APARATURA BADAWCZA I DYDAKTYCZNA

Transkrypt

1 APARATURA BADAWCZA I DYDAKTYCZNA ptymalizacja warunków ekstrakcji związków fenolowych ogółem i aktywności przeciwutleniającej z ziarna pszenicy ANNA PRZYBYLSKA, KINGA STUPER-SZABLEWSKA, ANNA MATYSIAK, JULIUSZ PERKWSKI UNIWERSYTET PRZYRDNICZY W PZNANIU, WYDZIAŁ TECHNLGII DREWNA, KATEDRA CHEMII Słowa kluczowe: ekstrakcja, związki fenolowe, aktywność przeciwutleniająca, pszenica STRESZCZENIE: Bogatym źródłem związków przeciwutleniających jest ziarno pszenicy. Na zawartość polifenoli wpływają m.in. czynniki genetyczne (odmiana) i środowiskowe (rodzaj uprawy, warunki atmosferyczne, narażenie na stresy), a także procesy technologiczne. W związku z powyższym ważny jest dobór optymalnych parametrów procesu ekstrakcji polifenoli z ziarna pszenicy. Celem niniejszych badań było dobranie najbardziej optymalnych warunków do przeprowadzenia ekstrakcji związków fenolowych ogółem z ziarna pszenicy ozimej w celu oznaczenia ilościowego polifenoli ogółem metodą Folina- -Ciocalteu. Materiałem badanym było ziarno pszenicy ozimej Muszelka (Instytut Hodowli i Aklimatyzacji w Radzikowie). Do ekstrakcji związków fenolowych przygotowano metanol oraz jego 90%, 80% i 75% roztwory wodne. Po przygotowaniu rozdrobnionej naważki pszenicy o masie 10 g zalewano ją 50 cm 3 mieszaniny ekstrakcyjnej. Następnie poddawano mieszaninę działaniu ultradźwięków w 3 wariantach przez okres: 10, 20 i 30 minut. W kolejnych etapach próby sączono pod próżnią, supernant odparowywano na wyparce, a suche ekstrakty przenoszono za pomocą MeH o czystości HPLC do fiolek i odparowywano do sucha w strumieniu azotu. Analizę związków fenolowych ogółem przeprowadzono stosując metodę Folina Ciocalteu. Zawartość polifenoli analizowano za pomocą spektrofotometru UV-Vis (Spectronic 200 Thermo Scientific) przy długości fali λ = 760 nm. Całkowitą zawartość związków fenolowych wyrażono w mg/kg, w przeliczeniu na kwas galusowy. Następnie stosując roztwór podstawowy ABTS, oznaczano spektrofotometrycznie (λ = 760 nm) aktywność przeciwutleniającą, którą wyrażono w μmol Trolox / 100 g próby, wobec krzywej wzorcowej. Uzyskane wyniki analizy aktywności przeciwutleniającej polifenoli pochodzących z ziarna pszenicy z różnych wariantów doświadczenia wykazują, że najbardziej skutecznym sposobem ekstrakcji było zastosowanie metanolu jako rozpuszczalnika i poddanie próby 30-minutowej ekstrakcji wspomaganej ultradźwiękami. Podobne rezultaty dała 90% mieszanina metanolu i wody, stosowana w tym samym czasie. Supernanty uzyskane podczas ekstrakcji z zastosowaniem 75% roztworu metanolu, wspomaganej ultradźwiękami przez okres 10 i 20 minut, cechowały się najmniejszą aktywnością przeciwutleniającą. Efektywność analizy mającej na celu określenie zawartości związków fenolowych ogółem dla metanolu podczas ekstrakcji wspomaganej ultradźwiękami przez 20 i 30 minut okazała się najwyższa. Z kolei ekstrakcja przeprowadzona przez okres 10 minut we wszystkich wariantach rozpuszczalników była najmniej skuteczna. ABiD 1/2018 3

2 ptimization of extraction conditions of total phenol compounds and antioxidant activity in grain wheat Keywords: extraction, phenol compounds, antioxidative activity, wheat ABSTRACT: The rich source of antioxidants is the wheat grain. The concentration of polyphenols in wheat grain is influenced by many factors, e.g. genetic, environmental and technological. Therefore, it is important to choose optimal conditions for extraction of polyphenols from wheat grain. The purpose of these studies was to select the most optimal conditions for the extraction of phenolic compounds from winter wheat grain. For this purpose a method was used Folin-Ciocalteu. The material studied was winter wheat seed Muszelka (Plant Breeding and Acclimatization Institute (IHAR) National Research Institute in Radzików). Extraction of polyphenols was used methanol and its 90%, 80% and 75% aqueous solutions. After preparation of 10 grams of wheat weight, it was poured 50 cm 3 of extraction. Subsequently, ultrasound was performed in 3 variants for 10, 20 and 30 minutes. After filtered of the vacuum, the supernatant was evaporated on a rotary evaporator, dry extracts were transferred by HPLC to the vials and evaporated to dryness under a stream of nitrogen. Polyphenol content analyzed by method UV-Vis spectrophotometry (Spectronic 200 Thermo Scientific) at wavelength λ = 760 nm. Total phenol content expressed in mg/kg, calculated as gallic acid. A spectrophotometric confirmation (λ = 760 nm). An ABTS solution was used to determine the antioxidant activity. The antioxidant activity of polyphenols was expressed in μmol of the Trolox / 100 g sample, relative to the calibration curve. Data on antioxidant activity vary according to the variant of the sample. The best parameters were obtained using a 30 minutes ultrasonically assisted extraction with methanol. Total phenolic content of methanol using ultrasound-assisted extraction for 20 and 30 minutes was the highest. Whereas the extraction performed over 10 minutes period in all solvent variants was the least effective. 1. WSTĘP Ziarno pszenicy jest ważnym źródłem substancji odżywczych oraz bioaktywnych z uwagi na szerokie zastosowanie zarówno w przemyśle paszowym, jak i spożywczym. Występujące w nim związki przeciwutleniające stanowią obszerną grupę substancji naturalnych. Spośród nich należy wyróżnić polifenole, które różnią się między sobą strukturą podstawowego szkieletu węglowego. Są to kwasy fenolowe i flawonoidy oraz inne związki bioaktywne (Rys. 1). Cechą charakterystyczną wyżej wymienionych związków jest to, że przy małym stężeniu opóźniają one bądź też zapobiegają procesom utleniania. Działanie przeciwutleniające omawianych polifenoli polega między innymi na bezpośredniej reakcji z wolnymi rodnikami, czyli na tzw. zmiataniu wolnych rodników. Wolne rodniki to atomy lub cząsteczki posiadające na orbitalu walencyjnym niesparowany elektron, a ich formy aktywne przedstawiono w Tabeli 1. Tabela 1 Przykłady wolnych rodników AKTYWNA FRMA TLENU WZÓR Anionorodnik ponadtlenkowy Rodnik wodoronadtlenkowy H H Rodnik hydroksylowy H Tlen singletowy 1 zon 3 Nadtlenek wodoru H 2 Wolne rodniki mogą powstawać w wyniku biochemicznej oksydoredukcji w komórce roślinnej lub mogą być generowane w wyniku działania czynników biotycznych i abiotycznych. becność przedstawionych wolnych rodników może prowadzić do zaburzeń metabolicznych. Komórki roślinne wyposażone są jednak w systemy obrony przed aktywnymi formami tlenu: enzymatyczny oparty na działaniu odpowiednich enzymów oraz system nieenzymatyczny związany z działaniem antyoksydantów (Tab. 2) [1]. 45 ABiD 1/2018

3 Rysunek 1 Związki o właściwościach przeciwutleniających obecne w ziarnie pszenicy [opracowanie własne] Tabela 2 Systemy obrony przed aktywnymi formami tlenu SYSTEM BRNNY CZYNNIK PRZEBIEG REAKCJI ENZYMATYCZNY Dysmutaza ponadtlenkowa Enzym dysmutaza ponadtlenkowa 2 + 2H+ H 2 + Katalaza Nadtlenek wodoru 2H 2 2H 2 + Peroksydaza Peroksydaza askorbinianowa Peroksydaza glutationowa H 2 + AH 2 2H 2 + A NIEENZYMATYCZNY Zmiatanie wolnych rodników tlenowych Antocyjanidyny Flawonoidy Kwasy fenolowe Kwas askorbinowy Terpenoidy Zdolność do zmiatania wolnych rodników tlenowych polifenoli jest ściśle związana z ich budową. Za najbardziej aktywne uważa się antocyjanidyny i flawonoidy, posiadające w swojej strukturze liczne grupy -H w pierścieniu B. Do równie aktywnych przeciwutleniaczy należą także fenylopropanoidy. Aktywność przeciwutleniająca kwasów fenolowych rośnie również wraz ze zwiększającą się liczbą przyłączonych do pierścienia grup -H (Rys. 2). Rysunek 2 Szereg aktywności kwasów fenolowych ptymalizacja warunków ekstrakcji związków fenolowych ABiD ogółem 1/2018 i aktywności przeciwutleniającej z ziarna... 56

4 Ziarno pszenicy, a także ekstrakt z niego otrzymany, jest złożoną matrycą analityczną z uwagi na obecność licznych związków bioaktywnych oraz substancji odżywczych i nieodżywczych, które wzajemnie mogą się maskować i których obecność jest często trudna do oznaczenia. W związku z tym ważny jest dobór odpowiednich parametrów ekstrakcji oraz parametrów analitycznych. becnie stosowanych jest wiele różnych metod ekstrakcji związków przeciwutleniających z ziarna pszenicy, z których najbardziej rozpowszechnioną techniką wyodrębniania polifenoli jest ekstrakcja rozpuszczalnikowa [2]. Rozpuszczalność polifenoli jest powiązana z polarnością rozpuszczalnika, stopniem depolimeryzacji, interakcją polifenoli z innymi składnikami ziarna pszenicy bądź tworzeniem nierozpuszczalnych kompleksów. Flawonoidy w postaci glikozydów rozpuszczają się zarówno w wodzie, jak i w alkoholu etylowym oraz metylowym, natomiast aglikony w rozpuszczalnikach organicznych. W przypadku ekstrakcji związków fenolowych ogółem stosuje się rozpuszczalniki polarne: metanol, etanol i ich mieszaniny z wodą, kwasem solnym lub słabymi kwasami organicznymi, jak kwas octowy czy mrówkowy. Czas ekstrakcji polifenoli jest różny i może trwać nawet do 24 godzin, w zależności od stopnia rozdrobnienia ziarna i odmiany pszenicy, przy czym czas ten można skrócić poprzez zastosowanie łaźni ultradźwiękowej. Wydajność ekstrakcji zależy również od ilościowego stosunku masy próby do rozpuszczalnika. Najczęściej wynosi on odpowiednio od 1 do 5 10 (m/v). Związki fenolowe występujące w postaci związanej należy poddać hydrolizie alkalicznej lub kwasowej. Kolejną metodą ekstrakcji rozpuszczalnikowej jest ekstrakcja ciągła przy użyciu aparatu Soxhleta (SE), podczas której prowadzi się ekstrakcję chlorkiem metylenu, a następnie w celu wyodrębnienia frakcji fenolowej stosuje się metanol [3]. Innym sposobem ekstrakcji związków fenolowych z materiału roślinnego jest ekstrakcja za pomocą rozpuszczalnika, wspomagana ultradźwiękami (UAE) lub promieniowaniem mikrofalowym (MAE) [4, 5]. Wyodrębnianie analitów może odbywać się z wykorzystaniem zjawiska absorpcji energii mikrofalowej przez związki chemiczne. Na efektywność procesu wpływa rodzaj rozpuszczalnika (chlorek metylenu lub mieszaniny acetonu i heksanu) oraz temperatura. Kolejną stosowaną metodą jest przyspieszona ekstrakcja za pomocą rozpuszczalnika (ASE), która opiera się na wykorzystaniu 67 rozpuszczalników w podwyższonej temperaturze (w zakresie od 100 do 180 C) oraz pod zwiększonym ciśnieniem (do 140 atm). Warunki te ułatwiają penetrację matrycy przez rozpuszczalnik, desorpcję związków, w wyniku czego następuje przyspieszona rozpuszczalność analitów. Z kolei innym przykładem jest ekstrakcja wodą w stanie nadkrytycznym (SFE). Cechuje się ona wysoką selektywnością, dużą wydajnością i skróceniem czasu trwania procesu [6]. Następną metodą jest ekstrakcja za pomocą rozpuszczalnika z próbki zmieszanej z wypełniaczem (MSPD), która polega na wyizolowaniu polifenoli poprzez przepływ rozpuszczalnika przez mieszaninę rozpuszczalnika. Wówczas następuje ekstrakcja i rozdział ekstraktu na fazę ciekłą, którą jest rozpuszczalnik, oraz fazę stałą, czyli sorbent [7]. Jednym z kolejnych przykładów jest ekstrakcja do fazy stałej (SPE). Polega ona na przeniesieniu analitów występujących w fazie ciekłej do fazy stałej. SPE charakteryzuje wysoka selektywność i możliwość szybkiego oczyszczenia substancji [8]. Po odpowiednim przygotowaniu ekstraktu kolejnym etapem jest przeprowadzenie analizy jakościowej i ilościowej służących do oceny ilości przeciwutleniaczy. Do tych analiz można zaliczyć metody chromatograficzne (np. TLC, HPLC, UPLC), spektrofotometryczne oraz coraz rzadziej stosowane metody kolorymetryczne, a także elektrochemiczne, takie jak woltamperometria cykliczna i spektroelektrochemia, czy elektronowy rezonans paramagnetyczny (EPR). 1.1 Analiza aktywności przeciwutleniającej znaczanie jakościowe i ilościowe związków fenolowych i ich aktywności przeciwutleniającej w ekstraktach po wstępnym oczyszczeniu może odbywać się także poprzez zastosowanie analizy spektrofotometrycznej. Istnieje wiele metod spektrofotometrycznych stosowanych do oznaczania aktywności przeciwutleniającej, a w Tabeli 3 przedstawiono kilka najczęściej występujących. Metoda spektrofotometryczna polega na absorpcji lub emisji promieniowania elektromagnetycznego przez ekstrakt otrzymany z badanej pszenicy. Dokonuje się wówczas pomiaru natężenia promieniowania przechodzącego w funkcji długości fali. Do celów analitycznych wykorzystuje się przejścia energetyczne zachodzące w cząsteczkach na skutek oddziaływania promieniowania elektromagnetycznego w zakresie UV VIS IR. Analiza ilościowa prowadzona jest metodą spektrofotometrii UV-VIS, która oparta jest na pomia- ABiD 1/2018

5 Tabela 3 Metody spektrofotometryczne stosowane do oznaczania aktywności przeciwutleniającej w ekstraktach z ziarna pszenicy METDA ZWIĄZKI ZNACZANE ZASADA PRCESU Christa-Műllera Flawonoidy Pomiar natężenia zabarwienia Folina-Ciocalteu ABTS, DPPH, DMPD FRAP Flawonoidy Polifenole Polifenole Reakcja barwna Barwa kompleksu: zielononiebieska Na 2 W 4 /Na 2 Mo 4 + fenol (fenol-mow ) -4 Mo(VI) (żółty) + ē Mo(V) (niebieski) dbarwienie Wygaszanie syntetycznych wolnych rodników Reakcje zależne od ph, przebiegające w obecności jonów metali DCZYNNIK Trójchlorek antymonu Tlenochlorek cyrkonu ctan uranylowy Azotan berylu Kwas borowy Chlorek glinowy dczynnik Folina-Ciocalteu 2,4,6-tripirydylo-s- -triazyny (TPTZ) DŁUGŚĆ FALI [nm] LITERATURA λ = [8, 9] λ = [8, 10] λ = 734 λ = 515 λ = 505 [8, 10] λ = 593 [8, 9, 10] CUPRAC Polifenole Cu 2+ λ = 450 [8, 9, 10] rze absorbancji badanego roztworu przy określonej długości fali i wykorzystaniu prawa Lamberta- -Beera. Wykorzystuje się tu prawidłowość, że każdy związek chemiczny posiada zdolność absorpcji promieniowania przy ściśle określonej długości fali, dzięki czemu możliwa jest jego identyfikacja i tym samym przeprowadzenie analizy jakościowej. Inną metodą jest zastosowanie do przeprowadzenia analizy jakościowej i ilościowej różnych metod chromatograficznych. Do analizy związków fenolowych najczęściej używa się detektora spektrofotometrycznego, gdyż związki fenolowe absorbują promieniowanie elektromagnetyczne z zakresu UV, a flawonoidy również światło widzialne. Ponadto często stosowane są detektory fluorescencyjny i elektrochemiczny. W badaniach rzadziej wykorzystuje się spektrometr mas (MS), magnetyczny rezonans jądrowy (NMR) oraz spektroskopię w podczerwieni z transformacją Fouriera (FT-IR). Do oznaczania pojedynczych związków fenolowych stosowane są metody z wykorzystaniem połączonych technik, takich jak na przykład HPLC/MS czy HPLC/MS/MS [8, 11]. 1.2 Analiza wolnych kwasów fenolowych Do oznaczania całkowitej zawartości polifenoli w ziarnie pszenicy najczęściej stosowana jest metoda Folina-Ciocalteu (F-C) [10, 12]. Podstawą oznaczania jest odwracalna reakcja redukcji przez polifenole w środowisku alkalicznym (ph 10) molibdenu(vi) do molibdenu(v) zawartego w odczynniku Folina-Ciocalteu. W wyniku tych reakcji powstaje niebieski związek wykazujący maksimum absorpcji przy długości fali λ = nm. dczynnik Folina-Ciocalteu przygotowuje się z mieszaniny wolframianu sodu (Na 2 W 4 ), molibdenianu sodu (Na 2 Mo 4 ), siarczanu litu (Li 2 S 4 ), wody bromowej i stężonych kwasów solnego i fosforowego. Na 2 W 4 /Na 2 Mo 4 + fenol (fenol-mow ) -4 Mo(VI) (żółty) + ē Mo(V) (niebieski) Metoda ta wykorzystuje zdolność polifenoli do barwnej reakcji z odczynnikiem Folina-Ciocalteu, a absorbancja mierzona przy długości fali λ = 756 nm jest proporcjonalna do całkowitej zawartości związków fenolowych w badanej ptymalizacja warunków ekstrakcji związków fenolowych ABiD ogółem 1/2018 i aktywności przeciwutleniającej z ziarna... 78

6 próbce. Ze względu na obecność w ziarnie pszenicy innych niż polifenole związków, takich jak redukujące cukry, aromatyczne aminy, ditlenek siarki, czy kwas askorbinowy, mogą zachodzić liczne interakcje między tymi związkami a fenolami. Dla uzyskania wiarygodności wyników pomiarów należy zachować odpowiedni stosunek ilościowy zasady do odczynnika Folina-Ciocalteu oraz zoptymalizować czas i temperaturę reakcji. Jako wzorzec stosuje się kwas galusowy. Rzadziej stosowaną metodą spektrofotometryczną, która umożliwia oznaczenie całkowitej zawartości polifenoli, jest metoda wykorzystująca zdolność związków fenolowych do redukcji żelaza(iii). Powstałe zredukowane żelazo(ii) reaguje z jonami Fe 3+ wprowadzonymi w postaci roztworu FeCl 3, w wyniku czego tworzy się niebieski kompleks, który stanowi podstawę oznaczenia. Do przeprowadzenia tej analizy stosuje się błękit pruski. Pomiar absorbancji odbywa się przy długości fali λ = 700 nm. Kolejną sporadycznie używaną metodą spektrofotometryczną, która służy do oznaczenia polifenoli ogółem, jest metoda z zastosowaniem 1,10-fenantroliny. Wykorzystuje ona zdolność polifenoli do redukcji żelaza(iii) do żelaza(ii), które reagują z 1,10-fenantroliną, w wyniku czego uzyskuje się czerwony kompleks, stanowiący podstawę oznaczenia przy długości fali λ = 510 nm [10, 13]. Celem przedstawionych w niniejszej pracy badań było dobranie najbardziej optymalnych warunków do przeprowadzenia ekstrakcji związków fenolowych ogółem z ziarna pszenicy ozimej do oznaczenia ilościowego polifenoli ogółem metodą Folina-Ciocalteu. Badania takie nie były do tej pory prowadzone na ziarnie pszenicy. 2. CZĘŚĆ DŚWIADCZALNA 2.1 Materiał badany Materiał badany stanowiło ziarno pszenicy ozimej (odmiana Muszelka) pozyskane z Instytutu Hodowli i Aklimatyzacji Roślin w Radzikowie. Do analizy pobrano 8 prób jednostkowych ziarna w 3 powtórzeniach. Do ekstrakcji związków fenolowych (Rys. 3) użyto metanolu cz.d.a. oraz przygotowanych wodnych roztworów metanolu w następujących proporcjach: MeH:H 2 : 90:10, 80:20 oraz 75:25. Po rozdrobnieniu w młynku laboratoryjnym pobrano do analizy naważkę ziarna o masie 10 g, którą zalewano 50 cm 3 mieszaniny ekstrakcyjnej (4 warianty) i poddawano działaniu ultradźwięków w 3 wariantach przez okres: 10 minut, 20 minut i 30 minut. W ten sposób uzyskano 12 wariantów doświadczalnych. Następnie każdą z prób sączono pod próżnią i odparowywano supernant na wyparce próżniowej. Suche ekstrakty przenoszono za pomocą MeH o czystości HPLC (2 ml) do fiolek i odparowywano do sucha w strumieniu azotu. Przed przystąpieniem do analizy związków fenolowych ogółem ekstrakty przenoszono ilościowo MeH (HPLC) do kolb miarowych na 10 cm 3. Kolejnym etapem była analiza aktywności przeciwutleniającej ABTS + oraz analiza związków fenolowych ogółem FPA. Rysunek 3 Schemat procesów analitycznych 89 ABiD 1/2018

7 3. ZNACZANIE I WYNIKI 3.1 znaczanie aktywności przeciwutleniającej ABTS + Do oznaczenia aktywności przeciwutleniającej przygotowano roztwór składający się z 7 mm ABTS + oraz 2,45 mm K 2 S 2 3, a następnie bufor PBS (buforowana fosforanem sól fizjologiczna), który pozwala utrzymać stałe ph. Ekstrakty w odpowiednich stężeniach połączono z roztworem buforu, a następnie pobrano po 100 ml każdego z rozcieńczeń i dodano do nich po 1 ml wcześniej przygotowanego roztworu ABTS +. Aktywność przeciwutleniającą wyrażono w μmol Trolox / 100 g próby, wobec krzywej wzorcowej (Rys. 4). 100 mg/kg do 1000 mg/kg (Rys. 7). Współczynnik zmienności dla serii badań wykonywanych w warunkach powtarzalności wynosił 1,6%, a odtwarzalności wewnątrzlaboratoryjnej 2,0%. Zawartość związków fenolowych analizowano za pomocą spektrofotometru UV-Vis (Spectronic 200 ThermoScientific) przy długości fali λ = 760 nm. Rysunek 5 Krzywa wzorcowa dla kwasu galusowego w metodzie Folina-Ciocalteu w zakresie 0,1 mg/kg 10 mg/kg Rysunek 4 Krzywa wzorcowa dla Trolox 3.2 Analiza związków fenolowych ogółem Wcześniej przygotowane ekstrakty rozcieńczono wodą, a następnie pobrano po 5 ml z każdego i dodano 0,2 ml odczynnika F-C oraz 0,5 ml 7% węglanu sodu. Przeprowadzono inkubację w temperaturze pokojowej w ciemni przez 30 minut, po czym analizowano spektrofotometrycznie wobec metanolu. Całkowitą zawartość związków fenolowych wyrażono w mg/kg, w przeliczeniu na kwas galusowy. Granica wykrywalności wynosiła 0,1 mg/kg. Ustalono 3 zakresy robocze metody: pierwszy od 0,1 mg/kg do 10 mg/kg (Rys. 5), drugi od 10 mg/kg do 100 mg/kg (Rys. 6) i trzeci od Rysunek 6 Krzywa wzorcowa dla kwasu galusowego w metodzie Folina-Ciocalteu w zakresie 10 mg/kg 100 mg/kg Rysunek 7 Krzywa wzorcowa dla kwasu galusowego w metodzie Folina-Ciocalteu w zakresie 100 mg/kg 1000 mg/kg Tabela 4 Aktywność przeciwutleniająca związków fenolowych ogółem [μmol Trolox / 100 g] w pszenicy ozimej odmiany Muszelka w zależności od zastosowanej metody ekstrakcji Czas działania ultradźwiękami [min] MeH 90 : : 20 ABiD 1/ ptymalizacja warunków ekstrakcji związków fenolowych ogółem i aktywności przeciwutleniającej z ziarna : ,8 1324,5 1376,3 1266, ,8 1255,0 1269,3 1232, ,0 1858,8 1782,5 1728,5

8 Czas działania ultradźwiękami [min] Tabela 5 Zawartość związków fenolowych ogółem w pszenicy ozimej Muszelka [mg/kg] w zależności od zastosowanej metody ekstrakcji MeH 90 : : : PDSUMWANIE W pracy oznaczono aktywność antyoksydacyjną (Tab. 4) związków fenolowych obecnych w ziarnie pszenicy ozimej Muszelka i porównano uzyskane wyniki w zależności od zastosowanych warunków ekstrakcji. Zgodnie z założonym celem wyizolowanie polifenoli z prób pszenicy ozimej odbywało się w procesie ekstrakcji za pomocą metanolu i jego mieszaniny z wodą w następujących stężeniach: 90%, 80% oraz 75%. Porównując uzyskane wyniki z dwunastu różnych wariantów doświadczenia, można w pełni uzasadnić stwierdzenie, że najbardziej efektywne parametry ekstrakcji to metanol poddany 30-minutowej ekstrakcji wspomaganej ultradźwiękami, a następnie 90% mieszanina metanolu i wody ekstrahowana w tym samym czasie. Ekstrakcja roztworami wodnym metanolu o stężeniach 80% i 75% wspomagana ultradźwiękami jest mniej wydajna. Analizowane ekstrakty z ziarna pszenicy, pozyskane z zastosowaniem 75% roztworu metanolu wspomaganego ultradźwiękami przez okres 10 bądź 20 minut, wykazały się najmniejszą efektywnością. Efektywność badania zawartości związków fenolowych ogółem (Tab. 5) dla metanolu, uzyskanych podczas ekstrakcji wspomaganej ultradźwiękami przez 20 i 30 minut, okazała się najwyższa. Z kolei ekstrakcja przeprowadzona przez okres 10 minut we wszystkich wariantach doświadczalnych była najmniej skuteczna. LITERATURA [1] Wawrzyniak A., Krotki M., Stoparczyk B., Właściwości antyoksydacyjne owoców i warzyw. Medycyna Rodzinna, 2011, 1, [2] Mišan A. Č., Mimica-Dukić N. M., Mandić A. I., Sakač M. B., Milovanović I. L., Sedej I. J., Development of rapid resolution HPLC method for the separation and determination of 17 phenolic compounds in crude plant extracts. Cent. Eur. J. Chem, 2011, 9, [3] Skalicka-Woźniak K., Głowniak K., Quantitative analysis of phenolic acids in extracts obtained from the fruits of Peucedanum alsaticum L. and Peucedanum cervaria (L.) Lap. Chromatographia, 2008, 68, [4] Wang J., Sun B., Cao Y., Tian Y., Li X., ptimisation of ultrasound-assistedextraction of phenolic - compounds from wheat bran. Food Chem., 2008, 106, [5] Štĕrbová D., Matĕjíček D., Vlček J., Kubáň V., Combined microwave-assisted isolation and solid- -phase purification procedures prior to the chromatographic determination of phenolic compounds in plant materials. Analytica Chimica Acta, 2004, 513, [6] Rangsriwong P., Rangkadilok N., Satayavivad J., Goto M., Shotipruk A., Subcritical water extraction of polyphenolic compounds from Terminalia chebula Retz. fruits. Sep. Purif. Technol., 2009, 66, ABiD 1/2018

9 [7] Ziaková A., Brandsteterová E., Blahová E., Matrix solid-phase dispersion for the liquid chromatographic determination of phenolic acids in Melissa officinalis. J. Chromatogr. A, 2003, 983, [8] Mróz P., Wilczek K., Żak M., Zielińska-Pisklak M., Chromatograficzne metody izolacji i identyfikacji fenolokwasów. Biul. Wydz. Farm. WUM, 2012, 6, [9] Strzelecka H., Kamińska J., Kowalski J., Wawelska E., Chemiczne metody badań roślinnych surowców leczniczych, PZWL Warszawa 1978, [10] Pieszko C., Zaremba A., Zawartość związków fenolowych w ekstraktach z próbek materiału roślinnego, Bromat. Chem. Toksykol. XLVI, 2013, 4, [11] Zgórka G., Dawka S., Application of conventional UV, photodiode array (PDA) and fluorescence (FL) detection to analysis of phenolic acids in plant material and pharmaceutical preparations. J. Pharm. Biomed. Anal., 2001, 24, [12] Stuper-Szablewska K., strowska A., Góral T., Matysiak A., Perkowski J., Porównanie aktywności przeciwutleniającej różnych odmian pszenicy ozimej naturalnie porażonej oraz inokulowanej grzybami z rodzaju Fusarium. Biuletyn IHAR, 2015, 276, [13] Przybylska A., Stuper-Szablewska K., Perkowski J., ptymalizacja warunków ekstrakcji związków fenolowych ogółem z ziarna pszenicy, V Łódzkie Seminarium Doktorantów Chemii, Łódź, ABiD 1/ ptymalizacja warunków ekstrakcji związków fenolowych ogółem i aktywności przeciwutleniającej z ziarna...