AUTOREFERAT ROZPRAWY DOKTORSKIEJ

Transkrypt

1 POLITECHNIKA ŚLĄSKA Wydział Chemiczny Katedra Chemii Nieorganicznej, Analitycznej i Elektrochemii Iwona Wojciechowska-Witkowska Opracowanie metod rozdzielczych do oznaczania wybranych związków o właściwościach dezynfekujących i konserwujących AUTOREFERAT ROZPRAWY DOKTORSKIEJ Promotor pracy: Prof. dr hab. Irena Staneczko-Baranowska Gliwice

2 SPIS TREŚCI AKRONIMY I SKRÓTY WPROWADZENIE PRZEGLĄD LITERATUROWY CEL I ZAKRES PRACY OMÓWIENIE WYNIKÓW BADAŃ OPRACOWANIE UKŁADÓW CHROMATOGRAFICZNYCH DO ROZDZIELANIA MIESZANIN BADANYCH ZWIĄZKÓW PARAMETRY OPRACOWANYCH METOD CHROMATOGRAFICZNYCH WALIDACJA OPRACOWANYCH METOD CHROMATOGRAFICZNYCH PROCEDURY PRZYGOTOWANIA PRÓBEK DO BADAŃ APLIKACJA OPRACOWANYCH PROCEDUR ANALITYCZNYCH DO BADAŃ PRÓBEK RZECZYWISTYCH Badanie próbek wód środowiskowych Badanie kosmetyków, farmaceutyków i środków czystości BADANIA STABILNOŚCI ANALITÓW Stabilność metanolowych roztworów wzorcowych Stabilność wzorców w wodzie rzecznej Stabilność konserwantów w kosmetykach PODSUMOWANIE I WNIOSKI LITERATURA DOROBEK NAUKOWY PUBLIKACJE ZJAZDY PTCHEM SITPCHEM I SEMINARIA NAUKOWE

3 AKRONIMY I SKRÓTY Akronim/ Skrót Pełna nazwa w języku angielskim Pełna nazwa w języku polskim 2PP 2-Phenylphenol 2-Fenylofenol 4C3MPh 4-Chloro-3-methylphenol 4-Chloro-3-metylofenol BA Benzyl Alcohol Alkohol benzylowy ChT Chloramine T Chloramina T CMI Chloromethylisothiazolinone Chlorometyloizotiazolinon GC Gas Chromatography Chromatografia gazowa HLB Hydrophile-Lipophile Balance Równowaga hydrofilowo-lipofilowa HPLC High Performance Liquid Chromatography Wysokosprawna chromatografia cieczowa LOD Limit of Detection Granica wykrywalności LOQ Limit of Quantification Granica oznaczalności MDL Method Detection Limit Granica wykrywalności metody analitycznej MI Methylisothiazolinone Metyloizotiazolinon MP Methylparaben Metyloparaben MQL Method Quantification Limit Granica oznaczalności metody analitycznej PS Potassium Sorbate Sorbinian potasu R Recovery Odzysk RP Reversed Phase Odwrócony układ faz SB Sodium Benzoate Benzoesan sodu SPE Solid Phase Extraction Ekstrakcja do fazy stałej TCC Triclocarban Triclocarban TCS Triclosan Triclosan UAE Ultrasound Assisted Extraction Ekstrakcja za pomocą rozpuszczalnika wspomagana promieniowaniem ultradźwiękowym UPLC/ UHPLC Ultra Performance Liquid Chromatography/Ultra High Performance Liquid Chromatography Ultra sprawna chromatografia cieczowa/ Ultra wysokosprawna chromatografia cieczowa 3

4 1. WPROWADZENIE W ostatnich latach obserwuje się wzrost zainteresowania substancjami dezynfekującymi i konserwującymi. Substancje te to związki wykazujące właściwości bakteriobójcze i bakteriostatyczne. Stosowane są powszechnie jako dodatki zapobiegające rozwojowi bakterii, grzybów i pleśni w produktach handlowych. Konserwanty i substancje dezynfekujące występują w takich produktach jak: farmaceutyki, kosmetyki, środki higieny osobistej, wyroby przemysłu papierniczego i włókienniczego. Ponadto stosowane są w działalności związanej z sektorem medycznym i weterynaryjnym, w przemyśle farb i lakierów, przy produkcji żywic, klejów, w rymarstwie i kaletnictwie. Zainteresowanie badaczy tematyką związków o właściwościach bakteriobójczych wynika z jednej strony z coraz powszechniejszego ich stosowania, a z drugiej z możliwościami wpływu tego typu substancji na środowisko naturalne, w tym na organizmy żywe. Na świecie coraz częściej podejmowane są badania dotyczące oznaczania substancji konserwujących i dezynfekujących w różnych matrycach. Większość z tych badań wynika z uregulowań prawnych, które nakładają na producentów różnorodnych produktów nakazy identyfikacji, oznaczeń ilościowych oraz badań stabilności różnych składników w wytwarzanych produktach. Kontrola jakości farmaceutyków i kosmetyków, a także artykułów spożywczych, jest najlepszym tego przykładem. Kontrola ta powinna dawać wiarygodne wyniki, ze względu na bezpieczeństwo konsumentów. Możliwość szybkiej identyfikacji i oznaczeń ilościowych poszczególnych składników jest istotnym elementem procesu produkcyjnego. Nie bez znaczenia (szczególnie w analizach rutynowych) pozostaje również możliwość szybkiego i równoczesnego oznaczania wielu substancji w czasie jednej analizy. Sposób i czas potrzebny na przygotowanie próbek stanowi także ważny element procedury analitycznej. Podejmowane są także badania związane z oceną akumulacji i wpływu różnorodnych substancji chemicznych na organizmy żywe oraz z oznaczaniem stabilności i pozostałości tego typu zanieczyszczeń w środowisku (m. in. w wodach, ściekach i osadach). Ich obecność w środowisku przyrodniczym stanowi bezpośrednio potencjalne zagrożenie dla ekosystemów wodnych, a pośrednio także dla zdrowia ludzkiego. Obecność tego typu zanieczyszczeń w środowisku zależna jest od wielu czynników, m. in.: wielkości produkcji, ilości zużycia danych substancji, stopnia ich usunięcia w oczyszczalniach ścieków i stabilności. Jednorazowo do środowiska nie są wprowadzane duże ilości substancji bakteriobójczych i bakteriostatycznych, jednak ze względu na ciągłość tego procesu może dojść do ich akumulacji. Dodatkowo w przypadku długoletniej, ciągłej akumulacji, przy braku degradacji, negatywne oddziaływania mogą się kumulować i w przyszłości stanowić poważne zagrożenie. Ilości substancji dezynfekujących i konserwujących oznaczane w wodach powierzchniowych są niewielkie (od setnych części do kilkudziesięciu µg/l) i potencjalnie nie muszą zagrażać środowisku, jednak ich różnorodność, stabilność i długotrwałe działanie mogą powodować negatywne efekty. Trudno określić toksyczność tych zanieczyszczeń, ponieważ dane na temat ich przewlekłego oddziaływania (na ludzi i zwierzęta) nie są do końca poznane. Na tle wymagań współczesnej chemii analitycznej, opracowanie metod do równoczesnego oznaczania pozostałości substancji dezynfekujących i konserwujących w wodach powierzchniowych oraz konserwantów w wyrobach przemysłu kosmetycznego, farmaceutycznego i chemii gospodarczej, jest tematyką wpisującą się w aktualne obszary badań z zakresu chemii analitycznej. Opracowane metody mogłyby mieć zastosowanie zarówno w zakładach przemysłowych (do kontroli jakości produktów w nich wytwarzanych) jak i do monitoringu wód środowiskowych. 4

5 2. PRZEGLĄD LITERATUROWY Wysokosprawna chromatografia cieczowa to technika analityczna zajmująca istotne miejsce w oznaczaniu substancji dezynfekujących i konserwujących. Oznaczenia prezentowane w literaturze dotyczą różnorodnych próbek: środowiskowych (wody, ścieki), produktów przemysłowych (kosmetyki, farmaceutyki) jak i produktów spożywczych, czy próbek biologicznych. W prowadzonych oznaczeniach stosowano szereg detektorów (m.in. detektor spektrofotometryczny, spektrometr mas), a próbki przygotowywano różnymi technikami ekstrakcyjnymi. Zastosowanie takich sposobów izolacji analitów wynikało z bardzo zróżnicowanego składu matrycy próbek. Opisane metody analityczne wykorzystujące techniki chromatografii cieczowej [1 16] do oznaczania związków wybranych do badań w niniejszej pracy, pozwalają na oznaczanie pojedynczych analitów lub w mieszaninach z innymi substancjami m. in.: substancjami aktywnymi i nieaktywnymi farmaceutyków, składnikami kosmetyków oraz środków higieny osobistej (innymi niż konserwanty) lub pestycydami. Zaprezentowano również metody do równoczesnego oznaczania od dwóch do czterech konserwantów lub substancji dezynfekujących będących przedmiotem pracy. Najczęściej równolegle oznaczano pary związków (MP i SB, SB i PS, TCC i TCS) lub MP, TCC i TCS. W większości z tych metod, oznaczenia prowadzone są w odwróconym układzie faz, z zastosowaniem kolumn chromatograficznych z wypełnieniami: oktadecylosilanowym (C18), oktadecylosilanowym ze związanymi resztkowymi grupami silanowymi (C18e), oktylosilanowym (C8), rzadko dodecylosilanowymi (C12). Stosowano także kolumny z wypełnieniami modyfikowanymi grupami cyjanowymi, fenylowymi, diolowymi, amidowymi lub kolumny z wypełnieniem polimerowym (np. polistyrenowym ZirChrom-PS). Fazy ruchome stosowane w elucji izokratycznej i gradientowej w tych oznaczeniach były bardzo zróżnicowane. Wykorzystano rozpuszczalniki organiczne (metanol, acetonitryl, tetrahydrofuran, octan amonu) i roztwory soli nieorganicznych (NaCl, Na 3 PO 4, NaH 2 PO 4, KH 2 PO 4 ) lub roztwory kwasów (HNO 3, H 3 PO 4 i HClO 4 ). Powszechnie stosowano również dodatki kwasów organicznych: octowego, mrówkowego, trifluorooctowego, oraz (znacznie rzadziej) dodatki amin np.: dietyloaminę, trietyloaminę, tributyloaminę czy inne odczynniki przekształcające anality w pochodne. Jako fazy ruchome zastosowanie znalazły także roztwory buforowe o różnym ph (bufor fosforanowy, boranowy, amonowy, octanowy, cytrynianowy). Oznaczenia prowadzono z zastosowaniem różnych detektorów, głównie spektrofotometrycznych oraz spektrometru mas, rzadziej z wykorzystaniem detektorów elektrochemicznych, fluorescencyjnych bądź innych. Przedstawione w literaturze metody oznaczeń obejmują swoim zakresem różnorodne próbki. Są to próbki środowiskowe m. in. ścieki (surowe, oczyszczone, ścieki szpitalne) oraz wody: powierzchniowe (z mórz, rzek i jezior), podziemne (gruntowe), wodociągowe, do nawadniania oraz opadowe (np. uzyskane ze stopionego śniegu). Badaniu poddawano także produkty przemysłowe (kosmetyki, środki higieny osobistej, leki, suplementy diety). Ze względu na różnorodność badanych próbek, sposoby ich przygotowania również są zróżnicowane. Poza typowymi czynnościami związanymi z rozpuszczaniem, rozcieńczaniem, zamrażaniem, rozmrażaniem, liofilizacją, wirowaniem, homogenizacją, filtracją, hydrolizą czy przekształcaniem w pochodne, stosuje się różne metody do zatężenia analitów, usunięcia interferencji i oddzielenia analitów od pozostałych składników matrycy. Zwykle w tych celach stosuje się techniki ekstrakcyjne, a bardzo często po ich zastosowaniu odparowuje się dodatkowo ekstrahent i rozpuszcza suchą pozostałość w niewielkiej ilości rozpuszczalnika, by uzyskać jak 5

6 największe zatężenie badanych substancji. Zastosowanie odpowiedniej techniki ekstrakcyjnej zależy od postaci i składu matrycowego badanej próbki. Stosowane są zarówno metody konwencjonalne (np. ekstrakcja rozpuszczalnikiem, ekstrakcja rozpuszczalnikiem wspomagana promieniowaniem ultradźwiękowym, ekstrakcja do fazy stałej, mikroekstrakcja do fazy stacjonarnej), jak i mniej popularne (np. ekstrakcja za pomocą płynu w stanie nadkrytycznym, ekstrakcja do fazy stałej z wykorzystaniem sorbentu z nadrukiem molekularnym, ekstrakcja z wykorzystaniem wirującego elementu ekstrakcyjnego, ekstrakcja za pomocą cieczy pod zwiększonym ciśnieniem, mikroekstrakcja dyspersyjna w układzie ciecz-ciecz). W celu zatężenia próbek stosowano także technikę chromatografii jonowej. Technika chromatografii gazowej [17 21] była również stosowana w oznaczeniach badanych w niniejszej pracy substancji dezynfekujących (za wyjątkiem ChT) oraz konserwujących (za wyjątkiem PS i SB). Anality oznaczano w różnorodnych matrycach. GC wykorzystuje najczęściej konwersję chemiczną analitów za pomocą odpowiednich odczynników, by umożliwić następnie ich analizę z odpowiednio wysoką czułością. Detektorem stosowanym w tych oznaczeniach był spektrometr mas. Spośród innych metod analitycznych stosowanych do oznaczania substancji dezynfekujących i konserwujących wyróżnić można: metody spektrofotometryczne [22], chemiluminescencyjne [23], elektrochemiczne (polarografia, woltamperometria) [24, 25], metody wykorzystujące techniki elektromigracyjne (np. elektroforeza kapilarna, elektrochromatografia kapilarna, micelarna elektrokinetyczna chromatografia kapilarna) [26 28]. Jest ich jednak relatywnie mniej w porównaniu do metod chromatograficznych. W podsumowaniu przeglądu literaturowego należy zwrócić uwagę, że dotąd nie opisano metod do równoczesnego oznaczania takiej grupy związków. 3. CEL I ZAKRES PRACY Celem niniejszej pracy było opracowanie procedur analitycznych pozwalających na równoczesne oznaczanie wybranych substancji bakteriobójczych i bakteriostatycznych, stosowanych jako substancje dezynfekujące (4-chloro-3-metylofenol 4C3MPh, chloramina T ChT, 2-fenylofenol 2PP, triclosan TCS, triclocarban TCC) oraz konserwujące (alkohol benzylowy BA, chlorometyloizotiazolinon CMI, metyloizotiazolinon MI, metyloparaben MP, benzoesan sodu SB, sorbinian potasu PS). W ramach badań zaplanowano opracowanie układów chromatograficznych do rozdzielenia i oznaczania mieszanin wybranych związków: metoda do równoczesnego oznaczania substancji dezynfekujących (5 związków), metoda do równoczesnego oznaczania substancji konserwujących (6 związków), metoda do równoczesnego oznaczania substancji dezynfekujących i konserwujących (11 związków). Celem badań było również opracowanie procedur przygotowania próbek do badań oraz aplikacja opracowanych metod do oznaczania pozostałości badanych związków w wodach środowiskowych oraz do oznaczania konserwantów w wyrobach przemysłu kosmetycznego i farmaceutycznego. Zaplanowano również wyznaczenie stabilności długoterminowej 11 badanych związków (konserwantów i substancji dezynfekujących) w wodach powierzchniowych oraz stabilności długoterminowej substancji konserwujących (6 związków) w produktach kosmetycznych. 6

7 Do badań stosowano następujące techniki analityczne: wysokosprawną chromatografię cieczową (HPLC), z detekcją DAD, ultra wysokosprawną chromatografię cieczową (UHPLC), z detekcją UV, ekstrakcję do fazy stałej (SPE), ekstrakcję rozpuszczalnikiem, wspomaganą promieniowaniem ultradźwiękowym (UAE). 4. OMÓWIENIE WYNIKÓW BADAŃ 4.1. OPRACOWANIE UKŁADÓW CHROMATOGRAFICZNYCH DO ROZDZIELANIA MIESZANIN BADANYCH ZWIĄZKÓW Chromatograficzne rozdzielenie i równoczesne oznaczenie wybranych grup związków, w niniejszej rozprawie obejmowało następujące etapy prac: dobór odpowiednich warunków rozdzielania mieszanin związków: tj. dobór fazy stacjonarnej, fazy ruchomej, warunków elucji i innych warunków oznaczania (np. temperatury); identyfikację oznaczanych substancji: wybór analitycznych dlugości fal dla poszczególnych związków, rejestrację widm absorpcyjnych dla wzorców oznaczanych substancji w zakresie promieniowania UV-Vis, zastosowanie metody dodatku wzorca do próbki (ekstraktu) i sprawdzenie odpowiedzi układu (zwiększenia pola powierzchni pod pikiem na chromatogramie wzrostu sygnału); analizę ilościową analitów, którą wykonano w oparciu o wyznaczone krzywe kalibracyjne i z uwzględnieniem odzysków analitów dla poszczególnych matryc. Celem badań było opracowanie metod chromatograficznych do równoczesnego oznaczania substancji dezynfekujących (5 związków: ChT, 4C3MPh, 2PP, TCS i TCC Metoda I), substancji konserwujących (6 związków: MI, CMI, BA, PS, SB, MP Metoda II, Metoda IV) oraz metody pozwalającej na rozdzielenie wszystkich 11 analitów (Metoda III). W badaniach zastosowano techniki rozdzielcze: HPLC (Metody I III) oraz UHPLC (Metoda IV). Produkcja nowych i modyfikacja istniejących wypełnień kolumn chromatograficznych to jeden z wiodących trendów w technikach chromatograficznych. Wysoka rozdzielczość kolumn, możliwość pracy w szerokim zakresie ph eluentu oraz możliwość rozdzielania mieszanin związków o zróżnicowanych właściwościach, to główne cechy jakimi powinny charakteryzować się nowe sorbenty. Obecnie w chromatografii cieczowej stosuje się zwykle odwrócony układ faz, dla którego różnorodność dostępnych sorbentów jest duża. W badaniach przetestowano kilka ich rodzajów. Dla każdej z metod HPLC (Metoda I III) przetestowano szereg kolumn chromatograficznych pochodzących od różnych producentów, o różnych wymiarach i wypełnieniu (rodzaj złoża oraz sposób połączenia podstawników z żelem krzemionkowym). Były to kolumny firmy Merck: LiChrosorb RP8 (250ᵡ4 mm, 7 µm), LiChrosorb RP18 (250ᵡ4 mm, 7 µm), LiChrosorb RP18 (125ᵡ4 mm, 7 µm), Chromolith Performance RP-18 (100ᵡ4,6 mm, -), 2x Chromolith Performance RP-18 (100ᵡ4,6 mm, -); firmy Dionex: Acclaim 120 C8 (150ᵡ4,6 mm, 3 µm), Acclaim C18 PA II (150ᵡ2,6 mm, 3 µm); kolumna Wide Pore C18 (250ᵡ4,6 mm, 5 µm) firmy J.T. Baker oraz kolumna Develosil RP Aqueous AR-5 RP-30 (250ᵡ4,6 mm, 5 µm) firmy Nomura Chemical. Dla metod wykorzystujących technikę UHPLC (Metoda IV) przetestowano dwie kolumny: Chromolith FastGradient RP 18e (50ᵡ2 mm, -) firmy Merck oraz Hypersil GOLD TM (50ᵡ2,1 mm, -) firmy Thermo Scientific. 7

8 Niektóre z wypełnień badanych kolumn, ze względu na obecność wolnych grup silanolowych mogą wykazywać częściowo zdolność adsorpcyjną, co może powodować wystąpienie dodatkowych oddziaływań w trakcie procesu rozdzielania chromatograficznego. W takim przypadku z pozoru analogiczne kolumny mogą wykazywać zróżnicowane właściwości. Mechanizm procesu rozdzielania, mający miejsce w przypadku układu RP-HPLC jest również inny niż dla procesu chromatograficznego przebiegającego w normalnym układzie faz. W chromatografii podziałowej zachodzi zjawisko podziału (pomiędzy ciekłą fazę stacjonarną a fazę ruchomą, zgodnie z prawem Nernsta), adsorpcja analitów na powierzchni fazy stacjonarnej oraz adsorpcja składników fazy ruchomej na powierzchni sorbentu. Obserwować można wzajemne oddziaływania pomiędzy czynnikami: faza stacjonarna analit, faza ruchoma analit oraz faza stacjonarna faza ruchoma. Oznaczane substancje są związkami organicznymi, o zróżnicowanej budowie i tym samym zróżnicowanych właściwościach fizyko-chemicznych. Te odmienne właściwości (np. kwasowość, lipofilowość) mają wpływ na proces rozdzielenia chromatograficznego ich mieszanin. Wartości pk a oznaczanych związków mieszczą się w granicach 4,2 15,4, a logp: 0,1 6,2. W trakcie badań nad opracowaniem odpowiednich układów chromatograficznych przebadano także różne składy fazy ruchomej, szybkość i rodzaj elucji (izokratyczny, gradientowy). Jako składniki fazy ruchomej wykorzystano: wodę, metanol, acetonitryl, 0,05% wodny roztwór kwasu trifluorooctowego, 0,1% wodny roztwór kwasu mrówkowego oraz ich mieszaniny. Analizy techniką HPLC prowadzono w temperaturze pokojowej (20 C 35 C), a techniką UHPLC w temperaturach: 12 C, 20 C i 25 C. Dla badanych kolumn chromatograficznych i optymalnego (pod względem efektywności rozdzielenia i czasu analizy) programu elucji (sposób elucji, natężenie przepływu, rodzaj rozpuszczalników) wyznaczono następujące parametry chromatograficzne: czas retencji (t r ), liczbę półek teoretycznych (N), współczynnik retencji/współczynnik pojemnościowy (k ), asymetrię piku (A s ), zdolność rozdzielczą/rozdzielczość pików (R s ), liczbę półek teoretycznych przypadającą na metr (N/m) oraz współczynnik selektywności/współczynnik rozdzielenia (α). Przy wyborze rodzaju kolumny kierowano się następującymi kryteriami t r : minimalny (przy zachowaniu dobrej powtarzalności analiz, dobrego rozdzielenia analitów i zachowaniu pożądanych wartości ocenianych parametrów chromatograficznych); N > 4000; k : 1 10; A s : 0,95 1,5; R s : > 1,7; N/m: > 20000; α > 1. Dla Metody I parametry chromatograficzne wyznaczone dla różnych kolumn wynosiły: t r : 1,95 9,37 min; N: ; k : 0,17 7,28; A s : 0,69 1,52; R s : 0,60 33,01; N/m: ; α: 0,98 7,02. Dla Metody II parametry chromatograficzne wyznaczone dla różnych kolumn wynosiły: t r : 1,01 20,77 min; N: ; k : 0,21 17,32; A s : 0,57 2,88; R s : 0,74 15,41; N/m: ; α: 0 6,19. Dla Metody III parametry chromatograficzne wyznaczone dla różnych kolumn wynosiły: t r : 1,37 38,75 min; N: ; k : 0,56 58,74; A s : 0,56 2,86; R s : 0 42,74; N/m: ; α: 0,01 6,80. Dla Metody IV parametry chromatograficzne wyznaczone dla różnych kolumn chromatograficznych i trzech testowanych temperatur (w jakich prowadzone były analizy) wynosiły: t r : 0,24 3,17 min; N: ; k : 0,53 20,37; A s : 1,18 1,89; R s : 1,36 11,81; N/m: ; α: 1,06 6,19. Poza porównaniem wybranych parametrów chromatograficznych, najważniejszym zadaniem jest rozdzielenie mieszaniny wybranych związków. W prowadzonych badaniach trudne było rozdzielenie par związków: TCS i TCC oraz PS i SB. Mimo różnic w budowach tych związków, wykazywały one w badanych układach chromatograficznych zbliżone czasy retencji. W niektórych układach chromatograficznych były praktycznie nierozdzielone. 8

9 4.2. PARAMETRY OPRACOWANYCH METOD CHROMATOGRAFICZNYCH W Tabeli 1 przedstawiano warunki analiz chromatograficznych dla opracowanych czterech metod pozwalających na rozdzielenie mieszanin wybranych związków. Przedstawione warunki analiz pozwalają na uzyskanie satysfakcjonujących (a często także optymalnych) wartości dla rozpatrywanych (wymienionych wcześniej) parametrów chromatograficznych. 9

10 Tabela 1. Warunki oznaczeń dla opracowanych metod chromatograficznych. Metoda I II III IV Technika HPLC HPLC HPLC UHPLC Oznaczane związki ChT, 4C3MPh, 2PP, TCS, TCC MI, CMI, BA, PS, SB, MP MI, CMI, BA, ChT, PS, SB, MP, 4C3MPh, 2PP, TCS TCC MI, CMI, BA, SB lub PS, MP Kolumna chromatograficzna Develosil RP Aqueous AR-5 RP-30 (250ᵡ4,6 mm, 5 µm) (Nomura Chemical) Develosil RP Aqueous AR-5 RP-30 (250ᵡ4,6 mm, 5 µm) (Nomura Chemical) Develosil RP Aqueous AR-5 RP-30 (250ᵡ4,6 mm, 5 µm) (Nomura Chemical) Chromolith Fast Gradient RP 18e (50ᵡ2 mm) (Merck) T p temperatura pokojowa [ C]; ACN acetonitryl, MeOH metanol. Faza ruchoma Detekcja T [ C] sposób elucji t [min] MeOH [%] H 2O [%] natężenie przepływu [ml/min] gradientowy , sposób elucji t [min] ACN [%] 0,1% HCOOH [%] natężenie przepływu [ml/min] gradientowy , sposób elucji t [min] ACN [%] 0,1% HCOOH [%] natężenie przepływu [ml/min] , ,6 gradientowy , , , ,2 sposób elucji t [min] ACN [%] 0,1% HCOOH [%] natężenie przepływu [ml/min] 0, , gradientowy 1, ,7 2, , Objętość dozowanej próbki [µl] DAD T p 20 DAD T p 20 DAD T p 20 UV

11 4.3. WALIDACJA OPRACOWANYCH METOD CHROMATOGRAFICZNYCH Opracowane metody chromatograficzne poddano walidacji, która pozwala na ustalenie parametrów charakteryzujących daną metodę analityczną, wskazuje jej ograniczenia oraz pozwala na sprawdzenie jej przydatności do określonych celów. Jest to jeden z najważniejszych etapów opracowania metod analitycznych, ponieważ parametry walidacyjne pokazują czy dana metoda i/lub procedura analityczna przebiegają w sposób poprawny i czy wyniki są miarodajne. Dla każdej z opracowanych w niniejszej pracy metod chromatograficznych wyznaczono: liniowość (zakres liniowości), równanie i parametry krzywych kalibracyjnych, czułość, LOD (MDL), LOQ (MQL), powtarzalność, precyzję pośrednią, poprawność (dokładność), odzysk, stabilność analitów, selektywność/specyficzność. Wyznaczone parametry dotyczą analitów w roztworach metanolowych oraz mieszanin wzorców w matrycy wody rzecznej. Parametry walidacyjne dla poszczególnych metod chromatograficznych przedstawiono poniżej w Tabeli 2 i 3. Na Rysunkach 1 2 przedstawiono przykładowe chromatogramy metanolowych roztworów wzorcowych zawierających mieszaniny odpowiednich związków. Rysunek 1. Chromatogram mieszaniny wzorców substancji dezynfekujących i konserwujących, zarejestrowany przy długości fali światła: λ=274 nm (0 22 min), λ=237 nm (22 33 min), λ=257 nm (33 35 min) oraz λ=280 nm (35 40 min), techniką RP-HPLC-DAD (Metoda III). a) b) Rysunek 2. Chromatogramy mieszanin wzorców substancji konserwujących o stężeniach: 18,33 µg/ml (MI), 25,00 µg/ml (CMI), 600,00 µg/ml (BA), 10,00 µg/ml (SB), 5,00 µg/ml (PS i MP), zarejestrowane techniką RP-UHPLC-UV (Metoda IV) przy różnych długościach fal światła: kolor czarny λ=274 nm (0 1,0 min) i λ= 237 nm (1,1 3,0 min) dla części (a) oraz λ= 257 nm (1,1 3,0 min) dla części (b); kolor zielony λ=274 nm (0 1,0 min) i λ= 257 nm (1,1 3,0 min) dla części (a) oraz λ= 261 nm (1,1 3,0 min) dla części (b). 11

12 Tabela 2. Zestawienie wyznaczonych parametrów walidacyjnych opracowanych metod chromatograficznych (HPLC) dla substancji dezynfekujących. Analit ChT 4C3MPh 2PP TCS TCC Czasy retencji Parametry krzywych kalibracyjnych t r [min] 4,4 27,0 6,8 35,9 7,1 36,4 8,2 37,8 9,4 38,8 SD [min] 0,1 0,9 0,1 0,3 0,1 0,2 0,2 0,3 0,2 0,5 zakres liniowości [µg/ml] 0,10 10,00 0,10 10,00 0,25 10,00 0,25 10,00 0,10 10,00 R 2 0,9990 0,9999 0,9991 0,9993 0,9970 0,9990 0,9980 0,9996 0,9996 0,9999 LOD [µg/ml] 0,018 0,077 0,061 0,43 0,036 0,48 0,052 0,57 0,023 0,30 Granice wykrywalności i oznaczalności LOQ [µg/ml] 0,053 0,23 0,18 1,3 0,11 1,5 0,16 1,7 0,070 0,89 MDL [µg/l] 0,077 0,60 0,074 1,4 0,15 1,6 0,24 1,9 0,071 1,0 MQL [µg/l] 0,23 1,8 0,22 4,7 0,46 4,8 0,72 5,7 0,21 3,0 Selektywność α 1,05 1,72 1,03 1,07 1,04 1,24 1,03 1,14 α* 1,06 3,35 1,02 1,05 1,02 1,31 0,90 1,20 Precyzja Stabilność krótkoi długoterminowa powtarzalność (CV [%]) poprawność (RE [%]) odzysk (R [%]) precyzja pośrednia (CV [%]) min. stabilność wzorców w MeOH (7 dni/12 miesięcy) min. stabilność wzorców w H 2O (7 dni/24 miesiące) α współczynnik selektywności wyznaczony dla wzorców w roztworze metanolowym; α* współczynnik selektywności wyznaczony dla matrycy wody rzecznej. 1,0 5,2 1,2 6,2 1,3 4,8 0,54 5,1 0,68 4,9-7,2 8,6-8,8 10-7,7 9,8-7,5 7,9-7, ,2 5,1 1,2 5,1 1,5 4,9 1,3 6,6 1,5 5,9 93 / / / / / / / / / / 65 12

13 Tabela 3. Zestawienie wyznaczonych parametrów walidacyjnych opracowanych metod chromatograficznych (HPLC) dla substancji konserwujących. Analit MI CMI BA PS SB MP Czasy retencji Parametry krzywych kalibracyjnych t r [min] 3,9 10,9 8,8 20,2 13,0 23,7 17,1 30,6 17,5 31,5 19,6 34,6 SD [min] 0,1 0,5 0,1 0,3 0,1 0,6 0,1 1,0 0,1 0,6 0,1 0,3 zakres liniowości [µg/ml] 1,83 18,33 1,00 25,00 10,00 500,00 0,50 15,00 0,75 10,00 0,50 10,00 R 2 0,9982 0,9997 0,9978 0,9997 0,9983 0,9998 0,9986 0,9999 0,9981 0,9996 0,9969 0,9996 LOD [µg/ml] 0,56 0,66 0,33 1,1 3,1 7,9 0,15 0,49 0,21 0,78 0,16 0,72 Granice wykrywalności i oznaczalności LOQ [µg/ml] 1,7 2,0 0,98 3,2 9,2 24 0,45 1,5 0,62 2,3 0,47 2,2 MDL [µg/l] 0,63 1,1 0,77 1,8 7,9 8,9 0,41 0,81 0,78 0,81 0,72 0,97 MQL [µg/l] 1,9 3,3 2,3 5, ,2 2,4 2,3 2,4 2,2 2,9 Selektywność α 2,57 4,53 1,24 1,52 1,17 1,38 0,89 1,01 1,15 1,34 α* 2,66 4,63 1,14 1,67 1,20 1,40 0,92 1,03 1,13 1,27 Precyzja Stabilność krótkoi długoterminowa powtarzalność (CV [%]) poprawność (RE [%]) odzysk (R [%]) precyzja pośrednia (CV [%]) min. stabilność wzorców w MeOH (7 dni/12 miesięcy) min. stabilność wzorców w H 2O (7 dni/24 miesiące) 0, ,9 7,3 0,96 7,2 1,2 7,8 1,6 7,8 0,60 7,4-6,0 4,4-8,0 5,5-4,4 7,8-5,9 7,7-7,0 9,1-5,0 5, ,2 7,2 1,8 9,6 2,6 8,0 1,1 7,5 1,3 8,4 1,1 8,3 100 / / / / / / / / / / / / 29 13

14 Metody I III wykorzystują technikę HPLC i pozwalają na rozdzielenie mieszanin substancji dezynfekujących lub/i konserwujących. Dedykowane są głównie do analiz pozostałości substancji dezynfekujących i konserwantów w wodach środowiskowych. Metoda II zastosowana została także do wykrywania i oznaczania konserwantów w kosmetykach i farmaceutykach. Najbardziej uniwersalną metodą jest Metoda III pozwalająca na równoczesne oznaczanie wszystkich 11 wybranych analitów. Metoda I lub II mogą być jednak równie przydatne w przypadku konieczności oznaczania tylko substancji dezynfekujących lub tylko substancji konserwujących. Ich zastosowanie pozwoli na znaczne skrócenie czasu potrzebnego na wykonanie badań oraz obniży koszty (szczególnie rozpuszczalników stosowanych jako fazy ruchome). Metoda IV wykorzystuje technikę UHPLC i pozwala na rozdzielenie mieszanin konserwantów: MI, CMI, BA, SB, MP lub MI, CMI, BA, PS, MP. Metoda ta została zastosowana do badań próbek kosmetyków, farmaceutyków i środków czystości na zawartość poszczególnych konserwantów. Wykorzystanie techniki ultrasprawnej chromatografii cieczowej pozwala na przyspieszenie prowadzonych analiz oraz na zmniejszenie kosztów, związanych ze stosowanymi rozpuszczalnikami o wysokiej czystości. Dla Metody IV (UHPLC) czasy retencji mieszczą się w granicach 0,29 2,54 min, ich odchylenia standardowe wynoszą 0,001 0,02 min. Zakresy liniowości krzywych kalibracyjnych wynoszą: 0,25 100,00 µg/ml, a ich współczynniki korelacji 0,9989 0,9999. Wartości LOD i LOQ wynoszą: 0,058 4,4 µg/ml oraz 0,17 13 µg/ml. Współczynniki selektywności (α, α*) wynoszą od 1,09 do 5,47. Powtarzalność i precyzja pośrednia (wyrażone przez CV) mieszczą się w granicach: 0,73% 5,4% oraz 0,31% 6,0%. Błędy względne wynoszą - 9,4% 9,6%, a odzyski: 91% 109%. Parametry wyznaczonych krzywych wzorcowych oraz parametry walidacyjne opracowanych metod chromatograficznych (Metody HPLC: I III) przedstawiono w Tabelach 2 3 oraz w sposób opisowy poniżej. Parametry dla Metody IV (UHPLC) przedstawiono w sposób opisowy powyżej. Wysokie wartości współczynnika korelacji (0,9970 0,9999) potwierdzają liniowość wyznaczonych krzywych kalibracyjnych w badanych zakresach stężeń oraz ścisłą zależność pomiędzy zmiennymi. Wysokie wartości współczynników kierunkowych wyznaczonych krzywych kalibracyjnych (0, , ) świadczą o dobrej czułości opracowanych metod. LOD i LOQ obliczone dla metod chromatograficznych (Metody HPLC I III) wynoszą odpowiednio: 0,018 7,9 i 0, µg/ml. Uwzglęniając procedurę SPE, wartości obliczonych MDL i MQL wynoszą odpowiednio: 0,071 7,9 i 0,21 24 µg/l. Miarą precyzji i powtarzalności jest odchylenie standardowe (SD), względne odchylenie standardowe (RSD) lub współczynnik zmienności (CV). Wielkością najwygodniejszą w ocenie jest CV, dla którego kryterium akceptacji wynosi od 3% (składniki główne) nawet do 20% (anality na poziomie śladowym); kryteria te są zróżnicowane w zależności od źródeł literaturowych (3 15%, 5 20%). Na ich wartość wpływ ma specyfika prowadzonych oznaczeń (zastosowane techniki/metody, różnorodność składu matrycowego próbek). W niniejszej pracy przyjęto (zgodnie z wytycznymi dotyczącymi walidacji metod analitycznych), że średnia wartość precyzji powinna wynosić maksymalnie ±15% w stosunku do wartości rzeczywistej dla wysokiego i średniego poziomu stężeń analitów w próbce, oraz maksymalnie ±20% dla najniższego z badanych poziomów stężeń. 14

15 W ramach walidacji metody wyznaczono powtarzalność i precyzję pośrednią. Wartości obliczonych CV są mniejsze niż 6,0% dla roztworów wzorcowych oraz mniejsze niż 11% dla matrycy wody, co potwierdza powtarzalność i dobrą precyzję opracowanych metod. Poprawność (dokładność) metody wyznaczono na podstawie obliczonych błędów względnych, których wartości maksymalne wynoszą odpowiednio -9,4% oraz 13% dla wzorców rozpuszczonych w metanolu oraz wzorców dodanych do matrycy wody. Odzysk jest ilościowym wyrazem obciążenia metody, pozwala na wykrycie i eliminację pewnych błędów systematycznych występujących w trakcie wykonywanych pomiarów. Dla opracowanych metod odzyski wynoszą % dla roztworów metanolowych oraz % dla matrycy wody środowiskowej. Ich wartości są akceptowalne. Stabilność roztworów wzorcowych w metanolu wynosi > 80% (krótkoterminowa: po 7 dniach; za wyjątkiem stabilności SB równej 65%) i > 44% (długoterminowa: po 12 miesiącach). Stabilność krótko- i długoterminowa (7 dni i 24 miesiące) wzorców w próbkach wody powierzchniowej wynosi odpowiednio > 90% oraz > 19%. Nie uwzględniono tu stabilności ChT, gdyż według danych literaturowych związek ten w wodzie ulega szybkiej biodegradacji (do 10% w ciągu 28 dni), co potwierdziły przeprowadzone badania. Stabilność konserwantów w produktach handlowych wyznaczono dla czterech podstawowych matryc kosmetyków. W zależności od matrycy i sposobu przechowywania próbki, stabilność analitów była różna, zaobserwowano spadek zawartości nawet do 0% w stosunku do ilości wprowadzonego wzorca (CMI, BA). Opracowane metody są selektywne, wyznaczone współczynniki selektywności wynoszą ponad 0,89 dla wzorców rozpuszczonych w MeOH i ponad 0,91 dla wzorców w matrycy próbki. Prezentowane chromatogramy pokazują, że rozdzielenie analizowanych mieszanin związków jest dobre, a piki są symetryczne. W przypadku pojawiania się pewnych zakłóceń (podwyższenie linii bazowej, dodatkowe piki na chromatogramie) nie mają one wpływu na analizę jakościową i ilościową. W ramach badań przeprowadzono także analizy, mające na celu weryfikację selektywności opracowanych metod i procedur w stosunku do danej grupy związków. I tak według Procedury I (SPE) i Metody I (RP-HPLC-DAD) dedykowanej do analiz substancji dezynfekujących przeprowadzono ekstrakcję substancji konserwujących, a następnie analizę chromatograficzną otrzymanego ekstraktu. Podobnie dla Procedury II i Metody II dedykowanej do analizy konserwantów przeprowadzono ekstrakcję i analizę substancji dezynfekujących. Otrzymane wyniki potwierdziły selektywność opracowanych metod, bowiem nie następowała koelucja tych związków PROCEDURY PRZYGOTOWANIA PRÓBEK DO BADAŃ Procedury analityczne, zastosowane do przygotowania próbek do badań wykorzystują technikę ekstrakcji do fazy stałej (SPE) do przygotowania próbek wód powierzchniowych, pozwalającą na zatężenie analitów (zarówno substancji konserwujących jak i dezynfekujących) oraz technikę ekstrakcji rozpuszczalnikiem wspomaganej promieniowaniem ultradźwiękowym (UAE) do wydzielania konserwantów z próbek kosmetyków, farmaceutyków i środków czystości. 15

16 Opis postępowania przy przygotowaniu próbek wód środowiskowych oraz odzyski dla oznaczanych związków (wyznaczone w matrycy wody rzecznej przy zawartości analitów na niskim poziomie stężeń) przedstawiono w Tabeli 4. Opracowane warunki SPE są warunkami optymalnymi, pozwalającymi na uzyskanie zadowalających odzysków analitów. W ramach przeprowadzonych badań nad izolacją analitów techniką SPE, wyznaczono odzyski poszczególnych analitów w różnych matrycach wód (woda destylowana, wodociągowa i rzeczna) i dla różnych poziomów dodatków analitów (95%, 50% i 5% zakresów roboczych krzywych kalibracyjnych). W przypadku Procedury I (SPE Bakerbond Speedisk Octadecyl) uzyskano odzyski rzędu: 12,8 15,4% (dla ChT), 77,6 89,8% (dla 4C3MPh), 91,2 99,3% (dla 2PP), 77,7 89,6% (dla TCS) oraz 99,3 106,4% (dla TCC). Dla Procedury II (Oasis HLB) uzyskano odzyski rzędu 65,4-89,7% (dla MI), 102,7 103,2% (dla CMI), 77,2 82,4% (dla BA), 101,5 105,6% (dla PS), 72,3 86,6% (dla SB) i 73,6 82,3% (dla MP). Natomiast dla Procedury III (Bond Elut PPL) odzyski analitów przyjmują następujące wartości: 71,9 85,4% (dla MI), 93,6 101,5% (dla CMI), 98,0 98,7% (dla BA), 13,5 14,6% (dla ChT), 96,4 101,9% (dla PS), 88,5 98,4% (dla SB), 93,8 102,5% (dla MP), 89,5 92,9% (dla 4C3MPh), 90,8 97,6% (dla 2PP), 65,8 73,5% (dla TCS) oraz 62,1 65,4% (dla TCC). Jak wynika z przedstawionych wartości minimalny odzysk wynosi 65,4% a maksymalny 106,4%, co potwierdza ilościowe wydzielenie analitów z próbek wód. Wyjątek stanowi ChT dla której odzysk rzędu kilkunastu % spowodowane są brakiem jej stabilności w wodzie (na co wskazuje nawet karta charakterystyki tej substancji). Różnice w odzyskach dla danego analitu (ale w różnych matrycach wód i dla różnych poziomów dodatków wzorca) wynikać mogą z wpływów matrycowych i stopnia zanieczyszczenia wód. Opis postępowania przy przygotowaniu próbek kosmetyków przedstawiono poniżej. Preparaty ciekłe oraz klarowne analizowano bezpośrednio lub, jeśli było to konieczne, po odpowiednim rozcieńczeniu wodą destylowaną. Anality z preparatów stałych oraz półpłynnych ekstrahowano za pomocą metanolu. Ekstrakcję wspomagano promieniowaniem ultradźwiękowym (UAE). W celu ekstrakcji odważano ok. 1 g próbki (pasty do zębów, kremu, żelu itp.), dodawano 6 ml metanolu, poddawano działaniu promieniowania ultradźwiękowego w łaźni ultradźwiękowej przez 15 minut, przeniesiono ilościowo do kolby miarowej o pojemności 10,0 ml i uzupełniono metanolem do kreski. Następnie roztwory przesączono przez filtr nylonowy o średnicy porów 0,20 µm, a otrzymane przesącze poddawano analizie chromatograficznej (jeżeli było to konieczne przefiltrowane ekstrakty rozcieńczano). W przypadku ekstrakcji konserwantów z kosmetyków za pomocą rozpuszczalnika (metanolu), wspomaganej promieniowaniem ultradźwiękowym, wyznaczono również odzyski dla trzech matryc produktów kosmetycznych (pasta, krem, żel), a w każdej z nich dla trzech poziomów dodatków analitów (95%, 50% i 5% z zakresów liniowości wyznaczonych krzywych kalibracyjnych). Uzyskano odzyski rzędu 77,3 100,8% (dla MI), 62,7 95,5% (dla CMI), 46,1 118,7% (dla BA), 74,3 105,9% (dla PS), 56,3 93,3% (dla SB) oraz 76,0 111,1% (dla MP). Uzyskane wyniki są powtarzalne. Rozbieżności w odzyskach dla jednego związku wynikają niewątpliwie z silnych wpływów matrycowych, bowiem skład jakościowy poszczególnych kategorii produktów kosmetycznych jest zróżnicowany. 16

17 Tabela 4. Procedury przygotowania próbek wód do analiz chromatograficznych na zawartość pozostałości substancji dezynfekujących lub/i konserwujących. Procedura SPE I II III substancje dezynfekujące (Metoda I) substancje konserwujące (Metoda II) substancje dezynfekujące i konserwujące (Metoda III) Kolumienka ekstrakcyjna Bakerbond Speedisk Octadecyl C18 (50 mm) Oasis HLB (500 mg, 6 ml) BOND ELUT PPL (500 mg, 6 ml) Próbka/ przygotowanie woda powierzchniowa: sączenie woda powierzchniowa: sączenie, zakwaszenie do ph 2 (2 M H 2SO 4) woda powierzchniowa: sączenie, zakwaszenie do ph 2 (2 M H 2SO 4) SPE kondycjonowanie: MeOH, 10 ml; H 2O dest zakwaszona do ph 5 (2 M H 2SO 4), 10 ml; 2 ml/min próbka: 3 L; ml/min suszenie złoża: próżnia, 2 min elucja: MeOH, 10 ml; 1 ml/min kondycjonowanie: MeOH, 5 ml; H 2O dest zakwaszona do ph 2 (2 M H 2SO 4), 5 ml; 1 ml/min próbka: 3 L; 5-10 ml/min suszenie złoża: próżnia, 2 min elucja: mieszanina ACN:0,1% HCOOH (25:75; v/v), 2,5 ml; ACN, 2,5 ml; 1 ml/min kondycjonowanie: MeOH, 5 ml; H 2O dest zakwaszona do ph 2 (2 M H 2SO 4), 5 ml; 1 ml/min próbka: 5 L; 10 ml/min suszenie złoża: próżnia, 2 min elucja: ACN, 5 ml; 1 ml/min Zatężenie próbki 300-krotne 600-krotne Oznaczane związki (metoda chromatograficzna) krotne Analit R* [%] SD [%] CV [%] ChT 13,0 0,2 1,4 4C3MPh 77,6 6,1 7,9 2PP 91,2 2,2 2,4 TCS 77,7 1,9 2,4 TCC 101,9 3,4 3,3 MI 65,4 2,0 3,0 CMI 103,2 4,6 4,5 BA 77,2 5,6 7,2 PS 105,6 7,6 7,2 SB 72,3 3,0 4,1 MP 73,6 4,5 6,2 MI 71,9 2,3 3,2 CMI 94,5 3,4 3,6 BA 98,0 4,7 4,8 ChT 13,6 0,7 5,4 PS 96,4 4,1 4,2 SB 80,4 2,4 3,0 MP 93,8 2,7 2,8 4C3MPh 89,6 3,5 4,0 2PP 90,8 3,7 4,1 TCS 65,8 3,7 5,6 TCC 62,1 3,2 5,2 R* prezentowane w Tabeli 18 odzyski, ich odchylenia standardowe (SD) i współczynniki zmienności (CV) dotyczą odzysków wyznaczonych dla próbek wody rzecznej z dodatkiem wzorców na niskim poziomie stężeń (ok. 5% zakresów roboczych krzywych kalibracyjnych). 17

18 4.5. APLIKACJA OPRACOWANYCH PROCEDUR ANALITYCZNYCH DO BADAŃ PRÓBEK RZECZYWISTYCH Po opracowaniu procedur wydzielania i oznaczania badanych związków przeprowadzono ich aplikację do próbek rzeczywistych. Identyfikacji oznaczanych analitów w próbkach rzeczywistych dokonano na podstawie porównania ich czasów retencji z czasami retencji wzorców, porównania ich widm absorpcyjnych, a także metodą dodatku wzorca do ekstraktu uzyskanego po SPE lub UAE i sprawdzeniu odpowiedzi układu (wzrostu sygnału). Prezentowane wartości są wynikami końcowymi analiz uwzględniają odzyski dla zastosowanych procedur SPE i UAE Badanie próbek wód środowiskowych Wyniki badań próbek wód powierzchniowych przedstawiono w Tabeli 5, dla każdego z opracowanych układów chromatograficznych i odpowiadającej mu procedury SPE. wód. Na Rysunkach 3 5 przedstawiono przykładowe chromatogramy zarejestrowane dla badanych próbek Rysunek 3. Chromatogram ekstraktu z wody rzecznej (rzeka Wisła, Skoczów) uzyskany po procedurze SPE, zarejestrowany przy długości fali światła λ=227 nm (0 5 min) oraz λ=280 nm (5 10 min), techniką RP-HPLC-DAD (Metoda I). Rysunek 4. Chromatogram ekstraktu ze ścieków oczyszczonych (Polska południowa) po procedurze SPE, zarejestrowany przy długości fali światła λ=245 nm, techniką RP-HPLC-DAD (Metoda I). 18

19 a) b) Rysunek 5. (a) Chromatogram ekstraktu z wody rzecznej (rzeka Biała, Czechowice-Dziedzice) po procedurze SPE, zarejestrowane przy długości fali światła λ=280 nm (0 24 min), λ=227 nm (24 30 min), λ=237 nm (30 33 min), λ=280 nm (33 40 min), techniką RP-HPLC-DAD (Metoda III); (b) powiększenie części zaznaczonej na chromatogramie (a). 19

20 Metoda HPLC Procedura SPE Tabela 5. Wyniki badań próbek wód powierzchniowych. Stężenie analitów [µg/l] (CV, [%]) Próbka (pochodzenie) substancje dezynfekujące substancje konserwujące I II III I II III ChT 4C3MPh 2PP TCS TCC MI CMI BA PS SB MP rzeka Bierawka (Czerwionka) 7,9 (3,1) rzeka Krzywa (Bielsko-Biała) 30,4 (5,0) rzeka Warta (Zawiercie) 5,1 (6,4) nie oznaczano rzeka Wisła (Skoczów) 17,9 (5,1) ścieki (Polska płd.) 5,1 (2,8) rzeka Bytomka (Zabrze) 11,6 (5,3) 35,1 (5,5) 3,0 (6,5) rzeka Drama (Dzierżno) 3,1 (6,4) rzeka Drama (Kamieniec) 2,7 (3,4) rzeka Jesionka (Jaworze) nie oznaczano 2,6 (4,8) rzeka Kłodnica (Gliwice) 7,9 (4,0) 3,1 (5,7) rzeka Krzywa (Bielsko-Biała) 2,7 (4,9) Jezioro Dzierżno Duże (Dzierżno) 5,7 (5,0) rzeka Biała 2,1 (3,1) 12,6 (2,1) 4,9 (0,7) 8,2 (7,0) 3,6 (1,7) 6,8 (1,8) (Czechowice-Dziedzice) rzeka Bierawka (Nieborowice) 2,3 (3,3) 5,4 (5,6) 2,1 (4,3) 1,5 (3,6) 2,6 (3,9) rzeka Bytomka (Zabrze) 5,0 (6,6) 0,9 (9,9) 0,3 (6,0) 10,3 (7,3) 36,1 (4,5) rzeka Drama (Dzierżno) 0,5 (8,3) rzeka Drama (Kamieniec) 4,8 (3,5) 2,2 (2,7) rzeka Gostynia (Bieruń) 3,6 (0,7) 5,4 (2,1) 2,7 (6,2) 3,7 (3,1) 2,5 (2,6) rzeka Kłodnica (Gliwice) 5,2 (4,5) 9,0 (4,1) 2,3 (5,8) rzeka Mała Panew (Krupski Młyn) 5,6 (3,3) 6,5 (7,3) 1,5 (3,3) rzeka Nacyna (Rybnik) 74,4 (2,5) rzeka Potok Chudowski 2,8 (3,3) 3,0 (7,6) 7,8 (3,2) (Borowa Wieś/Bujaków) rzeka Potok Dokawa (Jankowice) 4,8 (3,5) 2,2 (2,7) rzeka Pszczynka (Pszczyna) 41,3 (1,6) rzeka Ruda (Rybnik) 3,9 (3,4) 5,2 (8,8) 3,1 (5,5) rzeka Warta (Zawiercie) 1,6 (3,5) 3,1 (3,7) Jezioro Dzierżno Duże (Dzierżno) 0,8 (3,6) Jezioro Dzierżno Małe (Dzierżno) 1,1 (5,7) 0,5 (6,5) Jezioro Goczałkowickie Goczałkowice Zdrój) 2,5 (0,4) Jezioro Pławniowice 0,9 (8,9) 0,8 (6,7) (Pławniowice) Jezioro Rybnickie (Rybnik) 64,2 (2,9) Jezioro Żywieckie (Zarzecze) 1,3 (4,2) 0,6 (5,6) 20

21 Oznaczanie pozostałości substancji dezynfekujących przeprowadzono dla 8 próbek wód powierzchniowych i 1 próbki ścieków oczyszczonych; substancji konserwujących dla 12 próbek wód; oraz wszystkich analitów (obu grup związków) w 20 próbkach wód. W sumie przebadano 40 próbek wód (głównie z rzek i jezior) na obecność pozostałości substancji dezynfekujących lub/i konserwujących. W 30 próbkach zidentyfikowano oznaczane związki. W 10 próbkach nie oznaczono żadnego z analitów. W próbkach wód oznaczono następujące anality: CMI (5,7 11,6 µg/l), BA (35,1 74,4 µg/l), ChT (2,1 5,2 µg/l), SB (2,3 6,8 µg/l), 4C3MPh (5,4 12,6 µg/l), 2PP (3,0 5,2 µg/l), TCS (0,5 64,2 µg/l) i TCC (0,3 5,1 µg/l). MI, PS i MP to trzy związki (spośród 11 oznaczanych), których nie oznaczono w żadnej z badanych próbek. Badania te pokazują, że problem zanieczyszczenia wód środowiskowych pozostałościami substancji dezynfekujących i konserwujących występuje również w Polsce. Problem zanieczyszczenia środowiska różnymi ksenobiotykami, ich oznaczanie i monitoring to tematyka realizowana przez liczne grupy badaczy. Opracowane w rozprawie metody równoczesnego oznaczania substancji dezynfekujących i konserwujących stanowić mogą dodatkowe narzędzie do realizacji tych zadań Badanie kosmetyków, farmaceutyków i środków czystości Badaniom na obecność i zawartość substancji konserwujących poddano także produkty handlowe: kosmetyki, środki higieny osobistej, farmaceutyki i środki czystości. Badane próbki różniły się między sobą składem i postacią fizyczną. Uzyskane wyniki przedstawiono w Tabeli 6. Tabela 6. Wyniki badań kosmetyków, farmaceutyków i środków czystości na zawartość konserwantów. Kategoria Stężenie/zawartość [µg/ml lub** µg/g] Matryca * produktów MI CMI BA PS SB MP ciekła min 0,8 1,4 54,8 786,0 529,4 0,5 max 2,4 4,0 2633,1 1021,3 4541,3 2298,2 Kosmetyki półpłynna min 0,3 1,6 84,6 0,5 7,3 0,9 max 36,6 79,3 9371,2 1242, ,4 3274,3 stała min 0,8 1,6 172,7 5,7 23,8 0,5 max 78,7 1, ,3 2159,1 7213,2 8375,4 Farmaceutyki ciekła min 0,4 1,2 23,4 2,7 2,1 max 46,8 4,9 167,4 20,1 10,0 półpłynna min 0,3 1,5 max 4,6 6,6 ciekła min 5637,4 389,1 769,1 max 25307,2 1103,1 Środki min 218,1 259,1 713,7 półpłynna czystości max 1553,2 8512,1 1546,2 stała min 15,7 61,9 341,4 max 1541,3 * stężenia i zawartości podano w przedziałach: od najniższej oznaczonej wartości (min) do najwyższej (max); ** dla matrycy o postaci płynnej wynik podano jako stężenie wyrażone w [µg/ml], dla matryc o postaci półpłynnej i stałej wynik podano jako zawartość wyrażoną w [µg/g]. Oznaczanie konserwantów w produktach handlowych przeprowadzono dla 275 próbek (222 próbek kosmetyków i środków higieny osobistej, 31 próbek farmaceutyków i 22 próbek środków czystości). Zawartości poszczególnych konserwantów w badanych produktach są zróżnicowane i zależą od postaci fizycznej produktu. 21

22 Badania te miały na celu weryfikację opracowanej metody do zastosowań w produktach o zróżnicowanym składzie i postaci fizycznej. Pozwoliły również na porównanie otrzymanych zawartości do ilości dopuszczalnych przez odpowiednie przepisy. W żadnej z badanych próbek nie oznaczono większej ilości konserwantu niż jest to dozwolone. Opracowana metoda szybkiego, równoczesnego oznaczania substancji konserwujących może być przydatna w rutynowych analizach prowadzonych w przemyśle kosmetycznym i farmaceutycznym w celu kontroli wytwarzanych produktów. Rysunek 6 przedstawia chromatogramy zarejestrowane dla próbek, w których oznaczanie substancji konserwujących wykonano Metodą II (RP-HPLC-DAD). a) b) Rysunek 6. Chromatogramy próbek kosmetyków zarejestrowane techniką RP-HPLC-DAD (Metoda II), przy długości fali światła λ=237 nm (0 19 min) oraz λ=257 nm (19 22 min): (a) próbka toniku, (b) ekstrakt z próbki kremu po procedurze ekstrakcji techniką UAE. Rysunek 7 przedstawia chromatogramy zarejestrowane dla próbek, w których oznaczanie substancji konserwujących wykonano Metodą IV (RP-UHPLC-UV). a) b) Rysunek 7. Chromatogramy zarejestrowane techniką RP-UHPLC-UV (Metoda IV), przy długości fali światła: λ=274 nm (0 1,0 min) i λ=257 nm (1,1 3,0 min) dla próbki toniku (a) oraz dla ekstraktu uzyskanego z syropu po procedurze UAE (b). 22

23 4.6. BADANIA STABILNOŚCI ANALITÓW Stabilność metanolowych roztworów wzorcowych Stabilność krótko- i długoterminową wyznaczono dla metanolowych roztworów wzorcowych mieszanin analitów odpowiednio po 7 dniach i przez 12 kolejnych miesięcy. Badano próbki zawierające oznaczane związki na trzech poziomach stężeń i dla różnych warunków przechowywania roztworów (lodówka: T=4 C, temperatura pokojowa: T p : 20 C 35 C z dostępem światła i bez dostępu światła). Maksymalne ubytki analitów przy określeniu stabilności krótkoterminowej (7 dni) wynoszą: 8% dla ChT, 20% dla 4C3MPh, 10% dla 2PP, 15% dla TCS, 2% dla TCC, 0,5% dla MI, 5% dla CMI, 3% dla BA, 1% dla PS, 35% dla SB oraz 0,1% dla MP. Stabilność krótkoterminowa (badana po 7 dniach) większości oznaczanych analitów wynosi więc ponad 80% (ubytki maksymalne rzędu 20%). Wyjątek stanowi SB, dla którego stabilność jest zależna od sposobu przechowywania próbki i poziomu zawartości analitu w mieszaninie wzorców i wynosi % (ubytki rzędu 0 35%). Maksymalne ubytki analitów przy określeniu stabilności długoterminowej (12 miesięcy) wynoszą: 38% dla ChT, 41% dla 4C3MPh, 29% dla 2PP, 56% dla TCS, 29% dla TCC, 2% dla MI, 19% dla CMI, 18% dla BA, 15% dla PS, 52% dla SB oraz 19% dla MP. Wyniki badań stabilności długoterminowej, uzyskane po 12 miesiącach pokazują spadek zawartości analitów, w zależności od rodzaju związku i sposobu przechowywania próbki. Z otrzymanych danych wynika, że w przypadku przechowywania roztworów w temperaturze pokojowej (T p : 20 C 35 C) z dostępem światła ich stabilność jest w większości przypadków najmniejsza, większą stabilność wykazują przy braku dostępu światła i największą w przypadku przechowywania w lodówce (T=4 C). Maksymalny odnotowany ubytek po 12 miesiącach wynosi 56% i dotyczy TCS. Najbardziej stabilnym konserwantem jest MI, dla którego ubytki są niewielkie rzędu kilku procent (zawartość po 12 miesiącach min. 98% biorąc pod uwagę wszystkie poziomy stężeń i sposoby przechowywania roztworów) Stabilność wzorców w wodzie rzecznej W ramach przeprowadzonych badań wyznaczono także stabilność oznaczanych związków w wodzie w długim okresie czasu (24 miesiące). W celu przeprowadzenia badań stabilności analitów do próbki wody rzecznej (nie zawierającej oznaczanych związków) dodano wzorce. Badane próbki zawierały anality na dwóch poziomach stężeń odpowiadających ok. 90 i 10% zakresów roboczych krzywych kalibracyjnych. Badania te przeprowadzono dla różnych warunków otoczenia część próbek przechowywano w lodówce (T=4 C), drugą część przechowywano w temperaturze pokojowej (T p : 20 C 35 C w zależności od pory roku) z dostępem światła. Matrycą wody rzecznej, na której przeprowadzono badanie stabilności konserwantów i substancji dezynfekujących była woda pobrana z rzeki Wapienica (Bielsko-Biała, Polska). Wyniki badań przestawiono poniżej, jako maksymalny odnotowany ubytek, wyrażony w % w stosunku do ilości wzorca oznaczonego w pierwszym dniu analizy: stabilność krótkoterminowa (maksymalne ubytki po 7 dniach): 67% dla ChT, 10% dla 4C3MPh, 0,8% dla 2PP, 8% dla TCS, 6% dla TCC, MI i PS, 7% dla CMI, BA i SB i 4% dla MP; 23

24 stabilność długoterminowa (maksymalne ubytki po 24 miesiącach): 91% dla ChT, 63% dla 4C3MPh, 88% dla 2PP, 57% dla TCS, 36% dla TCC, 12% dla MI, 81% dla CMI, 10% dla BA, 50% dla PS, 30% dla SB i 71% dla MP. Stabilność krótkoterminowa 10 spośród 11 oznaczanych analitów w wodzie jest wysoka (ubytki < 10%), wyjątek stanowi ChT, dla której już w pierwszych dniach odnotowano duży spadek zawartości (ubytek rzędu 60%). Ponadto zaobserwowano duży spadek zawartości 2PP po 24 miesiącach przechowywania próbek, na obu z badanych poziomów stężeń (spadek zawartości do 12 25%). Wyniki badań stabilności długoterminowej, uzyskane po 24 miesiącach, wskazują na zasadność prowadzonych badań, ponieważ większość oznaczanych związków (wyjątek: ChT) jest stabilna w wodach. Nawet przy znacznym spadku zawartości, po 24 miesiącach, pozostałości oznaczanych związków są wciąż obecne w wodach. Uzyskane wyniki pokazują, że w temperaturze pokojowej (T p : 20 C 35 C) stabilność oznaczanych związków jest mniejsza niż w przypadku przechowywania w lodówce (T=4 C). Największy spadek zawartości (do ok. 9% zawartości początkowej = ubytek rzędu 91%) zaobserwowano dla ChT. Najbardziej stabilnymi związkami okazały się MI i BA (ubytki rzędu 10 13%, bez względu na warunki przechowywania próbki), a także CMI (ubytek < 10%) i PS (ubytek < 13%) w przypadku przechowywania próbki wody w niskich temperaturach (T=4 C) Stabilność konserwantów w kosmetykach Stabilność substancji konserwujących, zarówno w kosmetykach jak i farmaceutykach, jest bardzo ważnym zagadnieniem. Aby zachować czystość mikrobiologiczną tych preparatów, substancje konserwujące muszą być w nich zawarte w odpowiednim stężeniu i w określonej formie. Istnieją jednak czyniki sprzyjające degradacji konserwantów do innych związków, stanowiących potencjalne niebezpieczeństwo dla konsumentów. Może to wynikać z jednej strony z braku ich działania przeciwdrobnoustrojowego, z drugiej z ich toksyczności. Spośród oznaczanych substancji konserwujących degradacji mogą ulegać m.in.: BA, SB, PS, MP. Na temat pozostałych konserwantów (MI, CMI) nie znaleziono informacji dotyczących ich degradacji i metabolizmu. W ramach przeprowadzonych badań wyznaczono stabilność oznaczanych konserwantów w czterech wybranych matrycach kosmetyków i środków higieny osobistej (pasta do zębów, krem, żel oraz płyn do płukania jamy ustnej). Badania prowadzono przez 12 miesięcy. W celu przeprowadzenia badań stabilności analitów, do matryc produktów kosmetycznych (nie zawierających oznaczanych związków) dodano odpowiednie ilości wzorców. Próbki przechowywano w temperaturze pokojowej, część próbek pozostawiono otwarte, drugą część zamknięto. Warunki w jakich wykonywano badania dobrano odpowiednio do potencjalnych warunków przechowywnia kosmetyków w życiu codziennym. Wyniki uzyskane po 12 miesiącach pokazują nawet do 100% ubytku analitów. Zgodnie z tym co przewidywano, dla próbek pozostawionych jako otwarte obserwuje się większe zmiany niż dla próbek zamkniętych. Zmiany te są zróżnicowane także w obrębie testowanych matryc kosmetyków zależą od składu próbek i ich postaci fizycznej. Największy spadek zawartości (do 0%) zaobserwowano dla CMI (próbki otwarte: pasta, płyn) i BA (próbki otwarte: pasta, żel, płyn). 24