12. POMIARY 3: analiza kształtu komórek

Transkrypt

1 12. POMIARY 3: analiza kształtu komórek Parametry z Set Measurement Niektóre parametry z Set Measurement mają zastosowanie tylko do obrazów monochromatycznych lub barwnych (wszystkie te, które odnoszą się do poziomów szarości) inne tylko do obrazów binarnych. Mean Grey Value, Standard Deviation, Modal Grey Value, Min & Max Gray Value, Median, Skewness, Kurtosis - średni poziom szarości, odchylenie standardowe, modalna poziomu szarości, minimalny i maksymalny poziom szarości, oraz mediana, współczynnik asymetrii i spłaszczenia - dla obrazu, selekcji lub obiektów wyznaczonych przez maskę. Dla obrazów binarnych parametry te nie mają sensu. Area - powierzchnia w pikselach kwadratowych Perimeter - obwód Centroid - środek ROI lub obiektu (uśredniona wartość współrzędnych x i y pikseli należących do ROI lub obiektu Center of Mass (środek ciężkości) - średnia ze współrzędnych i poziomu szarości pikseli w ROI lub obiektach Bounding Rectangle - najmniejszy prostokąt obejmujący ROI lub obiekt. Opcja daje cztery pomiary w oknie Results: BX, BY - współrzędne lewego górnego rogu prostokąta. Width, Height - szerokość i wysokość prostokąta. Fit Elipse - dopasowuje elipsę do ROI lub obiektu. Mierzy długość dłuższej i krótszej osi tej elipsy (Major, Minor) oraz kąt między dłuższą osią elipsy a osią X obrazu (Angle) Shape Descriptors - Oblicza kilka parametrów kształtu, jest to szczególnie przydatne w odniesieniu do komórek o skomplikowanej morfologii, takich jak komórki tkanki nerwowej. Circularity (form factor, współczynnik kształtu, kołowość) = 4π*Area/Perimeter 2 Aspect Ratio (współczynnik wydłużenia - stosunek długości osi elipsy) Roundness = Major axis/minor axis = 4*Area/π*(major axis) 2 Solidity (współczynnik masywności) - stosunek powierzchni obiektu do powierzchni otoczenia wypukłego (Convex hull) czyli wypukłego wielokąta opisanego na obiekcie = Area/Convex Hull Area

2 Rys Sylwetka komórki i obrys jej otoczenia wypukłego (convex hull) Feret's diameter - średnica Fereta - w ImageJ to najdłuższa oś jaką można przeprowadzić przez obiekt lub ROI. Polecenie zwraca szereg parametrów, Feret - to dlugość tej osi, FeretX, FeretY - współrzędne początku, Feret Angle - kąt z osią X obrazu, Min Feret - najkrótsza oś jaką można przeciągnąć międzi przeciwległymi brzegami obiektu Integrated density - suma poziomów szarości pikseli w ROI lub obiektach wyznaczonych przez maski Area Fraction - procent zbinaryzowanej powierzchni w stosunku powierzchni całego obrazu Limit to threshold - po zaznaczeniu tej opcji program wykonuje pomiary tylko w odniesieniu do pikseli pokrytych maską Display Label - po zaznaczeniu w oknie Result w pierwszej kolumnie wyświetla się nazwa obrazu i numer w stosie (w przypadku stosów) PLUGINY PARTICLES 8 Plugin Particles8 i jego rozbudowana wersja Partices8 Plus pełnią analogiczną funkcję jak Analyse Particles. Mierzą jednak więcej parametrów, niż program podstawowy. Autorem pluginów jest Gabriel Landini, a pluginy i makra, wraz z dokładniejszym opisem, można znaleźć na stronie: Slice: Liczba obrazów w stosie Number: Numer mierzonego obiektu XStart, YStart: współrzędne pierwszego piksela obiektu (licząc od lewego górnego rogu obrazu) Perim: Obwód obliczone na podstawie środków granicznych pikseli Area: Powierzchnia wielokąta określonego przez Perimeter - UWAGA - to jest inny sposób liczenia obwodu i powierzchni, toteż wartości uzyskane przez plugin będą się wyraźnie różnić od tych uzyskanych przez główny program.

3 Rys Pomiar powierzchni i obwodu przez funkcję Analyze Particles i plugin Particles8. Dla pierwszej funkcji powierzchnia jest równa liczbie pikseli, w pluginie powierzchnia obiektu to powierzchnia wielokąta powstałego przez połączenie środków skrajnych pikseli (żółta linia), a obwód tego wielokąta to obwód obiektu. Czerwona linia pokazuje sposób pomiaru obwodu przez Analyze Particles. Pixels: Liczba pikseli w obiekcie XM; YM: współrzędne środka ciężkości obiektu ROIX1; ROIY1; ROIX2; ROIY2: współrzędne lewego górnego i prawego dolnego rogu prostokąta otaczającego obiekt MinR; MaxR - promienie okręgu wpisanego i opisanego na obiekcie, z środkiem w centrum ciężkości Feret: Średnica Fereta (niekiedy określana też jako wysokość albo długość obiektu) FeretX1; FeretY1; FeretX2; FeretY2 - współrzędne początku i końca średnicy Fereta. FAngle: Kąt między średnicą Fereta a osią X obrazu Breadth: Szerokość - najdłuższa oś w obiekcie, prostopadła do średnicy Fereta. BrdthX1; BrdthY1; BrdthX2; BrdthY2 - współrzędne początku i końca szerokości CHull: Obwód otoczenia wypukłego (convex hull - najmniejszy wielokąt wypukły opisany na obiekcie) CArea: powierzchnia otoczenia wypukłego, MBCX; MBCY, MBCRadius: współrzędne środka i promień najmniejszego okręgu opisanego na obiekcie (Minimal Bounding Circle) AspRatio: Aspect Ratio = Feret/Breadth - współczynnik wydłużenia, Circ: Circularity = 4*Pi*Area/Perimeter2 - podobnie jak w głównym programie, ale ze względu na inny sposób liczenia powierzchni i obwodu plugin da inne wartości

4 wszystkim parametrów, których obliczenie opiera się właśnie na powierzchni i obwodzie. Spośród rozlicznych parametrów tego typu najczęściej wykorztywane to Solidity: Solidity = Area/Convex_Area (współczynnik masywności), Concavity: Concavity = Convex_Area-Area, Convexity: Convexity = Convex_Hull/Perimeter (współczynnik wypukłości), Sphericity: Sphericity = MinR/MaxR, ArBBox: ArBBox = Feret*Breadth. Rectang: Rectangularity = Area/ArBBox. This approaches 0 for cross-like objects, 0.5 for squares, pi/4=0.79 for circles and approaches 1 for long rectangles. Uwaga: Przy pomiarach morfologicznych należy zwracać uwagę jak program traktuje otwory wewnątrz struktury. W przypadku komórek tkanki nerwowej często zdarza się, że wypustki mogą się nakładać na siebie na obrazie (co jest oczywiście wynikiem rzutowania na jedną płaszczyznę struktur trójwymiarowych. Program nie radzi sobie zbyt dobrze z taką sytuacją - co ilustruje rys O ile Analyze Particles, przy wyłączonej opcji Include Holes daje właściwy pomiar powierzchni, to niezależnie od włączenia czy wyłączenia tej opcji przy pomiarze obwodu program ignoruje wnętrze struktury, w efekcie pomiar obwodu jest zaniżony. W konsekwencji błędne są także wartości parametrów, do których wyliczenia brany jest obwód. Także plugin Particles8 nie podaje prawidłowych wyników. Rys Pomiary obiektów z dziurami. Na niebiesko zaznaczone prawidłowe wyniki do górnego obiektu. Plugin Particles8 nie uwzględnia otworów w obiektach

5 12.3. Analiza Sholla Jedna z często stosowanych metod, przy której można stosować zarówno szkielet komórki, jak i pełną sylwetkę opiera się na pomyśle zaproponowanym w 1953 r. przez D.A.Sholla. W tej metodzie obraz komórki umieszany jest na siatce zbudowanej z koncentrycznych okręgów. Następnie zliczane są przecięcia wypustek z kolejnymi okręgami. Dalsza analiza może przebiegać dwojako. Większość badaczy po prostu porównuje ze sobą liczbę przecięć dla poszczególnych okręgów w badanych grupach komórek. Niekiedy oblicza się współczynnik Sholla (SC, Sholl coefficient). Obliczenie opiera się na odkryciu, że jeśli liczbę przecięć wypustek komórki z okręgami siatki, podzieloną przez obwód okręgu przedstawi się na wykresie półlogarytmicznym, to poszczególne punkty ułożą się w przybliżeniu na linii prostej. Nachylenie tej prostej (slope) jest określane mianem współczynnika Sholla, jego wartość jest tym wyższa, im bardziej rozgałęziona komórka. Rys Analiza Sholla. Górny wykres przedstawia najczęściej stosowany sposób prezentacji wyników, dolny sposób obliczania współczynnika Sholla Funkcja do analizy Sholla została opracowana oryginalnie dla FIJI, ale po skopiowaniu pliku Sholl_Analysis jar do folderu plugins z ImageJ będzie również działała w podstawowej wersji programu - pojawi się na dole menu Analyze. Funkcja ma bardzo wiele opcji - szczegółowy opis znajduje się na stronie: Pierwszy krok to narysowaniu linii przy pomocy narzędzia do selekcji liniowej. Jeden koniec linii powinien się znaleźć w środku komórki, natomiast drugi powinien sięgać do końca zasięgu wypustek. Dopiero po narysowaniu takiej linii można uruchomić funkcję Sholl Analysis (rys. 12.5).

6 Rys Analiza Sholla. Po lewej komórka mikrogleju (obraz musi być zbinaryzowany), po prawej panel do ustawiania opcji. Najważniejsze opcje to radius step size - czyli odstęp między okręgami siatki oraz infer from starting radius - zaznaczenie tej opcji spowoduje, że program potraktuje wypustki przechodzące przez pierwszy okrąg jako wypustki pierwszego rzędu. Promień największego okręgu zostanie wyliczony z narysowanej linii selekcji, natomiast promień pierwszego okręgu powinien być dobrany tak, aby okrąg ten znajdował się na zewnątrz kadłuba komórki (jeżeli zależy nam na prawidłowym oszacowaniu liczby wypustek pierwszego rzędu (czyli tych które wychodzą bezpośrednio z kadłuba). Spośród współczynników wyliczonych podczas analizy najbardziej przydatny może być współczynnik Sholla (regression coefficient), promień okręgu z którym wypustki tworzą najwięcej przecięć (Max inters. radius) i liczba przecięć z tym okręgiem (Max inters), a także współczynnik Schoenena (ramification index) - stosunek między maksymalną liczbą przecięć z okręgiem a liczbą wypustek pierwszorzędowych.

7 Rys Wyniki analizy Sholla.W oknie Sholl profiles mamy liczbę przecięć wypustek komórki z liniami siatki, natomiast w Sholl results cały szereg współczynników wyliczonych podczas analizy. Regression coefficient to właśnie współczynnik Sholla Analiza fraktalna Wymiar fraktalny (D, Df) to pojęcie wywodzące się z geometrii fraktalnej B.Mandelbrota. Opiera się na założeniu samopodobieństwa (selfsimilarity) zgodnie z którym obiekt wygląda podobnie niezależnie od powiększenia. Ocena wymiaru fraktalnego jest miarą stopnia złożoności przestrzennej obiektu, albo innymi słowy jest oceną stopnia zapełnienia przestrzeni przez obiekt. Dla obiektów eklidesowych (linia, kwadrat, okrąg) na płaszczyźnie wartość tego wymiaru wynosi 1, im bardziej skomplikowany zarys obiektu tym wartość D zbliża się do 2. Dla obiektów trójwymiarowych wartość D mieści się w zakresie od 2 do 3. Obiekty biologiczne komórki, zespoły komórek, sieci naczyniowe etc. jedynie w pewnym zakresie wykazują właściwość samopodobieństwa. Można jednak mierzyć ich przybliżony wymiar fraktalny i traktować to jako miarę stopnia zapełnienia płaszczyzny lub przestrzeni przez te obiekty.

8 Istnieje wiele metod szacowania wymiaru fraktalnego. Najczęściej stosujemy w naszych badaniach to: - metoda pudełkowa; - metoda dylatacji; Rys Metoda pudełkowa szacowania wymiaru fraktalnego.. S nachylenie linii regresji, r długość boku kratki; N liczba kratek pokrywających brzeg komórki.

9 Zbigniew Sołtys - Komputerowa Analiza Obrazu Mikroskopowego 2015 część 12 W ImageJ jest funkcja licząca wymiar fraktalny metodą pudełkową (Analyse Tools Fractal Box Count). W metodzie pudełkowej obraz jest pokrywany siatkami o coraz większych kratkach, najczęściej od 2 do 64 pikseli, następnie zlicza się liczbę kratek które pokrywają obiekt i podobnie jak w metodzie dylatacji rysuje się podwójny wykres logarytmiczny. Zwykle wielkość kratek jest potęgą 2, choć nie jest to warunkiem koniecznym. Nachylenie uzyskanej linii jest ułamkową częścią wymiaru fraktalnego. Metoda jest łatwiejsza niż metoda dylatacji, ale daje nieco zaniżone wartości wymiaru fraktalnego. Rys Funkcja do analizy fraktalnej - metoda pudełkowa W metodzie dylatacji najpierw uzyskujemy obrys komórki o grubości 1 piksela. Następnie każdy piksel w tym obrysie jest zastępowany przez dyskoidalny element o średnicy od 3 do kilkudziesięciu pikseli (najprościej używać do tego funkcji Binary Dilate). Każdorazowo mierzona jest powierzchnia poszerzonego obrysu. Następnie rysowany jest wykres przedstawiający zależność między log(a/e) i log(e) gdzie A to powierzchnia poszerzonego obiektu a e to średnica elementu poszerzającego. Najprościej wykonać to zadanie korzystając z programów liczących regresję liniową (Excel, Statistica). Zazwyczaj ograniczamy zakres pomiaru w taki sposób, aby brać pod uwagę jedynie liniowy odcinek otrzymanej krzywej. W takim przypadku wybieramy zakres wartości e dla których odchylenie standartowe szacowanej regresji nie przekracza 0,0086 i wówczas nachylenie (S) linii regresji służy do obliczenia wymiaru fraktalnego według wzoru: D = 1 S

10 Zbigniew Sołtys - Komputerowa Analiza Obrazu Mikroskopowego 2015 część 12 Odmianą tej metody (według niektórych dającę lepsze oszacowanie wymiaru fraktalnego) jest metoda oparta na EDM (Distance Map). W tej metodzie piksele tła obrazu binarnego otrzymują wartość poziomu szarości zależną od ich odległości od najbliższego piksela obiektu. Następnie zlicza się powierzchnię zajmowaną przez piksele o odpowiednim poziomie szarości. Dalsze postępowanie jest takie same jak przy zwykłej dylatacji. Rys Po lewej: pierwsze etapy dylatacji obrysu komórki, po prawej u góry wykres zależności między log(a/e) a log(e), u dołu ten sam wykres po ograniczeniu zakresu e. Zaletą analizy fraktalnej jest to, że może być ona stosowana zarówno do pojedynczych komórek, jak i do całych grup. W obu przypadkach analizę przeprowadza się zazwyczaj na obrysach (outline) komórek. Wymiar fraktalny komórek dobrze koreluje z subiektywną oceną złożoności. Wadą jest to, że komórki o różnym kształcie mogą mieć taki sam wymiar fraktalny, stąd też wartość wymiaru fraktalnego nie może być jedynym parametrem opisującym kształt komórki.