Ogólnopolski Sprawdzian Wiarygodności Badań Mikrobiologicznych POLMICRO 2008

diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics 2009 Volume 45 Number 1 27-34 Kontrola jakości Quality control Ogólnopolski Sprawdzian Wiarygodności Badań Mikrobiologicznych POLMICRO 2008 Elżbieta Stefaniuk 1,2, Patrycja Ronkiewicz 1, Ewa Młodzińska 1, Beata Chmylak 1, Janusz Fiett 1,2, Waleria Hryniewicz 1,2 1 Centralny Ośrodek Badań Jakości w Diagnostyce Mikrobiologicznej, Warszawa, Poland 2 Narodowy Instytut Leków, Warszawa, Poland Streszczenie Praca niniejsza stanowi przedstawienie i omówienie wyników XV edycji Ogólnopolskiego Sprawdzianu Wiarygodności Badań Mikrobiologicznych POLMICRO 2008. W roku 2008 Centralny Ośrodek Badań Jakości w Diagnostyce Mikrobiologicznej (COBJDM) zorganizował dwa typy sprawdzianów: jeden przeznaczony dla laboratoriów świadczących diagnostykę w szerokim zakresie oraz drugi oddzielny sprawdzian, przeznaczony dla pracowni schorzeń jelitowych stacji sanitarno-epidemiologicznych. W ramach sprawdzianu COBJDM przygotował i rozesłał do laboratoriów następujące izolaty bakteryjne: Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus lugdunensis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus oralis, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, Yersinia kristensenii, Shigella boydi, Salmonella enterica ser. Typhimurium, Salmonella enterica ser. Enteritidis, Morganella morgannii. Izolaty charakteryzowały się różnymi fenotypami wrażliwości na leki oraz różnymi mechanizmami oporności. Zadaniem laboratoriów była identyfikacja badanych izolatów do poziomu gatunku oraz określenie lekowrażliwości na wszystkie wymienione w ankiecie antybiotyki i chemioterapeutyki oraz podanie informacji o wykrytych mechanizmach oporności. Polish National External Quality Assesment Scheme in Microbiological Diagnostics POLMICRO 2008 Summary The objective of this study was to analyse and discuss the results of 15th edition of Polish National External Quality Assessment Scheme in Microbiological Diagnostics POLMICRO 2008. In 2008 two different types of proficiency programme were organised. The first one was aimed at laboratories providing a broad spectrum of microbiological diagnostics. The second, was prepared for enteric diseases laboratories in sanitary inspection. In 2008 edition the following strains were distributed by the Centre of Quality Control in Microbiology (CQCM): Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus lugdunensis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus oralis, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, Yersinia kristensenii, Shigella boydii Salmonella enterica ser. Typhimurium, Salmonella enterica ser. Enteritidis, Morganella morgannii. The distributed isolates present different susceptibility patterns and different mechanisms of resistance. The task of the laboratory was to identify to the species level every strain and to determine their susceptibility to all antibiotics listed in the questionnaire. The laboratories were also obliged to interpret and comment detected resistance mechanisms. Słowa kluczowe: zewnątrzlaboratoryjny sprawdzian wiarygodności, identyfikacja, lekowrażliwość, mechanizmy oporności Key words: external quality assessment scheme, identification, susceptibility to antimicrobial agents, resistance s mechanisms Wstęp W Polsce sprawdzian wiarygodności badań w mikrobiologii mający na celu ocenę kompetencji laboratoriów mikrobiologicznych, zwłaszcza w obszarze oznaczania lekowrażliwości i wykrywania mechanizmów oporności na leki drobnoustrojów wywołujących zakażenia szpitalne, ale także nabyte poza szpitalem, po raz pierwszy został zorganizowany w roku 1994. Program ten otrzymał nazwę POLMICRO, a zainicjowany został w grudniu 1993 roku przez Komisję Standaryzacji i Kontroli Jakości Badań Laboratoryjnych i Mikrobiologicznych przy Departamencie Polityki Zdrowotnej Ministerstwa Zdrowia i Opieki Społecznej przy współpracy z Krajowym Zespołem Konsultanta Medycznego ds. Mikrobiologii. Od roku 1997 organizację badań międzylaboratoryjnych przejął, powołany przez Ministra Zdrowia i Opieki Społecznej, Centralny Ośrodek Badań Jakości w Diagnostyce Mikrobiologicznej. Kontrole zewnątrzlaboratoryjne są organizowane na całym świecie i obejmują różne dziedziny medycyny laboratoryjnej. Sprawdziany międzylaboratoryjne mają zasięg lokalny (kra- 27

Ogólnopolski Sprawdzian Wiarygodności Badań Mikrobiologicznych POLMICRO 2008 jowe), kontynentalny, jak również ogólnoświatowy. Zadaniem sprawdzianów jest poprawa poziomu diagnostyki, standaryzacja stosowanych metod diagnostycznych, a tym samym zwiększenie liczby laboratoriów wiarygodnych. Program POLMICRO ma zasięg ogólnopolski, a jego formuły, odbywające się w kolejnych latach i są różnorodne. W poszczególnych edycjach programu poruszane są aktualne problemy z zakresu klinicznej diagnostyki mikrobiologicznej. W roku 2008 w XV edycji ogólnopolskiego sprawdzianu wiarygodności badań mikrobiologicznych POLMICRO udział wzięło 530 laboratoriów mikrobiologicznych. Zdecydowaną większość stanowiły laboratoria medyczne, szpitalne i pozaszpitalne, publiczne i niepubliczne, ale również laboratoria inspekcji sanitarnej i inspekcji weterynaryjnej. Ze względu na zróżnicowany profil laboratoriów i zakres prowadzonej diagnostyki mikrobiologicznej, a tym samym różne oczekiwania laboratoriów odnośnie do zewnętrznej kontroli jakości, Centralny Ośrodek Badań Jakości w Diagnostyce Mikrobiologicznej, podobnie jak w latach poprzednich, zorganizował dwa rodzaje sprawdzianów: sprawdzian POLMICRO 2008 przeznaczony dla laboratoriów klinicznych i innych świadczących szeroką diagnostykę mikrobiologiczną oraz sprawdzian PO- LMICRO 2008/SSE przeznaczony dla pracowni/laboratoriów schorzeń jelitowych. Sprawdzian POLMICRO 2008 (ogólny) obejmował trzy tury porównań międzylaboratoryjnych, a sprawdzian POLMICRO 2008/SSE dwie tury kontroli. Tematem niniejszego opracowania jest omówienie specyfiki i rezultatów XV edycji POLMICRO 2008, z uwzględnieniem dwóch typów zorganizowanych sprawdzianów. Materiał i metody Laboratoria przystępujące do sprawdzianu XV edycji PO- LMICRO 2008, w ramach każdej tury sprawdzianu, otrzymywały ustalony komputerowo zestaw izolatów zakodowanych wielkimi literami od A do D (tab. I). Do szczepów dołączona była szczegółowa instrukcja postępowania z badanymi szczepami drobnoustrojów, a także informacja dotycząca zasad udzielania odpowiedzi, wnoszenia i rozpatrywania reklamacji. Zadaniem laboratoriów była identyfikacja badanych izolatów do poziomu gatunku oraz określenie lekowrażliwości na wymienione w ankiecie antybiotyki i chemioterapeutyki oraz podanie informacji o wykrytych mechanizmach oporności. Uzyskane wyniki należało przesłać drogą elektroniczną do Centralnego Ośrodka, poprzez wypełnienie ankiety dostępnej dla każdego laboratorium na stronie internetowej Ośrodka www.polmikro.edu.pl. W roku 2008 elektroniczna forma ankiety dostępna była w obu typach zorganizowanego sprawdzianu. Wyniki lekowrażliwości podlegały ocenie tylko w przypadku prawidłowej identyfikacji badanego szczepu do poziomu gatunku. Ocena popełnianych błędów w oznaczaniu lekowraż- Tabela I. Izolaty bakteryjne będące przedmiotem oceny w poszczególnych turach sprawdzianu z rozbiciem na dwa typy programu POLMICRO 2008 (XV edycja). Tura sprawdzianu Gatunek drobnoustrojów Numer kolekcji POLMICRO Mechanizm oporności POLMICRO 2008 (edycja ogólna) I tura Staphylococcus epidermidis PM-130 MSSE Staphylococcus epidermidis PM-131 MSSE Staphylococcus epidermidis PM-132 MRSE, MLSB Staphylococcus lugdunensis PM-133 MSSL II tura Streptococcus pneumoniae PM-137 Streptococcus oralis PM-138 III tura Acinetobacter baumannii PM-141 MBL-ujemny Acinetobacter baumannii PM-142 MBL-dodatni Pseudomonas aeruginosa PM-143 MBL-ujemny Pseudomonas aeruginosa PM-144 MBL-dodatni Pseudomonas putida PM-145 MBL-dodatni POLMICRO 2008/SSE I tura Salmonella enterica ser. Typhimurium PM-134 ESBL-ujemny Shigella boydii PM-135 Yersinia kristensenii PM-136 ESBL-ujemny II tura Salmonella enterica ser. Enteritidis PM-139 ESBL-dodatni Morganella morgannii PM-140 ESBL-ujemny Legenda: MSSE Staphylococcus epidermidis meticylinowrażliwy (ang. methicillin-sensitive S. epidermidis), MRSE Staphylococcus epidermidis meticylinooporny (ang. methicillin-resistant S. epidermidis), MSSL Staphylococcus lugdunensis meticylinowrażliwy (ang. methicillin-sensitive S. lugdunensis), MLS B oprność typu indukcyjnego na makrolity, streptograminy i linkozamidy), MBL metalo-β-laktamaza, ESBL β-laktamza o rozszerzonym spektrum substratowym (ang. extendend spectrum β-lactamase). 28

E. Stefaniuk i inni liwości oparta była na wcześniej ustalonych kryteriach, które zostaną omówione poniżej. Zastosowana kwalifikacja błędów oparta jest na zaleceniach Centers for Disease Control and Prevention (CDC) w Atlancie. Błędy oznaczania lekowrażliwości dzielimy na trzy kategorie: małe błędy, duże błędy i bardzo duże błędy. Małe błędy polegają na zaliczeniu szczepu średniowrażliwego jako wrażliwy lub oporny, do tego rodzaju błędów zaliczamy też uznanie szczepu wrażliwego lub opornego za średniowrażliwy. Błędy duże polegają na podaniu, że szczep wrażliwy jest oporny. Najpoważniejszy rodzaj stanowią bardzo duże błędy, czyli uznanie szczepu opornego za wrażliwy. Laboratorium powinno położyć szczególny nacisk na eliminację bardzo dużych i dużych błędów. Oprócz zwyczajowej oceny poprawności otrzymanych przez każde z laboratoriów wyników, w ramach I tury POLMICRO 2008 przeprowadzono analizę powtarzalności zgodnie z zaleceniami WHO CDC, wg których dopuszczalne jest uzyskanie w podwójnym oznaczeniu strefy zahamowania wzrostu różnicy maksymalnie ±3 mm, w wartości MIC różnicy nie większej niż ±1 podwójne rozcieńczenie, pod warunkiem utrzymania kategorii wrażliwości. W wypełnianej przez laboratoria ankiecie znajdowały się też pytania na temat metodyki stosowanej wykonywanych w trakcie badania próbek testowych. Wyniki i omówienie SPRAWDZIAN POLMICRO 2008 (edycja ogólna) I tura W I turze POLMICRO 2008 (edycja ogólna) każde laboratorium otrzymało do oznaczenia zestaw trzech izolatów bakteryjnych spośród przedstawionych w tabeli I, z zaznaczeniem, że wszystkie laboratoria otrzymały szczep Staphylococcus lugdunensis PM-135, zaś drugi i trzeci szczep w każdym zestawie był tym samym szczepem Staphylococcus epidermidis. Do tej tury sprawdzianu przystąpiło 467 laboratoriów mikrobiologicznych. Negatywny wynik końcowy niniejszej edycji przyznano 17 laboratoriom, co stanowiło 3,6% ogółu laboratoriów przystępujących do sprawdzianu. Błędy dotyczyły głównie identyfikacji gatunkowej przesłanych izolatów. Wyniki w dużej mierze zależały od stosowanych w laboratoriach testów identyfikacyjnych, jednakże, ze względu na trudną identyfikację gronkowców koagulazo-ujemnych, za zdecydowanie złe odpowiedzi uznawano rozbieżne identyfikacje szczepów S. epidermidis przesłanych do każdego laboratorium w postaci dwóch oddzielnych prób oraz identyfikacje do poziomu gronkowiec koagulazo-ujemny. Wiele laboratoriów miało trudności w oznaczeniu produkcji β-laktamaz, co w przypadku badanych izolatów stanowiło problem złożony: trudności techniczne, ale także specyfika przesłanych do badania szczepów bakteryjnych. Wyniki oznaczeń nie były brane pod uwagę w końcowej ocenie, natomiast powinny stanowić podstawę do przeanalizowania sposobu postępowania w laboratorium. Penicylina powinna być stosowana do oznaczania wrażliwości wszystkich gatunków gronkowców na wszystkie penicylinazo-wrażliwe penicyliny (ampicylinę, amoksycylinę, piperacylinę, azlocylinę, mezlocylinę). MIC penicyliny 0,03 µg/ml zazwyczaj oznacza brak produkcji β-laktamazy. MIC penicyliny 0,25 µg/ml traktujemy jako oporność. Gronkowce o MIC pomiędzy 0,06 µg/ml do 0,12 µg/ml mogą, ale nie muszą wytwarzać β-laktamazy. W tym przypadku wynik testu cefinazowego określa oporność na β-laktamy (amoksycylinę, piperacylinę, azlocylinę, mezlocylinę). W przypadku gronkowców koagulazo-ujemnych odczyt testu cefinazowego może nastąpić nawet po upływie 1 godz. (chyba, że producent zaleci inaczej); należy pamiętać o pobraniu dużej ilości materiału oraz o utrzymaniu w odpowiednich warunkach wilgotności krążka podczas całego czasu trwania testu. W przypadku szczepu S. lugdunensis PM-135 do oznaczenia oporności na meticylinę zalecany jest krążek z cefoksytyną (zgodnie z Rekomendacjami KORLD/COBJDM i CLSI). Spośród 467 laboratoriów 443 (94,9%) zastosowały krążek z cefoksytyną. Wynik ten wskazywał na fakt, że zdecydowana większość laboratoriów, stosując się do powyższych Rekomendacji, wprowadziła zmiany w swoich procedurach badawczych polegające na rutynowym stosowaniu krążka z cefoksytyną do oznaczania oporności gronkowców na meticylinę. W przypadku szczepów meticylinoopornych nie ma potrzeby oznaczania MIC dla penicyliny ani wykonywania testu cefinazowego, ponieważ szczepy takie są z założenia klinicznie oporne na wszystkie antybiotyki β-laktamowe wraz z inhibitorami β-laktamaz. W przypadku oznaczania wrażliwości na glikopeptydy przeważająca liczba laboratoriów stosowała metodę dyfuzji antybiotyku z krążka tylko 132 (28,2%) oznaczyły MIC wankomycyny, pozostałe zastosowały krążek z wankomycyną 30μg. Jeszcze gorzej przedstawiała się sytuacja w przypadku oznaczania wrażliwości na teikoplaninę. Należy pamiętać, że gronkowce szybciej i łatwiej nabywają oporność na teikoplaninę. Zgodnie z zaleceniami, w przypadku gronkowców koagulazo-ujemnych oznaczanie wrażliwości na antybiotyki glikopeptydowe (wankomycynę i teikoplaninę) powinno odbywać się z zastosowaniem metod rozcieńczeniowych lub E-testu, a nie metody dyfuzji antybiotyku z krążka (tab. II). W przypadku, kiedy wartość MIC wskazuje na wrażliwość izolatu na glikopeptydy, a pacjent nie odpowiada na terapię glikopeptydami, szczep należy przesłać do laboratorium referencyjnego w celu weryfikacji fenotypu oporności. Dla przypomnienia, szczepy Staphylococcus haemolyticus wykazują naturalną oporność na teikoplaninę, na co nie zwróciły uwagi laboratoria, które szczepy badane, głównie S. lugdunensis, Tabela II. Interpretacja wartości MIC glikopeptydów dla gronkowców koagulazo-ujemnych. Antybiotyk Wartości MIC (µg/ml) wrażliwy średniowrażliwy oporny Wankomycyna 4 8-16 32 Teikoplanina 8 16 32 29

Ogólnopolski Sprawdzian Wiarygodności Badań Mikrobiologicznych POLMICRO 2008 zidentyfikowały jako S. haemolyticus (wyniki lekowrażliwości nie korelowały z wynikiem identyfikacji). W przypadku znacznej grupy laboratoriów (ok. 20%) wyraźnie widoczny był brak powtarzalności głównie wielkości stref zahamowania wzrostu w metodzie dyfuzyjno-krążkowej, ale też, choć w mniejszym stopniu, wartości MIC dla szczepu S. epidermidis. Najwięcej wyników niepowtarzalnych dotyczyło oznaczenia wrażliwości na oksacylinę (29 6,2%) i cefoksytynę (36 7,7%), erytromycynę (18 3,9%), kwas fusidowy (34 7,3%), gentamicynę (22 4,7%), klindamycynę (21 4,5%), linezolid (25 5,4%), rifampicynę (16 3,4%), trimetoprim/sulfametoksazol i tetracyklinę (po 15 3,2% laboratoriów). Odchylenie standardowe wielkości strefy zahamowania wzrostu dla poszczególnych antybiotyków przedstawia tabela III. Dla szczepów S. epidermidis PM-130 i S. epidermidis PM- 131 największa różnica między medianą a wartością referencyjną była dla rifampicyny i wynosiła odpowiednio 9 mm i 6 mm. Dla szczepu S. epidermidis PM-132 największa różnica między medianą a wielkością referencyjną była dla cefoksytyny i wynosiła 10 mm. Wprawdzie rozbieżne wartości nie pociągały w większości przypadków zmiany kategorii wrażliwości, niemniej fakt ten powinien zostać przez laboratoria przeanalizowany. Dwa laboratoria nieprawidłowo wykryły mechanizm oporności na meticylinę, co wyraźnie spowodowane zostało zaniżeniem wielkości strefy przy cefoksytynie, jak i oksacylinie, we wszystkich badanych izolatach. Laboratoria te w ramach prowadzonych działań naprawczych powinny upewnić się odnośnie do jakości zastosowanych krążków, gęstości zawiesiny, sposobu pomiaru wielkości stref itd. II tura Po raz kolejny na przestrzeni kilku lat, kiedy wśród bada- Tabela III. Odchylenie standardowe wielkości strefy zahamowania wzrostu (mm) wokół krążków antybiogramowych antybiotyków dla izolatów I tury POLMICRO 2008. Antybiotyk epidermidis PM-130 epidermidis PM-131 Staphylococcus Staphylococcus Staphylococcus epidermidis PM-132 Ciprofloksacyna 2,70 2,22 2,47 Cefoksytyna 3,36 2,83 3,59 Erytromycyna 3,35 2,60 1,58 Kwas fusidowy 3,36 3,25 5,10 Gentamicyna 3,48 2,45 2,57 Klindamycyna 3,06 2,74 4,44 Linezolid 3,12 2,98 2,91 Oksacylina 2,84 2,96 3,05 Teikoplanina 2,17 1,78 1,87 Rifampicyna 2,94 2,66 2,20 Trimetoprim/ sulfametoksazol 2,98 2,66 2,62 Tetracyklina 3,19 2,10 2,51 Wankomycyna 1,88 1,56 1,57 nych izolatów znajdowały się drobnoustroje wymagające, wielu laboratoriom nie udało się ożywić przesłanych do nich szczepów bakteryjnych. W II turze POLMICRO 2008 uczestniczyły 474 laboratoria, z czego aż 171 laboratoriów nie odesłało wyników. Tylko osiemdziesiąt dwa laboratoria (17,3% ogółu) prawidłowo zidentyfikowały obydwa przesłane do badania szczepy bakteryjne. W przypadku szczepu Streptococcus oralis za prawidłową uznano również identyfikację (Streptococcus oralis/mitis czy też Streptococcus mitis). Prawidłową identyfikację szczepu S. pneumoniae podały 234 (49,4%) laboratoria, szczepu S. oralis: 66 S. oralis, 32 S. mitis (łącznie 20,7%). Niestety, aż 177 (37,3%) laboratoriów szczep S. oralis zidentyfikowało jako S. pneumoniae, co świadczy o nieprawidłowo prowadzonej diagnostyce (brak wykonania testu rozpuszczalności w solach żółci). III tura Do III tury sprawdzianu POLMICRO 2008 (edycja ogólna) przystąpiły 472 laboratoria mikrobiologiczne, a 430 uczestników nadesłało ankiety z wynikami w wyznaczonym terminie. Pozostałe laboratoria 42 (8,9%) nie zdążyły odesłać wyników na czas. Zgodnie z zasadami sprawdzianu wyniki przesłane po terminie nie były klasyfikowane dla zachowania uczciwości względem wszystkich pozostałych uczestników. Negatywny wynik końcowy niniejszej edycji przyznano 96 laboratoriom, co stanowiło 22,3% ogółu laboratoriów przystępujących do sprawdzianu. Identyfikacja pałeczek rodzaju Acinetobacter przysporzyła laboratoriom najwięcej problemów. Największe rozbieżności dotyczyły szczepu Acinetobacter baumannii PM-142. Rodzaj Acinetobacter liczy ponad dwadzieścia genogatunków, z których tylko połowa ma rangę gatunków. Metodami fenotypowymi stosowanymi rutynowo w laboratoriach, dla jednego szczepu, można uzyskać wiele różnych określeń. Metodami referencyjnymi identyfikacji Acinetobacter są metody biologii molekularnej, dlatego też za prawidłową uznano identyfikację do rodzaju Acinetobacter. Błędy dotyczyły głównie identyfikacji gatunkowej szczepów Acinetobacter baumannii PM-142 i Pseudomonas putida PM- 145. Izolat A. baumannii PM-142 otrzymało 287 laboratoriów i tylko 149 (52%) podało poprawną identyfikację do gatunku. Siedemdziesiąt dziewięć laboratoriów (27,6%) określiło szczep jako A. lwoffii, 48 (16,7%) laboratoriów określiło szczep jako inny niż wymienione w tym 22 jako Acinetobacter junii/johnsonii, 20 Acinetobacter junii, 4 jako Acinetobacter johnsonii, 2 jako Acinetobacter calcoaceticus oraz 1 jako Acinetobacter haemolyticus. Trzy laboratoria oznaczyły szczep PM-142 tylko do rodzaju, a 2 określiły szczep jako Alcaligenes faecalis i jedno jako Alcaligenes spp. Pojedyncze laboratoria oznaczyły szczep jako Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas oryzihabitans, Pseudomonas mendocina/ stutzeri oraz Stenotrophomonas maltophilia. Szczep Pseudomonas putida PM-145 otrzymało 143 uczestników programu, poprawną identyfikację uzyskało 127 (88,8%) laboratoriów. Po trzy laboratoria oznaczyły szczep jako Pseudomonas aeruginosa i Pseudomonas fluorescens. 30

E. Stefaniuk i inni Dwa laboratoria określiły szczep jako Acinetobacter baumannii oraz pojedyncze jako Pseudomonas fluorescens/putida, P. pseudoalcaligenes, Stenotrophomonas maltophilia, Burkholderia cepacia, Flavimonas oryzihabitans i Ralstonia pickettii. Identyfikacja pozostałych szczepów nie sprawiła laboratoriom większych trudności, szczep A. baumanii PM-141 oraz szczepy Pseudomonas aeruginosa PM-143 i PM-144 poprawnie zidentyfikowało odpowiednio (424) 98,6%, (427) 99,3% i (429) 99,7% laboratoriów. Najwięcej błędów w oznaczaniu wytwarzania metalo-βlaktamaz (MBL) przysporzył szczep Pseudomonas aeruginosa PM-143 9,3% uczestników oznaczyło szczep jako wytwarzający metalo-β-laktamazy MBL dodatni. Prawie 7% laboratoriów A. baumannii PM-142 i 5,5% laboratoriów szczep Ps. aeruginosa PM-144 określiło jako MBL-ujemny. Ponad 5% uczestników nie wykonało tego oznaczenia dla szczepu A. baumannii PM-141, a dwa laboratoria oznaczyły ten szczep jako MBL-dodatni. Fenotypowo szczep ten wykazuje wrażliwość na wszystkie antybiotyki i chemioterapeutyki zawarte w ankiecie z wyjątkiem gentamicyny. W takiej sytuacji laboratorium nie ma obowiązku wykrywać mechanizmu MBL. W ramach sprawdzianu każde z uczestniczących w POLMICRO laboratoriów otrzymało 1ml EDTA (możliwość wykonania ok. 100 testów), co jest ewenementem, gdyż żaden inny organizator programów kontroli międzylaboratoryjnej nie dostarcza uczestnikom odczynników/testów niezbędnych do wykonania badań. Niemniej jednak, aż w 41 przypadkach zanotowano brak oznaczenia wytwarzania metalo-β-laktamaz. EDTA jest inhibitorem MBL, w związku z czym, o produkcji tych enzymów świadczy pojawienie się i wyraźne powiększenie strefy wokół krążka z ceftazydymem i/lub imipenemem od strony krążka zawierającego inhibitor. MBL są β-laktamazami o aktywności karbapenemaz, zaliczane są w systemach klasyfikacyjnych laktamaz do klasy B, wykorzystują jony Zn2+ w reakcji hydrolizy β-laktamów. Szczepy wytwarzające β-laktamazy typu MBL, ze względu na współwystępowanie innych mechanizmów, często są oporne na wszystkie β-laktamy szczególnie widoczne jest to w przypadku szczepów P. aeruginosa. Analiza uzyskanych wyników wykazała, że 119 laboratoriów dla szczepu A. baumannii PM-142 po wykryciu MBL zmieniło interpretację kliniczną dla ampicyliny z sulbaktamem (szczep wrażliwy, strefa 22 mm i MIC 4µg/ml) oraz dla cefepimu (szczep wrażliwy, strefa 22 mm i MIC 8µg/ml). Nie istnieją rekomendacje zalecające zmianę interpretacji innych niż karbapenemy leków β-laktamowych w obecności mechanizmu MBL (tak jak jest w przypadku mechanizmu ESBL), dlatego też zmiany takiej nie należało wykonywać. Obowiązuje zamieszczenie interpretacji zgodnej z uzyskaną strefą i/lub wartością MIC. Laboratoria jednakże powinny zachować czujność i powinny poddawać oznaczaniu w kierunku MBL szczepy P. aeruginosa oporne lub o obniżonej wrażliwości na karbapenemy i wysoce oporne na tikarcylinę i tikarcylinę z kwasem klawulanowym, szczepy Acinetobacter spp. i inne Pseudomonas spp. o obniżonej wrażliwości na karbapenemy. Najwięcej bardzo dużych błędów (VME) odnotowano dla tikarcyliny i tikarcyliny z kwasem klawulanowym u P. aeruginosa PM-143; Pięćdziesiąt trzy (12,3%) laboratoria (n=430) określiły szczep jako wrażliwy na tikarcylinę z klawulanianem, a trzydzieści dziewięć (9%) na tikarcylinę. Jak podano wcześniej bardzo duży błąd oznacza określenie szczepu opornego jako wrażliwy na dany antybiotyk/chemioterapeutyk, w wyniku takiego błędu w rutynowej pracy laboratorium lek może zostać włączony do terapii. Należy bardzo poważnie potraktować pojawienie się bardzo dużego błędu, laboratorium powinno zastanowić się nad kontrolą jakości wykonywanych rutynowo oznaczeń lekowrażliwości. Wystąpienie VME jest najpoważniejszym błędem i za taki błąd przyznawana jest ocena negatywna w sprawdzianie. Pozostałe błędy w oznaczaniu lekowrażliwości dotyczyły głównie cefepimu (szczepy A. baumannii PM-141 oraz P. aeruginosa PM-143) obydwa szczepy były średniowrażliwe: strefa 16 mm i MIC =16µg/ml, gentamicyny (szczep A. baumannii PM-141) i aztreonamu (P. aeruginosa PM-144). Szczep A. baumannii PM-141 wykazywał dla gentamicyny strefę 14 mm średniowrażliwy i MIC 8µg/ml oporny. P. aeruginosa PM-144 wykazywał dla aztreonamu strefę 16 mm średniowrażliwy i MIC 32µg/ml oporny. Ze względu na fakt, że metoda pozwalająca wykryć MIC jest metodą referencyjną w przypadku takich rozbieżności, w szczególności dla pałeczek niefermentujących, jako właściwy wynik należało uznać wartość MIC i odpowiednią dla niej interpretację. Mając na uwadze fakt, iż nie wszystkie laboratoria mają możliwość oznaczania wartości MIC, za poprawną uznawano zarówno interpretację uzyskaną metodą dyfuzyjno-krążkową, jak i rozcieńczeniową. Wykresy 1-9 obrazują rozrzuty stref zahamowania wzrostu dla wybranych antybiotyków i dla wybranych izolatów uzyskanych przez uczestniczące w sprawdzianie laboratoria. SPRAWDZIAN POLMICRO 2008/SSE (edycja dla laboratoriów Państwowej Inspekcji Sanitarnej) I tura/sse Do I tury sprawdzianu POLMICRO 2008/SSE przystąpiły 54 laboratoria mikrobiologiczne stacji sanitarno-epidemiologicznych. Spośród czterech laboratoriów, które otrzymały jeden izolat bakteryjny Salmonella enterica ser. Typhimurium, dwa poddały kontroli samą identyfikację. Dwa izolaty bakteryjne: Salmonella enterica ser. Typhimurium i Shigella boydii otrzymało 12 laboratoriów mikrobiologicznych stacji sanitarno-epidemiologicznych, a siedem z nich poddało kontroli wyłącznie identyfikację obu izolatów. Trzydzieści osiem laboratoriów poddało się kontroli trzema wymienionymi w tabeli I szczepami. Negatywny wynik końcowy niniejszej edycji przyznano tylko jednemu laboratorium, które niepoprawnie zidentyfikowało dwa szczepy. Zamiast Shigella boydii określono Serratia marcescens, zamiast Yersinia kristensenii laboratorium podało wynik inny niż wymienione, 31

Ogólnopolski Sprawdzian Wiarygodności Badań Mikrobiologicznych POLMICRO 2008 Wykresy 1-9. Rozrzuty stref zahamowania wzrostu (mm) dla wybranych antybiotyków i dla wybranych izolatów uzyskane przez uczestniczące w sprawdzianie laboratoria. Legenda: W wykresach 1-9 strzałką oznaczono wartości referencyjne. Aba Acinetobacter baumannii; Pae Pseudomonas aeruginosa. Pionowe kreski obrazują punkty odcięcia tzw. beakpoints, będące podstawą kategorii wrażliwości. O oporny, Ś średniowrażliwy, W wrażliwy. 32

E. Stefaniuk i inni bez żadnych dodatkowych informacji. Pozostałym laboratoriom identyfikacja nie sprawiła problemu. Natomiast wiele laboratoriów miało trudności w oznaczeniu gatunku szczepu Yersinia kristensenii. Odpowiedzi przesłane do Centralnego Ośrodka to: Y. krisensenii 23 laboratoria, Y. enterocolitica 11, Yersinia spp. 3 i jedna odpowiedź gatunek inny niż wymienione w liście gatunków zamieszczonej w ankiecie. Do rodzaju Yersinia zaliczamy obecnie 12 gatunków: Y. pestis, Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica, Y. fredreksenii, Y. intermedia, Y. kristensenii, Y. bercovieri, Y. mollaterii, Y. rohdel, Y. ruckeri, Y. aldovae i sklasyfikowany w 2005 roku Y. aleksiciae. Rodzaj Yersinia został wyodrębniony w ramach rodziny Enterobacteriaceae w 1964 roku i liczył trzy gatunki: Y. pestis, Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica, wcześniej klasyfikowane do rodzaju Pasteurella. Zmiany w taksonomii spowodowane zostały wprowadzeniem do identyfikacji metod taksonomii numerycznej oraz metod molekularnych. W stosunku do dziewięciu gatunków: Y. fredreksenii, Y. kristensenii, Y. bercovieri, Y. mollaterii, Y. rohdel, Y. ruckeri, Y. aldovae, Y. intermedia i Y. aleksiciae używa się określenia podobne do Y. enterocolitica, czyli Y. enterocolitica-like. Większość z tych gatunków wcześniej należała do biotypów Y. enterocolitica. Gatunki te opisuje się czasami jako niepatogenne, gdyż pozbawione są czynników wirulencji charakterystycznych dla wysoce zjadliwych szczepów Yersinia. Pałeczki Yersinia są wewnątrzkomórkowymi pasożytami, których chorobotwórczość związana jest z właściwościami inwazyjnymi, zdolnością do rozmnażania się w organizmie gospodarza oraz wytwarzaniem toksyn. Y. enterocolitica-like są patogenne dla ssaków, ptaków, gadów, płazów i ryb oraz szeroko rozpowszechnione w środowisku naturalnym. Jednakże istnieją doniesienia o wywoływaniu przez te szczepy u ludzi biegunek i innych objawów chorobowych, za które odpowiadają odmienne czynniki zjadliwości. Ponieważ gatunki te występują u zwierząt, istnieje możliwość zakażeń odzwierzęcych. Nie można również wykluczyć możliwości przeniesienia szczepu z człowieka na człowieka. Diagnostyka mikrobiologiczna pałeczek z rodzaju Yersinia wymaga zastosowania odpowiednich warunków temperaturowych, podłoży bakteriologicznych, surowic, testów serologicznych itp. Wyniki w dużej mierze zależały od stosowanych w laboratoriach testów identyfikacyjnych i tak, jak to ma miejsce w szerokospektralnej diagnostyce mikrobiologicznej (nie tylko diagnostyka schorzeń przewodu pokarmowego) być może zaistnieje konieczność poszerzenia możliwości diagnostycznych o nowe czynniki etiologiczne zakażeń. Ze względu na edukacyjny charakter programu POLMICRO poprawna identyfikacja wyłącznie do rodzaju Yersinia, nie wpływała na końcową ocenę I tury. Oznaczenie lekowrażliwości przesłanych szczepów nie przysporzyło uczestnikom większych trudności, mimo że laboratoria wykonujące wyłącznie diagnostykę zakażeń przewodu pokarmowego rzadko wykonują testy wrażliwości. II tura/sse Do sprawdzianu przystąpiło 55 laboratoriów mikrobiologicznych stacji sanitarno-epidemiologicznych. Poprawną identyfikację szczepów wykonały wszystkie laboratoria, przy czym jedenaście laboratoriów poddało kontroli wyłącznie identyfikację. W oznaczaniu lekowrażliwości jedynie dla szczepu Morganella morgannii jedno laboratorium zrobiło 2 małe błędy dla ampicyliny i 1 mały błąd dla ceftriaksonu. Podsumowanie Wyniki badań międzylaboratoryjnych odzwierciedlają słabe strony kontroli wewnętrznej w medycznych laboratoriach mikrobiologicznych. Wykazany brak powtarzalności w wynikach I tury POLMICRO 2008 powinien nakłonić laboratoria do analizy poprawności stosowanych procedur diagnostycznych, jakości stosowanych krążków antybiogramowych, gęstości zawiesiny, sposobu pomiaru wielkości stref, umiejętności odczytu wartości MIC itd. Tabele IV i V przedstawiają końcowe zestawienie liczby laboratoriów, które w roku 2008 wzięły udział w ogólnej edycji programu POLMICRO oraz edycji dla laboratoriów PIS i liczby laboratoriów, których odpowiedzi uznano za pozytywne. Świadectwa uczestnictwa i uzyskania bardzo dobrych wyników w Zewnątrzlaboratoryjnym Ogólnopolskim Sprawdzianie Wiarygodności Badań w Mikrobiologii POLMICRO 2008 Tabela IV. Zestawienie laboratoriów uczestniczących w edycji ogólnej POLMICRO 2008. Tura sprawdzianu POLMICRO 2008 (edycja ogólna) które otrzymały badane izolaty które odesłały odpowiedzi Liczba i % laboratoriów, które uzyskały ocenę pozytywną I tura 476 467 450-96,4 % II tura 474 304 82-27,0 % III tura 472 430 334-77,7 % Tabela V. Zestawienie laboratoriów uczestniczących w edycji ogólnej POLMICRO 2008/SSE. Tura sprawdzianu POLMICRO 2008/SSE które otrzymały badane izolaty które odesłały odpowiedzi które uzyskały ocenę pozytywną I tura 54 54 53 II tura 55 55 54 33

Ogólnopolski Sprawdzian Wiarygodności Badań Mikrobiologicznych POLMICRO 2008 (edycja ogólna) otrzymały 343 laboratoria (73%) i były to tylko te laboratoria, które uzyskały dobre wyniki co najmniej w dwóch turach sprawdzianu POLMICRO 2008. Świadectwa uczestnictwa i uzyskania bardzo dobrych wyników w Programie POLMICRO dla laboratoriów Państwowej Inspekcji Sanitarnej w 2008 roku otrzymały 52 laboratoria i były to tylko te laboratoria, które uzyskały dobre wyniki w dwóch turach sprawdzianu POLMICRO 2008/SSE. Z wieloletniej obserwacji wyników uzyskiwanych przez laboratoria mikrobiologiczne w Ogólnopolskim Sprawdzianie Wiarygodności Badań w Mikrobiologii POLMICRO wynika, że systematyczne poddawanie się laboratoriów zewnętrznej kontroli jakości znajduje odbicie w poprawie jakości diagnostyki w tych laboratoriach, co z kolei potwierdza edukacyjną rolę sprawdzianów organizowanych przez Centralny Ośrodek Badań Jakości w Diagnostyce Mikrobiologicznej. Piśmiennictwo 1. Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; Eighteenth informational supplement: M100-S18. CLSI, Villanova PA. 2008. 2. Hryniewicz W, Sulikowska A, Szczypa K i wsp. M. Rekomendacje doboru testów do oznaczania wrażliwości bakterii na antybiotyki i chemioterapeutyki 2006. Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego 2006. 3. Hryniewicz W, Gniadkowski M, Łuczak-Kadłubowska A i wsp. Zmiany do tekstu: Rekomendacje doboru testów do oznaczania wrażliwości bakterii na antybiotyki i chemioterapeutyki 2006 wprowadzone w roku 2008. Narodowy Instytut Leków 2008. 4. Clinical and Laboratory Standards Institute. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically; Approved standard Seventh Edition: M7-A7. CLSI, Villanova, PA. 2006. 5. Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests; Approved Standard Ninth Edition M2-A9. CLSI, Villanova, PA. 2006. Adres Autorów: Centralny Ośrodek Badań Jakości w Diagnostyce Mikrobiologicznej ul. Chełmska 30/34, 00-725 Warszawa, tel. (022) 841 58 34, faks: (022) 841 29 49 e-mail: polmicro@cls.edu.pl (Praca wpłynęła do Redakcji: 2009-04-15) (Praca przekazana do opublikowania: 2009-04-27) 34