniach RCC. Niezależnie od statusu vhl, hipoksja powodowała spadek wzrostu komórek RCC w modelach 2D i 3D. Zaobserwowano także wzrost ilości lekoopornych komórek HKCSCs w stanie wyciszenia (Ki67-) oraz komórek wykazujących areszt w fazie S cyklu komórkowego względem kontroli nietraktowanej. Niskie ciśnienie parcjalne tlenu wpłynęło także na modulację ekspresji białek (m.in. map2k1, eif4b). Zarówno hipoksja, jak i traktowanie TKI zmieniają ekspresję markerów powierzchniowych typowych dla komórek macierzystych oraz targetów TKI - niektóre targety TKI nie eksprymują w prcc. c105 wydaje się być potencjalnym celem terapeutycznym w papilarnym RCC z subpopulacją komórek macierzystych. Wnioski i perspektywy Hipoksja wpływa na komórki RCC; efekt traktowania TKI in vitro różni się w zależności od wartości ciśnienia parcjalnego tlenu, indukując pierwotną lekooporność komórkową w RCC. Badania przeprowadzone w warunkach hipoksji oraz z uzyskaniem struktur 3D o średnicy >200 m pozwoliły udowodnić zachodzenie mechanizmu indukcji lekooporności, gdy możliwa była nawet częściowa rekonstrukcja niszy macierzystych komórek nowotworowych. Przyjmując, że ekspozycja komórek na hipoksję wpływa na zmiany w transkrypcji i translacji białek zaangażowanych m.in. w przeżycie komórki, ta wiedza oraz możliwość imitowania zmieniającego się mikrośrodowiska nowotworu prawdopodobnie pozwoli na obranie prawidłowego kursu projektowaniu nowych terapii (4). Dalsze badania powinny pozwolić na ustalenie, czy geny o zmienionej ekspresji, takie jak c105 lub białka (map2k1, eif4b) mogą stanowić potencjalny cel terapeutyczny dla bardziej efektywnych strategii anty-prcc.

5 Abstract Introduction Renal cell carcinoma (RCC) is the most lethal urogenitary cancer of various histotypes which in turn differ in their molecular pattern. Clear-cell renal cell carcinoma s unique feature is pseudo-hypoxia, resulting from von Hippel-Lindau (vhl) mutation, leading to its loss of function, which in turn results in constant activation of the hypoxia inducible factor 1-α (hif-1α). In contrast, in papillary RCCs, vhl is not mutated (1); due to still relatively low knowledge on signaling pathways influencing prcc, the preferred mechanism of action when diagnosing prcc is participation of the patient in clinical trial. Hypoxia is a crucial factor influencing transcription process via protein modulation, which was shown in pancreatic cancer (2). Until now, tumor hypoxia has been defined as associated with poorer outcome and inducing chemotherapy resistance in solid tumors (3). Despite the introduction of new antiangiogenic targeted therapies (inter alia tyrosine kinase inhibitors, TKIs), patients still develop both primary and acquired resistance. In May 2018 on the newest, actualized reimbursement list in Poland, new drugs have been added, including immunotherapy nivolumab, and a new TKI cabozantinib, both available in 2 nd line treatment. Overcoming resistance to TKIs in renal cell carcinoma is still scientifically and clinically demanding, but may be possible by finding more proteins of altered expression. To do this, hypoxic 3D in vitro models must be developed to mimic both molecular pathways typical for lower oxygen tension, as well as cell dynamics in tumor-imitating spatial structures. Although in the case of TKIs, which are antiangiogenic molecules, it is impossible to assess the similar-to-clinical effect in vitro without an angiogenesis model, the direct effect of TKIs on RCC cells has already been under investigation (50) and provided insights into mechanisms of drug resistance. For the purposes of this study, the author used the term cellular TKI resistance was used for the description of cytostatic effect of TKIs on RCC cells. Aims of the study The primary aim was to evaluate the molecular effects of hypoxia on TKIs-treated renal cancer cells of various histopathological origin, including papillary RCC stem cells (containing a subpopulation of cd133+ cells). The second aim of this study was to analyze the direct response to TKI in low oxygen tension in clear-cell and non-clear cell RCCs. The third aim was to establish a new model of renal cell carcinoma in vitro, which would include: threedimensionality of the tumor, hypoxic conditions and a subpopulation of cancer stem cells to better mimic RCC in vivo conditions than in 2D cell cultures.

6 Materials and Methods Clear-cell RCC cell lines and papillary RCC stem cell line: HKCSCs (Celprogen, Inc.) were used in the study. To compare 2D and 3D culture conditions, as well as to assess the impact of lower oxygen tension, one monolayer and two three-dimensional hypoxic and normoxic models were used: soft agar and suspension cultures. For the purposes of optimization process, various 3D/stem-cell dedicated culture media were tested. Cell viability in 3D structures was assessed using Neutral Red uptake. Hypoxia influence on cell cycle was assessed by using premixed reagent which includes the nuclear DNA intercalating stain propidium iodide (PI) and RNAse A in a proprietary formulation (Muse Cell Cycle Assay). Hypoxia impact on the percentage of proliferating cells was assessed by Muse Ki67 Proliferation Assay which utilizes Ki67 expression to identify proliferating cells and distinguish them from non-proliferating cells. Hypoxia-mediated modulation and TKI influence of protein expression were determined by mass spectrometry analysis and further confirmed by western blotting. cd105, cd133, eif4b, map2k1 genes and TKI targets such as: vegfr-1, braf and c-kit, were studied by qreal-time PCR. Cell culture conditions were: 37 C, in 5% CO 2, 95% air and H 2 O-saturated atmosphere producing 17,8% O 2 ; hypoxia was generated by replacing the air by pure N 2 to reach 1% O 2. Results Papillary RCC stem cells HKCSCs, cultured in hypoxia, developed primary cellular resistance to sorafenib, while HKCSCs cultured in normoxia developed primary cellular resistance to axitinib. This phenomenon was observed in papillary renal cancer stem cells, but not in clear-cell RCC. Flow cytometry analysis revealed that hypoxia decreased proliferation rates in all investigated RCC cells. Regardless of vhl status, hypoxia decreased both papillary and clearcell renal cancer cell proliferation rates in 2D and 3D models. In resistant HKCSCs, there was an increase of quiescent cells (Ki67-) and cells arrested in S phase comparing to the untreated samples. Low oxygen tension caused modulation of protein expression (inter alia map2k1 & eif4b; expression of the latter was decreased by hypoxia regardless of TKI treatment). Hypoxia as well as TKI addition altered surface markers typical for stem cells and TKI receptor repertoire s expression. Some TKI targets are not expressed in papillary RCC. cd105 may serve as potential therapeutic target in papillary RCC with cancer stem cells subpopulation. The role of eif4b also needs further investigated in hypoxic tumors.

7 Conclusions and perspectives Hypoxia affects RCC cells and the in vitro effect of TKI treatment differs depending on oxygen concentration. Hypoxia facilitates primary cellular resistance induction in RCC. The studies performed in hypoxia with 3D structures of diameter >200 m permitted to evidence the induction of resistance by cells possibly mimicking some of the conditions of the stem niche. Given that exposure of the cells to hypoxia affects transcription and translation of proteins involved in cell survival, the knowledge of such influence on the resulting microenvironment might be of direct value for the design of new therapies (2). Further studies may determine if genes with altered expression, such as cd105 or proteins (eif4b, map2k1) may actually serve as potential molecular targets for more effective anti-prcc strategies.