Wykorzystanie mutantów w biologii

Transkrypt

1 Wykorzystanie mutantów w biologii Piotr Gawroński piotr_gawronski@sggw.pl 2/68 pt sites.google.com/site/chlorotfs

2 Mutacje Mutacja to zmiana sekwencji nukleotydowej cząsteczki DNA, a przez to informacji genetycznej, może dotyczyć kodujących lub niekodujących części genomu. Mutant to osobnik o zmienionym genotypie.

3 Zastosowanie mutantów Cel Poznawczy w genomice funkcjonalnej w celu badania funkcji genów, ekspresji i struktury Cel Praktyczny do produkcji różnych substancji wykorzystywanych w wielu dziedzinach np. mutant Aspergillus niger stosowany jest do produkcji kwasy cytrynowego w hodowli roślin jako źródło zmienności i otrzymywanie nowych linii hodowlanych, np. otrzymanie mutantów soi rosnących dobrze w warunkach klimatycznych Polski; otrzymanie nowych, ciekawych cech roślin ozdobnych, np. chryzantemy wielkokwiatowej Jabłko odmiany Gala sport Natali, czerwony spontaniczny mutant odmiany Gala

4 Podział mutacji (1) Możliwość dziedziczenia Mutacje germinalne & mutacje somatyczne

5 Podział mutacji (2) Spontaniczne związane z błędami w replikacji lub w procesie naprawy uszkodzonego DNA Indukowane wynik działania czynników mutagennych (działanie na nić rodzicielską, zmiana struktury, wpływ na tworzenie wiązań komplementarnych, wprowadzenie błędu)

6 Mutacje indukowane- czynniki mutagenne Fizyczne Promieniowanie jonizujące Promienie jonizujące, przechodząc przez komórki, wybijają elektrony z atomów i cząsteczek, powodując ich jonizację. Powstałe jony mogą inicjować rozmaite reakcje wolnorodnikowe uszkadzające DNA. Modyfikacje zasad azotowych lub ich rozpad, pękanie wiązań fosfodiestrowych, fragmentacja chromosomów Promieniowanie nadfioletowe powstawanie dimerów C-C, C-T, T-T

7 Mutacje indukowane- czynniki mutagenne Chemiczne kwas azotowy (III) HNO2: deaminuje C, A i G hydroksylamina (HA) NH2OH: reaguje z cytozyną, przekształcając ją w związek podobny do uracylu, w konsekwencji może prowadzić to do tranzycji

8 Mutacje indukowane- czynniki mutagenne Chemiczne związki alkilujące: sulfonian dwuetylowy (EES), sulfonian etylometylowy (EMS), iperyt azotowy Największą wrażliwość na alkilację w α-helisie wykazuje atom azotu (N7) guaniny. W dalszej kolejności mogą ulegać alkilacji atomy azotu guaniny (N1), adeniny (N1 i N3) i cytozyny (N3).

9 Mutacje indukowane- czynniki mutagenne Chemiczne Analogi zasad: 5-bromouracyl ( analog T) 2- aminopuryna (analog A) Barwniki akrydynowe: proflawina, oranż akrydynowy, akryflawina

10 Mutacje indukowane- czynniki mutagenne Chemiczne Czynniki interkalujące np. bromek etydyny

11 Podział mutacji (3) Mutacje genowe (punktowe) zmiana sekwencji nukleotydowej genu: tranzycja (puryna na purynę, pirymidyna na pirymidynę) transwersja (puryna na pirymidynę i odwrotnie) delecja insercja

12 Podział mutacji (3) Mutacje punktowe: SYNONIMICZNA zamiana danego kodonu na kodon synonimowy, kodujący ten sam aminokwas ZMIANY SENSU substytucja aminokwasu, po mutacji powstanie kodon oznaczający inny aminokwas NONSENSOWNA gdy kodon sensowny zostanie zamieniony na nonsensowny (w środku sekwencji powstanie sygnał terminacji translacji) ZMIANY FAZY ODCZYTU wypadnięcie lub wstawienie nukleotydu/ów (ale nie w liczbie 3 lub wielokrotności 3)

13 Podział mutacji (3) Mutacje chromosomowe strukturalne Powodowane przez pęknięcia a następnie przemieszczenie fragmentu chromosomu: utrata fragmentu (delecja) zwielokrotnienie fragmentu (duplikacja) odwrócenie fragmentu (inwersja) przemieszczenie fragmentu do innego chromosomu (translokacja) wbudowanie fragmentu chromosomu (insercja)

14 Podział mutacji (3) Mutacje chromosomowe - przyczyny Zaburzenia mechaniczne podczas mejozy lub mitozy np. zaplątanie się chromosomów Deficyt jonów Ca2+ i Mg2+ (u szeregu roślin) Promieniowanie jonizujące, związki alkilujące (diepoksybutan, mitomycyna C, pochodne iperytu, etylenoiminy)

15 Mutacje chromosomowe liczbowe Aneuploidy - dotyczą części garnituru chromosomalnego gdy w normalnym diploidalnym zestawie chromosomów nastąpi utrata lub dodanie a) jednego chromosomu homologicznego: 2n - 1, taka mutacje nazwiemy monosomia 2n +1, taka mutacje nazwiemy trisomia b) Lub całych par chromosomów homologicznych: 2n - 2, czyli nullisomie 2n +2, czyli tetrasomie Euploidy dotyczą całego zespół chromosomów (naturalne lub sztucznie otrzymane): Autopoliploidy - Zwielokrotniona w stosunku do normalnej liczba chromosomów pochodzi z tego samego gatunku (często z tego samego osobnika). Allopoliploidy (amfidiploidy) - Pochodzenie mieszańcowe z połączenia gamet spokrewnionych gatunków.

16 Mutacje chromosomowe liczbowe Autoploidia - zwielokrotnieniu ulega cały garnitur chromosomalny (w obrębie jednego gatunku) Poliploidy: liczba chromosomów ulega zwielokrotnieniu, organizmy zmutowane określa się w zależności od liczby chromosomów jako triploidalne (3n), tetraploidalne (4n) bądź pentaploidalne (5n). u roślin powoduje bujniejszy rozwój i owocowanie u zwierząt prowadzą do obniżenia żywotności i śmierci osobników. Związkiem powodującym zahamowanie tworzenia wrzeciona kariokinetycznego a przez to zduplikowanie liczby chromosomów jest kolchicyna. Monoploidy: Organizmy, które normalnie są diploidalne (2n), lecz w wyniku mutacji ich liczbę chromosomów wynosi n, nazywa sie monoploidami (w odróżnieniu od organizmów haploidalnych, które naturalnie posiadają n chromosomów).

17 Mutacje chromosomowe liczbowe Alloploidia = amfiploidia Alloploidami są na przykład: muł - krzyżówka konia z osłem, żubroń - krzyżówka żubra z krową, tigrolew - mieszaniec lwa i tygrysa. leopon - lwica skrzyżowana z leopardem volfin - delfin skrzyżowany z wielorybem

18 Mutageneza w badaniach genetyki rozwoju Mutageneza chemiczna EMS Mutageneza radiacyjna FN (fast neutron) Mutageneza insercyjna T-DNA Mutageneza insercyjna transpozonami

19 Terminologia w analizie genetycznej Genotyp zestaw alleli składający się na diploidalny genom organizmu Fenotyp widoczne cechy/właściwości organizmu Zmiany w funkcji produktu genu: Mutacja loss-of-function (lof) ograniczenie lub utrata funkcji produktu, lub brak produktu; zwykle jest to mutacja recesywna (fenotyp można zaobserwować jedynie w m. homozygotycznym); jeśli pozostaje śladowa funkcja mutacja przeciekająca (leaky mutation) Mutacja null całkowita utrata funkcji Gain of function (gof) mutacja nabycia funkcji (nowa funkcja lub nadmiarowa wynikająca ze zwiększonej ilości produktu genu),

20 Terminologia w analizie genetycznej Mutacja supresorowa druga mutacja ograniczająca lub eliminująca fenotyp pierwszej mutacji Mutacja enhancerowa wzmacnia fenotyp innej mutacji Gawroński et al., unpublished Waszczak et al., 2016

21 Dwa podejścia badawcze do mutantów Forward genetics: Wyszukiwanie w populacji mutantów interesującego nas fenotypu, a następnie identyfikacja miejsca mutacji (czyli genu). fenotyp gen Reverse genetics: Wyszukiwanie w populacji mutantów takich linii, które posiadają mutacje w określonym wybranym genie, a następnie charakterystyka fenotypu i identyfikacja funkcji genu gen fenotyp

22 Mutageneza insercyjna Z wykorzystaniem T-DNA Z wykorzystaniem transpozonów Zalety: Zmutowane geny zawierają znacznik (znaną sekwencję) przez co dużo łatwiej je zidentyfikować Mogą zawierać markery selekcyjne ułatwiające selekcję roślin z insercją

23 Tworzenie kolekcji mutantów insercyjnych O Malley & Ecker 2010

24 Genotypowanie

25 Genotypowanie mutantów insercyjnych Genotypowanie to podejście umożliwiające identyfikację genetyczną osobników czyli określenie ich genotypu. Etapy: Izolacja DNA genomowego. Reakcja PCR z odpowiednimi starterami. Rozdział produktów PCR na żelu agarozowym.

26 Mutageneza T-DNA na dużą skalę transgenicznych roślin pokolenia T1 Około 1,5 insercji na linię (po sprawdzeniu rozszczepienia) niezależnych integracji T-DNA (96 % prawdopodobieństwa trafienia wszystkich genów A. thaliana) Dla określono precyzyjne miejsce integracji w genomie (amplifikacja PCR i sekwencjonowanie) Zdetektowano mutacje w genach (74 % opisanych u A. thaliana)

27 Nierówna dystrybucja insercji w genomie rzodkiewnika

28 Nasiona A. thaliana można uzyskać z następujących źródeł

29 Generowanie mutantów chemicznych u rzodkiewnika

30 Test alleliczności Jeśli posiadamy dwa mutanty o tym samym fenotypie jak sprawdzić czy mają one mutację w tym samym czy innym genie? Testy alleliczności sprawdzają czy dwie niezależne mutacje wpływające na tę samą cechę są: alleliczne (w tym samym genie) niealleliczne (w różnych genach współdziałających w determinacji tej cechy)

31 Mutageneza ukierunkowana TALENs: Transcription activator-like effector nucleases ZFNs: Zinc-finger nucleases CRISPR-Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)

32 Mysz jako organizm modelowy do badań na ssakach Cykl życiowy: Ruja co około 4 dni 20 dniowa ciąża 4-8 potomstwa w miocie 2-8 miotów na samicę 7 tygodni do uzyskania dojrzałości płciowej Długość życia 2-3 lata Znany genom 20 chromosomów 2.6 GB ok genów 99% genów ma swoje homologii ludzkie

33 Jak powstają mutany mysie Metody oparte na homologicznej rekombinacji System Cre-LoxP Metody wykorzystujące zarodkowe komórki macierzyste System rekombinacji Cre LoxP LoxP: miejsca flankujące naszą sekwencję rozpoznawane przez rekombinazę Cre Rekombinaza Cre: dzięki umieszczeniu genu Cre pod kontrolą odpowiedniego promotora (np. tkankowo-specyficznego lub indukowalnego) można pozbawić organizm genu tylko w niektórych tkankach lub w odpowiedzi na określone czynniki.

34 Na czym polega system cre-loxp

35 Mysie linie reporterowe

36 Mutanty mysie można znaleźć w: