Uniwersytet Łódzki. Wydział Biologii i Ochrony Środowiska. prof. dr hab. Wanda M. Krajewska Katedra Cytobiochemii UŁ Łódź, 26 stycznia 2016 roku

Transkrypt

1 Uniwersytet Łódzki Wydział Biologii i Ochrony Środowiska prof. dr hab. Wanda M. Krajewska Katedra Cytobiochemii UŁ Łódź, 26 stycznia 2016 roku O C E N A pracy doktorskiej mgr. Tomasza Wrzesińskiego pt. Transcriptome analysis of cell renal cell carcinoma tumors focus on the expression of transmembrane protein genes Przedstawiona do oceny praca doktorska przygotowana została pod kierunkiem dr hab. Joanny Wesoły, prof. UAM i wykonana w Pracowni Technologii Wysokoprzepustowych Instytutu Biologii Molekularnej i Biotechnologii Uniwersytetu im. Adama Mickiewicza w Poznaniu. Zespół prof. UAM J. Wesoły od kilku lat z powodzeniem zajmuje się genomiką strukturalną i funkcjonalną, specjalizując się w wykorzystaniu zaawansowanych technik wysokoprzepustowych. Problematyka badawcza dysertacji wpisuje się w nurt badań dotyczących podstaw molekularnych transformacji nowotworowej i poszukiwania znaczników molekularnych, nie tylko spełniających wymogi markerów o znaczeniu diagnostycznym, prognostycznym czy mających zastosowanie w monitorowaniu efektywności leczenia choroby nowotworowej, ale mogących również stanowić cel molekularny strategii terapeutycznych. Abstrahując od faktu, że brak jest uniwersalnego biomarkera pozwalającego stwierdzić, że w organizmie rozwija się nowotwór (o ile w ogóle taki marker zostanie zidentyfikowany), to obecnie stosowane w diagnostyce medycznej biomarkery bardzo często dają wyniki fałszywie ujemne lub fałszywie dodatnie, ze względu na ich niższą niż oczekiwane swoistość, co w pełni uzasadnia podejmowane w wielu laboratoriach badania. 1

2 Obiektem badawczym ocenianej pracy jest rak jasnokomórkowy nerki (ccrcc) będący najczęstszym typem histologicznym raka tego narządu. Uznanym biomarkerem raka jasnokomórkowego nerki jest gen supresorowy VHL. Odkrycie roli kompleksu zawierającego białko kodowane przez gen VHL w regulacji odpowiedzi komórki na hipoksję zależną od czynnika transkrypcyjnego HIFα, przyczyniło się do opracowania terapii celowanej raka jasnokomórkowego nerki. Jednak przeprowadzone metaanalizy, w tym przez zespół prof. UAM J. Wesoły, wykazały istnienie molekularnych podtypów raka jasnokomórkowego nerki różniących się między innymi poziomem ekspresji genu VHL. Rozprawę doktorską mgr. T. Wrzesińskiego stanowi przygotowane w języku angielskim opracowanie liczące 196 stron. Praca ma typowy układ dla dysertacji doktorskich w zakresie nauk przyrodniczych. Składa się z czterech zasadniczych części obejmujących opracowanie literaturowe wprowadzające w tematykę rozprawy, opis stosowanych metod badawczych, prezentację wyników oraz ich dyskusję. W kolejnych rozdziałach wstępu przedstawiono obecny stan wiedzy odnośnie do raka jasnokomórkowego nerki, ze szczególnym uwzględnieniem szlaków przekazywania sygnałów, transkryptomu oraz białek przezbłonowych/ transmembranowych. Wszystkie zagadnienia przedstawiono w sposób bardzo przejrzysty i co należy podkreślić, odpowiednio zilustrowano. Tak przygotowany wstęp teoretyczny jest bez wątpienia właściwym wprowadzeniem do części eksperymentalnej. Potwierdzeniem szerokiej wiedzy Doktoranta w zakresie problematyki badawczej przedstawionej w części teoretycznej jest Jego współautorstwo w pracy poglądowej opublikowanej w 2013 roku w międzynarodowym czasopiśmie Cancer Letters. Celem pracy było: 1. Porównanie transkryptomów raka jasnokomórkowego nerki w odniesieniu do stopnia zaawansowania procesu nowotworowego, a także statusu VHL, tj. nowotworów o niezmienionym poziomie ekspresji genu VHL oraz nowotworów o zmniejszonym poziomie ekspresji genu VHL. 2. Przybliżenie mechanizmów odpowiedzialnych za zidentyfikowane we wcześniejszych badaniach pod kierunkiem prof. UAM J. Wesoły, zaburzenia ekspresji genów TMEM kodujących białka transmembranowe oraz predykcję ich organizacji strukturalnej i wewnątrzkomórkowej lokalizacji. 2

3 Badania zrealizowano z wykorzystaniem innowacyjnych metod eksperymentalnych i zaawansowanych analiz bioinformatycznych, w tym wysokoprzepustowego sekwencjonowania transkryptomów za pomocą techniki RNA-Seq, genotypowania za pomocą technologii Illumina Infinium, mikroskopii konfokalnej i techniki FRAP. Bardzo cenne jest przedstawienie w pracy informacji dotyczących narzędzi badawczych w formie przemyślanych schematów, co potwierdza pełne zrozumienie stosowanych technik przez Doktoranta. Materiał badawczy stanowiły, w zależności od stosowanej techniki, preparaty materiału nowotworowego oraz preparaty materiału prawidłowego otrzymywanego w przypadku radykalnej nefrektomii. Materiał badawczy uzyskiwano w ramach współpracy z Katedrą i Kliniką Urologii i Onkologii Urologicznej Uniwersytetu Medycznego im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu. Przeprowadzone zostały szczegółowe analizy porównawcze transkryptomów komórek nowotworowych i komórek prawidłowych, z uwzględnieniem nowotworów nie dających i dających przerzuty, wielkości ogniska pierwotnego zgodnie z klasyfikacją kliniczną TNM, stopnia zróżnicowania histopatologicznego w czterostopniowej skali Susan Fuhrman oraz w odniesieniu do poziomu ekspresji genu VHL. Profilowanie ekspresji genów z użyciem sekwencjonowania nowej generacji wskazało na zaburzenia w ekspresji ogółem 6281 genów, co najlepiej oddaje wysoki stopień trudności jaki niesie za sobą analiza transkryptomów. Wykazano różnice w zależności zarówno od stopnia zaawansowania procesu nowotworowego, jak i statusu genu VHL. Wykazano, że w porównaniu do materiału prawidłowego zasadnicza różnica w przypadku nowotworów o zmniejszonej ekspresji VHL dotyczy ekspresji genów związanych z biogenezą rybosomów, podczas gdy w przypadku nowotworów o niezmienionej ekspresji VHL genów kodujących białka uczestniczące w fosforylacji oksydacyjnej. Szczególnie warte podkreślenia jest odniesienie ekspresji genów do określonych szlaków sygnalizacyjnych i charakterystykę molekularną badanego materiału nie poprzez pryzmat mutacji genów, ale zaburzonego przekazywania sygnałów. Wobec ogromnej różnorodności molekularnej nowotworów wywodzących się nawet z tego samego typu komórek, badania ostatnich lat koncentrują się na identyfikacji zaburzonych ścieżek sygnałowych. Hierarchiczna organizacja produktów białkowych zmutowanych genów w przekazywaniu sygnałów we wszystkich nowotworach pozwala mieć nadzieję na 3

4 ustalenie mniej złożonych niż w przypadku genów, prawidłowości w odniesieniu do transformacji nowotworowej. Spośród genów o zaburzonej ekspresji w dalszych analizach skupiono się na 10 genach TMEM kodujących białka transbłonowe, których deregulacja w raku jasnokomórkowym nerki została zidentyfikowana we wcześniejszych badaniach zespołu. Stosując technikę RNA-Seq potwierdzono zmiany poziomu mrna w przypadku 8 z 10 wytypowanych genów TMEM. Poszukując mechanizmów odpowiedzialnych za zmiany poziomu ich ekspresji przeprowadzono genotypowanie aberacji chromosomowych w loci tych genów metodą Infinium. Za pomocą analiz in silico określono potencjalne miejsce wiązania czynników transkrypcyjnych w regionach promotorowych, obecność wysp CpG w obszarze około 2000 pz powyżej miejsca startu transkrypcji, strukturę przestrzenną kodowanych białek i podobieństwa do określonych rodzin białek, a także wewnątrzkomórkową lokalizację. Wykazano, że aberacje chromosomowe nie wydają się być głównym mechanizmem odpowiedzialnym za zaburzenia ekspresji genów TMEM. Wytypowanie miejsc wiązania czynników transkrypcyjnych w połączeniu z wynikami RNA-Seq pozwoliło wskazać te białka o funkcji regulatorów transkrypcji, których zaburzenia ekspresji mogą być zaangażowane w zmiany ekspresji genów TMEM. Większość badanych białek TMEM wydaje się być zlokalizowana w reticulum endoplazmatycznym. W przypadku białka TMEM213 wyniki przeprowadzonych eksperymentów potwierdzają jego obecność w błonach wewnątrzkomórkowych. Wyniki badań zawarto w 20 tabelach i zaprezentowano na 10 złożonych rycinach przygotowanych na podstawie szczegółowej analizy uzyskanych wyników. Rozdział zawierający wyniki oraz ich dyskusja napisane zostały w sposób potwierdzający zarówno znajomość stosowanych metod badawczych, jaki i wiedzę Doktoranta. Warto podkreślić, że dyskusja wyników nie kończy się tradycyjnie tylko wnioskami lecz Autor przedstawia plan dalszych badań, których celem będzie pogłębienie wiedzy z zakresu biologii molekularnej raka jasnokomórkowego nerki i eksperymentalną weryfikację wyników analiz in silico. Szczególnie istotne dla ostatecznego wnioskowania będą miały wyniki badania ekspresji genów nie tylko na poziomie mrna, ale również białka. Między poziomem mrna i białka nie zawsze ma miejsce prosta zależność. Podobnie cennych informacji mogą dostarczyć analizy w kontekście parametrów klinicznych i statusu VHL. Efekty fenotypowe wielu białek o zaburzonej ekspresji mają często charakter plejotropowy. Na przykład przemiana 4

5 epitelialno-mezenchymalna (ETM) i w konsekwencji metastaza promowane są przez TGFβ, który w mniej zaawansowanych stadiach hamuje rozwój i progresję nowotworu. Lektura ocenianej rozprawy doktorskiej nasuwa następujące uwagi i pytania: 1. Jak Autor mógłby skomentować różnice w ekspresji określonych genów zidentyfikowane w przypadku grup o różnej liczności (np. str. 80). 2. W opisie materiału klinicznego podano, że materiał nowotworowy pobierano z dwóch, tj. centralnej oraz peryferyjnej części guza (str. 34). Czy obserwowano zatem różnice w transkryptomach w zależności od miejsca pobrania materiału biologicznego, szczególnie w kontekście genu VHL. Nowotworowy zawierają subpopulacje komórek różniące się genotypowo i fenotypowo, a komórki położonej w centrum guza są bardziej narażone na hipoksję. 3. Z informacji podanej na stronie 105 i zawartej w tabeli 20 wynika, że nie stwierdzono obecności wysp CpG w przypadku trzech genów TMEM, tj. TMEM213, TMEM72 i RTP3, podczas gdy na stronie 122 podano, że dotyczy to tylko genów TMEM213 i RTP3, proszę o wyjaśnienie. 4. Polemizowałabym z zaliczeniem genów/białek TMEM do czynników etiologicznych (np. str 4, 121), szczególnie że zaburzenie ekspresji określonego genu może być nie tylko przyczyną, ale również skutkiem transformacji nowotworowej. 5. Polemizowałabym również ze stosowanym w streszczeniu pracy w języku polskim określeniem tkanka nowotworowa, jakkolwiek wynika ono z bezpośredniego tłumaczenia z języka angielskiego. Zgodnie z definicją tkanka to zespół komórek o podobnej budowie i wyspecjalizowanej funkcji, a kryteriów tych guzy nowotworowe nie spełniają. Z formalnego punktu widzenia rozprawa została przygotowana z dużą starannością. W pracy wykorzystano 228 pozycji literaturowych. Przejrzystość rozprawy wzbogaca wykaz skrótów i symboli oraz streszczenie w języku polskim i angielskim. Bardzo wartościowe jest zamieszczenie w formie 12 załączników dokumentacji z prowadzonych analiz. Dla pełności informacji zabrakło jedynie wykazu dorobku naukowego Doktoranta. Mam następujące uwagi dotyczące edycji pracy: - zbyt mała czytelność niektórych rycin (np. ryc ), 5

6 - brak odnośnika literaturowego przy ryc. 7; domyślam, że jest to opublikowana praca której Doktorant jest współautorem, - na stronie 103 (7 linia od dołu) odniesienie powinno być chyba do tabeli 19, a nie jak podano do tabeli 17, - brak numeru pozycji literaturowej w przypadku powoływania się w tekście na konkretnych autorów/autora; miałoby to rację bytu w przypadku alfabetycznego układu piśmiennictwa, a nie według kolejności cytowania, co zastosowano w pracy. Podsumowanie Pracę doktorską mgr. Tomasza Wrzesińskiego pt. Transcriptome analysis of cell renal cell carcinoma tumors focus on the expression of transmembrane protein genes oceniam w pełni pozytywnie. Przedstawiona dysertacja jest dowodem znaczącej aktywności Doktoranta jako badacza. Na uznanie zasługuje opanowanie przez Niego bogatego, nowoczesnego warsztatu badawczego. Praca zawiera wyniki oryginalnych poszukiwań i stanowi istotny wkład do wiedzy odnośnie do biologii molekularnej raka jasnokomórkowego nerki, a co należy podkreślić uzyskane wyniki inspirują do formułowania kolejnych wyzwań badawczych. O wartości poznawczej przedstawionych w dysertacji wyników świadczy fakt opublikowania części z nich w artykule, którego mgr T. Wrzesiński jest pierwszym autorem, a który ukazał się w 2015 roku w czasopiśmie BMC Cancer o 5-letnim współczynniku oddziaływania 3,77. Jestem przekonana, że przedstawione wyniki oprócz wniesionych wartości poznawczych mogą mieć znaczenie praktyczne w kontekście efektywności stosowanych strategii terapeutycznych w przypadku pacjentów z niezmienioną i zmienioną ekspresją genu VHL. Biorąc powyższe pod uwagę, stwierdzam, że rozprawa doktorska mgr. Tomasza Wrzesińskiego spełnia wymogi art. 13 ustawy o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki z dnia 14 marca 2003 roku z późniejszymi zmianami (Dz.U. nr 65, poz. 595 z póź. zm.; Dz.U. z 22 grudnia 2014, poz. 1852, tekst jednolity). Zwracam się zatem do Rady Wydziału Biologii UAM o przyjęcie rozprawy i dopuszczenie mgr. Tomasza Wrzesińskiego do dalszych etapów przewodu doktorskiego. 6