RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (21) Numer zgłoszenia: 310126 (22) Data zgłoszenia: 26.01.1994 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: 26.01.1994,PCT/US94/00951 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: 18.08.1994,WO94/18311, PCT Gazette nr 19/94 (11) 178609 (13) B1 (51) IntCl6: C12N 7/02 C 12N 5/00 A61K 39/12 Izolat wirusa zespołu reprodukcyjnego i oddechowego świń,zwanego PRRSV, (54) sposób namnażania izolatu PRRSV, klon linii komórkowe], hodowla tkankowa zawierająca izolat PRRSV, szczepionka efektywna w ochronie świń przeciw PRRSV, oraz sposób wytwarzania szczepionki efektywnej w ochronie świń przeciw PRRSV (30) Pierwszeństwo: 08.02.1993,US,08/014915 (43) Zgłoszenie ogłoszono: 27.11.1995 BUP 24/95 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 31.05.2000 WUP 05/00 (73) Uprawniony z patentu: BAYER CORPORATION, Pittsburgh, US IOWA STATE UNIVERSITY RESEARCH FOUNDATION INC., Ames, US (72) Twórcy wynalazku: Thomas Sanderson, Skokie, US Michael J. McGinley, Lenexa, US Jeffrey J. Zimmerman, Ames, US Howard T. Hill, Cambridge, US Michael C. Meetz, Nevada, US Eugene C. Pirtle, Ames, US Sabrina L. Swenson, Madrid, US George P. Shibley, Leawood, US (74) Pełnomocnik: Jakobsche Agnieszka, PATPOL Spółka z o.o. PL 178609 B1 (57) 1. Izolat wirusa zespołu reprodukcyjnego i oddechowego świń, zwanego PRRSV, oznaczony jako ISU-P i zdeponowany pod numerem depozytu ATCC VR 2402. 2. Klon linii komórkowej oznaczony jako 9009B i zdeponowany pod numerem depozytu ATCC CRL 11302. 3. Sposób namnażania izolatu wirusa zespołu reprodukcyjnego i oddechowego świń, zwanego PRRSV, oznaczonego jako ISU-P i zdeponowanego pod numerem depozytu ATCC VR 2402 w hodowli tkankowej wrażliwej na zakażenie i replikującej wirus do ilości wystarczającej dla ochrony zwierząt przeciw PRRSV, albo do użycia w diagnostyce PRRSV, lub identyfikacji molekularnej struktury PRRSV celem wytworzenia produktów rekombinacji, znamienny tym, że inokuluje się hodowlę tkankową wirusem i zbiera namnożony wirus. 7. Hodowla tkankowa zawierająca izolat wirusa zespołu reprodukcyjnego i oddechowego świń, zwanego PRRSV, oznaczony jako ISU-P i zdeponowany pod numerem depozytu ATCC VR 2402. 9. Sposób wytwarzania szczepionki efektywnej w ochronie świń przeciw PRRSV, znamienny tym, że dostarcza się izolat wirusa zespołu reprodukcyjnego i oddechowego świń, zwanego PRRSV, oznaczony jako ISU-P i zdeponowany pod numerem depozytu ATCC VR 2402, uwalnia się wirus z hodowli tkankowej, oraz dostosowuje się masę antygenową przez rozcieńczenie, zatężenie lub ekstrakcję dla wytworzenia immunologicznie efektywnej ilości masy antygenowej, przeznaczonej do żywego zmodyfikowanego (autenuowanego), inaktywowanego, podjednostkowego lub rekombinantowego preparatu. 12. Szczepionka ewentualnie zawierająca czynniki inaktywujące, adiuwanty i/lub konserwanty, znamienna tym, że zawiera izolat wirusa zespołu reprodukcyjnego i oddechowego świń, zwanego PRRSV, oznaczony jako ISU-P i zdeponowany pod numerem depozytu ATCC VR 2402.
Izolat wirusa zespołu reprodukcyjnego i oddechowego świń, zwanego PRRSV, sposób namnażania izolatu PRRSV, klon linii komórkowej, hodowla tkankowa zawierająca izolat PRRSV, szczepionka efektywna w ochronie świń przeciw PRRSV, oraz sposób wytwarzania szczepionki efektywnej w ochronie świń przeciw PRRSV Zastrzeżenia patentowe 1. Izolat wirusa zespołu reprodukcyjnego i oddechowego świń, zwanego PRRSV, oznaczony jako ISU-P i zdeponowany pod numerem depozytu ATCC VR 2402. 2. Klon linii komórkowej oznaczony jako 9009B i zdeponowany pod numerem depozytu ATCC CRL 11302. 3. Sposób namnażania izolatu wirusa zespołu reprodukcyjnego i oddechowego świń, zwanego PRRSV, oznaczonego jako ISU-P i zdeponowanego pod numerem depozytu ATCC VR 2402 w hodowli tkankowej wrażliwej na zakażenie i replikującej wirus do ilości wystarczającej dla ochrony zwierząt przeciw PRRSV, albo do użycia w diagnostyce PRRSV, lub identyfikacji molekularnej struktury PRRSV celem wytworzenia produktów rekombinacji, znamienny tym, że inokuluje się hodowlę tkankową wirusem i zbiera namnożony wirus. 4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że jako hodowlę tkankową stosuje się linię komórkową. 5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że jako hodowlę tkankową stosuje się linię komórkową z nerki zielonej małpy afrykańskiej. 6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że jako linię komórkową stosuje się klon linii komórkowej z zielonej małpy afrykańskiej oznaczony jako 9009B i zdeponowany pod numerem depozytu ATCC CRL 11302. 7. Hodowla tkankowa zawierająca izolat wirusa zespołu reprodukcyjnego i oddechowego świń, zwanego PRRSV, oznaczony jako ISU-P i zdeponowany pod numerem depozytu ATCC VR 2402. 8. Hodowla według zastrz. 7, znamienna tym, że jest wytworzona na skalę handlową >25 l przy mianie FAID50> 105,0/ml. 9. Sposób wytwarzania szczepionki efektywnej w ochronie świń przeciw PRRSV, znamienny tym, że dostarcza się izolat wirusa zespołu reprodukcyjnego i oddechowego świń, zwanego PRRSV, oznaczony jako ISU-P i zdeponowany pod numerem depozytu ATCC VR 2402, uwalnia się wirus z hodowli tkankowej, oraz dostosowuje się masę antygenową przez rozcieńczenie, zatężenie lub ekstrakcję dla wytworzenia immunologicznie efektywnej ilości masy antygenowej, przeznaczonej do żywego zmodyfikowanego (autenuowanego), inaktywowanego, podjednostkowego lub rekombinantowego preparatu. 10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że jako hodowlę tkankową stosuje się linię komórkową z nerki zielonej małpy afrykańskiej. 11. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że jako linię komórek z nerki zielonej małpy afrykańskiej stosuje się klon linii komórkowej oznaczony jako 9009B i zdeponowany pod numerem depozytu ATCC CRL 11302. 12. Szczepionka ewentualnie zawierająca czynniki inaktywujące, adiuwanty i/lub konserwanty, znamienna tym, że zawiera izolat wirusa zespołu reprodukcyjnego i oddechowego świń, zwanego PRRSV, oznaczony jako ISU-P i zdeponowany pod numerem depozytu ATCC VR 2402. 13. Szczepionka według zastrz. 12, znamienna tym, że zawiera żywy, zmodyfikowany (atenuowany) PRRSY i ma postać płynną, zamrożoną albo liofilizowaną.
178 609 3 14. Szczepionka według zastrz. 13, znamienna tym, że zawiera adiuwant na bazie oleju lub wody taki jak Diamond Scientific Adiuwant B lub carbopol. 15. Szczepionka według zastrz. 14, znamienna tym, że adiuwant jest wybrany z grupy obejmującej adiuwant kompletny Freunda i adiuwant niekompletny Freunda. 16. Szczepionka według zastrz, 14, znamienna tym, że jako czynnik inaktywujący zawiera binarną etylenoiminę, betapropiolakton albo formalinę. * * * Obecny wynalazek dotyczy izolatu wirusa zespołu reprodukcyjnego i oddechowego świń (PRRSV - porcine reproductive and respiratory syndrome virus). Dokładniej, wynalazek dotyczy antygenów diagnostycznych i ochronnych oraz szczepionki przeciw chorobie reprodukcyjnej i oddechowej świń, a także sposobów ich wytwarzania i stosowania. Krótki opis stanu techniki: zespół reprodukcyjny i oddechowy świń gwałtownie narasta jako problem chorobowy ekonomicznie rujnujący hodowców świń w USA i w Europie. Zespół opisano po raz pierwszy w USA w roku 1987, podobne opisy pojawiły się dwa - trzy lata później z terenu Europy i Kanady. Zespół chorobowy określano różnymi nazwami, jak tajemnicza choroba świń, abortus blau (poronienie płodu niebieskiego), choroba niebieskich uszu świń, epidemiczny zespół poronieniowy i oddechowy świń (PEARS - porcine epidemic abortion and respiratory syndrome), zespół niepłodności i oddechowy świń (SIRS - swine infertility and respiratory syndrome). W tekście poniżej używa się nazwy zespół reprodukcyjny i oddechowy świń (PRRS - porcine reproductive and respiratory syndrome). Czynnik etiologiczny, wywołujący i przenoszący zespół chorobowy, został zidentyfikowany jako mały, kulisty, otoczkowy wirus o przeciętnej średnicy wirionu 62 nm i rdzeniu 25-30 nm, zamkniętym w otoczce. Wirus ten zaliczono próbnie do rodzaju Arterivirus, w rodzinie Togaviridae. Opisany tu izolat wirusa PRRS odpowiada tej próbnej klasyfikacji; wykazano, że przenosi on zespół chorobowy. Zespół chorobowy, związany z PRRSV charakteryzuje się ostrą i przewlekłą niezdolnością do reprodukcji u dorosłych samic świń, i ciężką do łagodnej chorobą oddechową u młodych świń. Niezdolność reprodukcji charakteryzuje się zwiększoną czystością urodzeń zmumifikowanych, martwych i słabych prosiąt o znacznie mniejszych szansach przeżycia. Opisano również chroniczne problemy z powrotem rui u zakażonych macior. Następstwa choroby oddechowej wahają się od znacznej gorączki i śródmiąższowego zapalenia płuc do łagodnych objawów ze strony górnych dróg oddechowych (np. kichanie, kaszel i wydzielina z nosa lub oczu) u młodych świń. Ostatecznie (1990) badania serologiczne i epidemiologiczne wskazują, że co najmniej 50% stad świń w USA było eksponowanych na PRRSV lub przeszło niezdolność reprodukcji lub chorobę oddechową wskazujące na zakażenie PRRSV. W związku z niedawnym pojawieniem się tego zespołu chorobowego badania nad patogenezą epidemiologią i kontrolą choroby były ograniczone. Należało sobie uświadomić, że efektywne namnażanie i opracowanie antygenów zawierających PRRSV ułatwi rozwój szczepionki PRRSV, jako sposobu zapobiegania i kontroli zespołu reprodukcyjnego i oddechowego świń. Przedmiotem wynalazku jest izolat wirusa zespołu reprodukcyjnego i oddechowego świń, zwanego PRRSV, oznaczony jako ISU-P i zdeponowany pod numerem depozytu ATCC VR 2402. Następnym przedmiotem wynalazku jest klon linii komórkowej oznaczony jako 9009B i zdeponowany pod numerem depozytu ATCC CRL 11302. Następnym przedmiotem wynalazku jest sposób namnażania izolatu wirusa zespołu reprodukcyjnego i oddechowego świń, zwanego PRRSV, oznaczonego jako ISU-P i zdeponowanego pod numerem depozytu ATCC VR 2402 w hodowli tkankowej wrażliwej na zakażenie i replikującej wirus do ilości wystarczającej dla ochrony zwierząt przeciw PRRSV, albo do użycia w diagnostyce PRRSV, lub identyfikacji molekularnej struktury PRRSV celem wytworzenia pro-
4 178 609 duktów rekombinacji, polegający na tym, że inokuluje się hodowlę tkankową wirusem i zbiera namnożony wirus. Korzystnie jako hodowlę tkankową stosuje się linię komórkową. Szczególnie korzystnie jako hodowlę tkankową stosuje się linię komórkową z nerki zielonej małpy afrykańskiej, a zwłaszcza jako linię komórkową stosuje się klon linii komórkowej z zielonej małpy afrykańskiej oznaczony jako 9009B i zdeponowany pod numerem depozytu ATTC CRL 11302. Następnym przedmiotem wynalazku jest hodowla tkankowa zawierająca izolat wirusa zespołu reprodukcyjnego i oddechowego świń, zwanego PRRSV, oznaczony jako ISU-P i zdeponowany pod numerem depozytu ATCC VR 2402, a zwłaszcza powyższa hodowla wytworzona na skalę handlową> 25 l przy mianie FAID50> 105,0/ml. Następnym przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania szczepionki efetywnej w ochronie świń przeciw PRRSV, polegający tym, że dostarcza się izolat wirusa zespołu reprodukcyjnego i oddechowego świń, zwanego PRRSV, oznaczony jako ISU-P i zdeponowany pod numerem depozytu ATCC VR 2402, uwalnia się wirus z hodowli tkankowej, oraz dostosowuje się masę antygenową przez rozcieńczenie, zatężenie lub ekstrakcję dla wytworzenia immunologicznie efektywnej ilości masy antygenowej, przeznaczonej do żywego zmodyfikowanego (atenuowanego), inaktywowanego, podjednostkowego lub rekombinantowego preparatu. W sposobie według wynalazku korzystnie jako hodowlę tkankową stosuje się linię komórkową z nerki zielonej małpy afrykańskiej, a zwłaszcza linię komórek z nerki zielonej małpy afrykańskiej, która jest klonem linii komórkowej oznaczonym jako 9009B i zdeponowanym pod numerem depozytu ATCC CRL 11302. Następnym przedmiotem wynalazku jest szczepionka efektywna w ochronie świń przeciw PRRSV, ewentualnie zawierająca czynniki inaktywujące, adiuwanty i/lub konserwanty, zawierająca izolat wirusa zespołu reprodukcyjnego i oddechowego świń, zwanego PRRSV, oznaczony jako ISU-P i zdeponowany pod numerem depozytu ATCC VR 2402. Korzystnie szczepionka według wynalazku zawiera żywy, zmodyfikowany (atenuowany) PRRSV i ma postać płynną, zamrożoną albo liofilizowaną. Szczególnie korzystna jest szczepionka zawierająca adiuwant na bazie oleju lub wody. Korzystny adiuwant wybrany jest z grupy obejmującej adiuwant kompletny Freunda i adiuwant niekompletny Freunda. Szczepionka według wynalazku korzystnie jako czynnik inaktywujący zawiera binarną etylenoiminę, betapropiolakton albo formalinę. Innymi słowy, wynalazek dotyczy izolatu wirusa, oznaczonego jako ISU-P, przydatnego w wytwarzaniu antygenów do diagnostyki zespołu reprodukcyjnego i oddechowego świń, oraz do indukcji ochronnej odpowiedzi immunologicznej na PRRSV. Wynalazek obejmuje także sposoby wytwarzania i użycia tych antygenów. Korzystnie według wynalazku, izolat PRRSV można otrzymać przez wspólne hodowanie 10% (wagowo/objętościowych) homogenatów z płuc świń zakażonych wirusem i pierwotnych makrofagów pęcherzykowych świń albo ciągłych linii komórkowych w 35 C. Wynalazek obejmuje dalej namnażanie wirusa do wysokiego miana w niektórych liniach komórkowych, jak ciągła linia komórek nerki zielonej małpy afrykańskiej (MA 104), oraz unikatową klonowaną pochodna tej linii (9009B). Wynalazek obejmuje także sposoby wytwarzania i użycia żywego wirusa lub zabitych antygenów wirusa (otrzymanych konwencjonalnie lub przez rekombinację), a następnie szczepionki otrzymywane przez łączenie immunologicznie efektywnej ilości wirusa odpowiednio z rozcieńczalnikiem i/lub adiuwantem. Stwierdzono, że bezpośrednia doświadczalna immunizacja macior żywym wirusem, albo kontakt z maciorami immunizowanymi żywym wirusem, zapobiegały niezdolności do reprodukcji po donosowej prowokacji zjadliwym PRRSV.
178 609 5 Wykazano również, że inaktywowane szczepionki PRRSV z adiuwantem chroniły świnie przed zakażeniem PRRS przy prowokacji, jak to wynikało z braku replikacji wirusa u osobników szczepionych w porównaniu z nieszczepionymi świniami kontrolnymi. Jak powiedziano wyżej, obecny wynalazek jest nakierowany na otrzymywanie izolatu ISU-P wirusa PRRS, w celu wytworzenia antygenów wirusa do użycia w szczepionkach i badaniach diagnostycznych. Izolat ISU-P otrzymano z tkanki płucnej słabo urodzonej świni. Dla przykładu, 10% w/v homogenat tkanki płucnej, śledziony i węzła limfatycznego przygotowano w podstawowych minimalnych podłożach, uzupełnionych antybiotykami (MEM+A), celem zminimalizowania możliwości kontaminacji. Surowy homogenat klarowano przez wirowanie w 4 C przez 15 minut przy 1500 x g. Klarowny supernatant rozcieńczono 1:5 w MEM+A i 1,0 ml adsorbowano na 48-godzinnej zlewnej jednowarstwowej hodowli komórek MA 104 albo pierwotnych makrofagach pęcherzykowych, w butelkach 25 cm2. Po 2-godzinnym okresie adsorpcji w 35 C, hodowle przemywano dwukrotnie MEM+A, i dodano 5,0 ml MEM+A z dodatkiem 5,0% płodowej surowicy cielęcej poddanej promieniowaniu gamma. Butelki do izolacji wirusa inkubowano w 35 C w atmosferze 5% CO2 i obserwowano codziennie celem wykrycia efektu cytopatycznego (CPE). Efekt cytopatyczny PRRSV ISU-P zaczynał się zaokrągleniem się małych ognisk 5 do 10 komórek i rozwijał się w ciągu 4 do 7 dni po zakażeniu, aż większość komórek stawała się pyknotyczna i odklejała się od podłoża. Obecność PRRSV w izolacie ISU-P potwierdzano barwieniem fluorescencyjnym, PRRSV grupowo-swoistym przeciwciałem monoklonalnym oznaczonym w publicznym obrocie jako SDOW17. Ponadto, niezabarwione komórki, zakażone wirusem, badano w transmisyjnym mikroskopie elektronowym na obecność cząstek wirusowych. Zaobserwowane cząsteczki wirusa były kuliste, zawierały otoczkę, a przeciętna średnica wirionu wynosiła 65 nm, średnica rdzenia 27 nm. Określony w ten sposób wirus z hodowli tkanek użyto do doświadczalnego przeniesienia później aborcji i niezdolności do reprodukcji na ciężarne maciory (tabela 1). Tabela 1 wskazuje, że ciężarne maciory, po kontakcie albo z homogenatami płuc zakażonych ISU-P (PRRS-hm) albo z ISU-P z hodowli tkanek (PRRS-tc) wykazują typowe oznaki zespołu reprodukcyjnego i oddechowego (PRRS). W grupach PRRS-hm nie urodziło się żadne normalne prosię, w grupach PRRS-tc tylko 4 z 33 prosiąt urodziły się normalne. Dla porównania, 29 z 30 (96,7%) nie eksponowanych świń było normalnych przy urodzeniu. Fakt, że ISU-P, nawet po oczyszczeniu w hodowli tkanek, może przenosić chorobę PRRS, potwierdza właściwą klasyfikację izolatu jako należącego do rodzaju Arterivirus w rodzinie Togaviridae. Stwierdzono także, że izolat wywołuje łagodne śródmiąższowe zapalenie płuc u świń zakażonych doświadczalnie. Jest cechą wynalazku, że PRRSV według wynalazku można namnażać w pewnych komórkach w hodowli tkankowej, które efektywnie replikują wirus do poziomu wystarczająco wysokiego aby zapewnić masę antygenową niezbędną do szczepionek, które mogą chronić świnie i/lub ciężarne lochy przed prowokacją PRRS. Dla przykładu, PRRSV można namnażać w komórkach hodowli tkankowej oznaczonej MA 104 przez Whittaker BioProducts. Doświadczenia z namnażaniem wirusa, w identycznych warunkach hodowli, na komórkach MA 104 otrzymanych z trzech różnych źródeł, wykazują wysoki stopień zmienności komórek MA 104 pod względem zdolności replikacji PRRSV do wysokiego miana. Używana w opisanych tu badaniach jedna z hodowli komórkowych MA 104, oznaczona MA 104(M) przez Miles Inc., Agriculture Division, Animal Health Products Group, stale podtrzymywała replikację PRRSV do wysokiego miana. Ponadto klon linii komórkowej, wyprowadzony z MA 104(M) i oznaczony 9009B (Miles Inc. Agriculture Division, Animal Health Products Group), podtrzymuje replikację PRRSV do mian wyższych niż linia komórek rodzicielskich. Zatem do namnażania ISU-P preferowana jest hodowla komórek 9009B. Pełniejsza ilustracja namnażania ISU-P PRRSV w hodowli komórkowej jest przedstawiona niżej. Komórki hodowli tkankowej (MA 104(M) i 9009B) hodowano i otrzymywano ze zmodyfikowanej podstawowej pożywki wg. Dulbecco z wysoką zawartością glukozy (DMEM/HG), uzupełnionej 5% płodowej surowicy cielęcej i buforowej 1,3 g/l dwuwęglanu sodu. Komórki pasażowano w takich ilościach, aby w ciągu 48 godzin otrzymać 80-100% zlewną hodowlę jedno-
6 178 609 warstwową. Wirus PRRS ISU-P z przechowywanego zapasu, rozcieńczano w DMEM/HG + 5% płodowej surowicy cielęcej, buforowanym PIPES do ph 6,8. Wirus nakładano na warstwę komórek w niskiej dawce replikacyjnej (MOI) i inkubowano w 36 C. Zakażone hodowle obserwowano codziennie przez 4-7 dni, w celu wykrycia rozwoju CPE, po czym zbierano gdy CPE był wyraźny w 90-100%. Maksymalną masę antygenową wirusa otrzymywano po jednym cyklu zamrażania w -70 C i odmrażania. Średnie miana wirusa namnażanego w komórkach MA 104(M) wahały się od 103,0 do 104,5 dawki zakaźnej oznaczanej immunofluorescencyjnie (FAID50/ml), natomiast miana z komórek 9009B wynosiły 105,5 do 106 5 FAID50/ml. Miana tej wysokości umożliwiają włączenie wystarczającej masy antygenowej do szczepionki PRRSV na skalę handlową, o objętości większej niż 50 l. Eksperci doświadczeni w technice powinni sobie uświadomić, że odkąd PRRSV można namnażać do wysokich poziomów masy antygenowej, można otrzymać pochodne tego wirusa, w tym podjednostki, efektywne zgodnie z wynalazkiem, sposobami znanymi w technice jak na przykład ekstrakcja z wirusa. Ponadto antygeny ochronne można identyfikować na poziomie molekularnym i reprodukować je drogą ekspresji przy użyciu rekombinacji. Płyny zawierające wirus do preparatu szczepionkowego inaktywowano dwoma sposobami. Jako inaktywatory wybrano formalinę i binarną etylenoiminę (BEI). Inaktywację wykonano sposobami standardowymi. Inaktywację formaliną przeprowadzono mieszając płyny wirusowe z 37% formaldehydem handlowym, do końcowego stężenia formaliny 0,05%. Mieszaninę formalina-wirus trzymano w temperaturze pokojowej (około 25 C) przez 24 godziny, stale mieszając. Próbki pobierano w czasie 0, 8,12 i 24 godziny i badano na obecność żywego wirusa w komórkach 9009B. Efekt cytopatyczny i barwienie immunofluorescencyjne grupowo-swoistym przeciwciałem monoklonalnym wykryły żywy wirus PRRS tylko w czasie 0. Inaktywację BEI przeprowadzono łącząc 0,1M roztwór BEI (20,5 g/1 2-bromo-etyloaminy HBR w 0,175 N NaOH) z płynami wirusowymi do końcowego stężenia 1,0 mm BEI i pozostawiając mieszaninę w temperaturze przez 48 godzin, ciągle mieszając. Inaktywację wirusa przerywano przez dodanie 1,0 M tiosiarczanu sodu do końcowego stężenia 0,1 mm, mieszając przez 2 godziny. Próbki pobierano w czasie 0,2,4, 8,12,24 i 48 godzin i badano na obecność żywego wirusa jak opisano wyżej. Żywy PRRSV wykryto tylko w czasie 0, 2 i 4 godzin. W preparacie zmodyfikowanej albo atenuowanej szczepionki według wynalazku PRRSV jest zmieniony tak, że może on nadal zakażać gospodarza w sposób ograniczony, ale nie może wywoływać objawów choroby u gospodarza. Normalnie taka zmiana wirusa zachodzi przy pasażowaniu w komórkach, które nie są naturalnym gospodarzem, jak na przykład komórki nerki zielonej małpy afrykańskiej. Początkowo wirus może nie rosnąć dobrze lub wcale. W tym ostatnim przypadku może okazać się konieczne wymusić adaptację wirusa do hodowli komórek, co można wykonać dodając wirus do hodowli komórek w wysokiej lub niskiej dawce zakażającej (MOI). Alternatywnie wirus można pasażować w sposób wymuszony lub ślepy wraz z komórkami, do osiągnięcia wystarczającego CPE, co wskazuje na adaptację wirusa. Gdy następuje adaptacja, miano wirusa będzie wzrastać, jak to się obserwuj e przy pasażowaniu izolatu ISU-P wirusa PRRS z linii komórkowej MA 104(M) na linię 9009B. Jak widać w tabeli 1PRRSV ISU-P pasażowany w hodowli tkanek (PRRS-tc) może być mniej zjadliwy niż wirus izolowany z homogenatów płuc, co jest typowym wynikiem adaptacji. Dane w tabeli 2 wskazują, że sposób wytwarzania szczepionek według wynalazku szczególnie efektywnie zapewniają ochronę przed PRRS. Inaktywowany PRRSV ISU-P miesza się z adiuwantem jak następuje. Adiuwanty wybrano z grupy obejmującej aiuwant kompletny Freunda, adiuwant niekompletny Freunda, adiuwant oparty na carbopolu i Diamond Scientific Adiuvant B (Adi B). Adiuwanty te reprezentują główne typy używane w wytwarzaniu szczepionek. Oba adiuwanty Freunda (FCA i FIA) oraz ADi B są oparte na oleju, carbopol jest adiuwantem wodnym. Inaktywowany PRRSV ISU-P ewentualnie może zawierać odpowiedni konserwant. Preparaty szczepionkowe z FCA i FIA przygotowuje się przez emulsyfikację inaktywowanego wirusa, zwykle z równą objętością adiuwantu, przy pomocy 18 cm aparatu double luer lock
178 609 7 i dwu strzykawek. Płyny przepompowuje się szereg razy między strzykawkami, aż do otrzymania gęstej jednolitej emulsji. Emulsje ładuje się do strzykawek bezpośrednio do podania. Preparaty szczepionkowe z Adi B przygotowano mieszając macierzysty Adi B z równą objętością inaktywowanego płynu wirusowego PRRSV ISU-P. Adiuwant i wirus mieszano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Szczepionkę z adiuwantem przenoszono aseptycznie do wielodawkowych fiolek i przechowywano w 4 C przed użyciem. Preparaty szczepionkowe oparte na carbopolu przygotowano mieszając macierzysty adiuwant carbopol z inaktywowanymi płynami wirusowymi, do końcowego stężenia adiuwanta 10% v/v/. Mieszano w temperaturze pokój owej przez 4 godziny. Szczepionkę z adiuwantem przenoszono aseptycznie do jałowych wielodawkowych fiolek i przechowywano w 4 C przed podaniem. PRRSV ISU-P o mianie przed inaktywacją tylko 105,0 FAID50/ml używano w różnych opisanych preparatach szczepionkowych. Przeprowadzono dwa badania nad szczepieniem/prowokacją, aby wykazać, że izolat PRRSY ISU-P może chronić świnie przed zespołem, reprodukcyjnym i oddechowym. W pierwszym badaniu 4 lochy immunizowano żywym PRRSV ISU-P przez nosowo-doustną ekspozycję na wirus, albo drogą bezpośrednią albo przez kontakt z chorymi świniami. Dwie lochy w tym samym wieku pozostawiono nie immunizowane (nie eksponowane) i trzymano osobno jako kontrole. Świnie szczepione bezpośrednio (nr 57 i 58) otrzymały 3,0 ml inokulum wirusowego donosowo. W 14 dni po ekspozycji wstąpiła u nich serokonwersja, oznaczona testem pośredniej immunofluorescencji. Dwie lochy eksponowane przez kontakt (nr 476 i 480) immunizowano drogą nosowo-doustną po ich umieszczeniu w ścisłym kontakcie z chorymi świniami. Serokonwersja wystąpiła u nich 90 dni po ekspozycji; oceniano ją mianem IFA wyższym niż 1:20. Po serokonwersji immunizowanych loszek, ich ruja uległa synchronizacji i zostały one zapłodnione. Ciążę potwierdzono ultradźwiękami. W 90 dniu ciąży, szczepione i kontrolne ciężarne lochy otrzymały jako prowokację donosowo 3,0 ml PRRSV o mianie 1 x 104 FAID50. Lochy kontrolne nr 52 i 477 wykazały przez dwa do trzech dni po prowokacji wczesne objawy choroby: zmniejszony apetyt i podwyższenie temperatury ciała (103-104 F). Nie stwierdzono przejawów choroby u loch eksponowanych na ISU-P (szczepionych). Wyniki te wskazują na ochronę przed klinicznym zespołem choroby oddechowej. Wszystkie lochy obserwowano do odstawienia prosiąt od piersi (4 tygodnie po urodzeniu). Tabele 2 zawiera wyniki urodzeń w tym doświadczeniu. Jako wyniki urodzeń notowano długość ciąży (ciąża jest zwykle skrócona przy zakażeniu PRRS), martwo urodzone płody, płody zmumifikowane, prosięta słabe. Wszystkie te trudności urodzeń wskazują na zakażenie PRRS ciężarnych macior. Dodatkowo notowano liczbę świń normalnych. Żadna z macior kontrolnych nie urodziła normalnych prosiąt (0 normalnych na 22). Siedem z 22 prosiąt urodziło się martwych a 15 z 22 urodziło się słabych. Długość ciąży macior kontrolnych była skrócona o 2,5 dnia, co jest typowe dla PRRS u świń ciężarnych. W grupie immunizowanej (n = 50) 40 świń (80%) urodziło się normalnych. Sześć z 50 urodziło się martwych, a 4 z 50 płodów były zmumifikowane przy urodzeniu. W grupie szczepionych nie było prosiąt słabo urodzonych. Widać wyraźnie, że maciory uprzednio eksponowane na żywy PRRSV ISU-P, które zostały zapłodnione i następnie poddano prowokacji są chronione przed prowokacją, jak to wynika z braku bezpośrednich klinicznych objawów choroby u macior i z protekcji płodów przez nie noszonych. Ponieważ odczynniki do testu IFA, których użyto w tym badaniu do oznaczenia stanu serologicznego macior, otrzymano z PRRSV ISU-P, i ponieważ istnieje bezpośrednia korelacja stanu serologicznego macior i ochroną przed PRRS, należy sobie uświadomić, że izolat PRRSV ISU-P może być przydatny w testach diagnostycznych takich jak pośrednie testy immunofluorescencyj - ne, co wykazano w tych badaniach, testy ELISA, testy neutralizacyjne surowicy, bezpośrednie testy immunofluorescencyjne i inne badania diagnostyczne znane w technice. Stąd też test diagnostyczny oparty na antygenie otrzymanym w PRRSV ISU-P można przygotować i użyć zgodnie z wynalazkiem.
8 178 609 W drugim badaniu nad szczepieniem/prowokacją, młode 4-6 - tygodniowe świnie zaszczepiono kilkoma inaktywowanymi PRSSV ISU-P szczepionkami z adiuwantem. Pula antygenu szczepionkowego została przygotowana przez inaktywację PRRSV ISU-P przy pomocy BEI, jak opisano wyżej, jako adiuwantu użyto albo carbopol, FCA/FIA, albo Adi B. Druga pula antygenu została przygotowana przez inaktywację PRRSV ISU-P formaliną jak opisano wyżej, i dodanie tych samych 3 adiuwantów. Trzy pozorne szczepionki przygotowano, aby się upewnić, że adiuwanty i komórki nie mogą stymulować fałszywej odpowiedzi immunologicznej. Pozorne szczepionki przygotowano dodając adiuwantów do niezakażonych komórek hodowli tkankowej. Każdą ze szczepionek zaszczepiono dwie świnie. Szczepionki podano podskórnie w dniach 0, 21,42 i 64. Siedem dni po ostatnim szczepieniu świnie otrzymały donosowo 103,5 FAID50 żywego zjadliwego PRRSV. Po prowokacji wszystkie świnie obserwowano codziennie na obecność klinicznych objawów choroby. Ponadto pobrano próbki krwi celem izolacji wirusa w hodowli tkanek. Stwierdzenie żywego wirusa w krążeniu krwi oznacza, że wystąpiła wiremia. Miana neutralizacyjne surowic oceniano na początku badania, w dniu prowokacji i 19 dni po prowokacji. Należy zauważyć, że test neutralizacji surowicy jest mniej czuły niż test IFA użyty w badaniu poprzednim. Dlatego też nie można porównywać wyników mian otrzymanych w obu badaniach. Tabela 3 podaje wyniki prowokacji. Nie obserwowano klinicznych objawów choroby u świń szczepionych lub kontrolnych. Ponadto ani u świń szczepionych ani kontrolnych w okresie szczepienia nie pojawiły się miana neutralizacyjne surowicy. Wskazuje to, że w tym okresie nie było ekspozycji na żywy wirus (ujemne kontrole), a także, że szczepionki nie stymulowały odpowiedzi humoralnej wystarczająco wysokiej dla pomiaru testem neutralizacji surowicy. Fakt, że odpowiedź w postaci miana neutralizacyjnego surowicy była znaczna po prowokacji wskazuje, że u wszystkich świń prowokacja żywym wirusem PRRS była efektywna. Potwierdzeniem tego jest odsetek świń kontrolnych, które wykazały wiremię. Wszystkie świnie kontrolne z wyjątkiem jednej (87,5%) uległy zakażeniu. Odpowiedź immunologiczna u świń szczepionych była tak silna, że była w stanie zablokować wiremię, którą wykazała tylko jedna z 12 szczepionych świń (8,3%). Zatem szczepionki chroniły 91,7% świń. Nie ograniczając się do jakiejś szczególnej teorii wynalazku, można sądzić, że wymuszone pasażowanie pierwotnego izolatu PRRSV przez specjalnie adaptowany klon MA 104(M) komórek zielonej małpy afrykańskiej (9009B) skutecznie zmodyfikowało jeden lub więcej epitopów tego wirusa. W wyniku otrzymano zwiększoną immunogenność tego wirusa, co umożliwiło wytworzenie szczepionki w dziedzinie, gdzie nie udało się to innym uczonym. Tabela 1 Późna aborcja i niezdolność reprodukcji u macior eksponowanych na izolat ISU-P PRRSV w porównaniu z nie eksponowanymi maciorami kontrolnymi. I. Grupa eksponowana na PRRS Maciora nr Długość ciąży (a) Preparat wirusa Martwo urodzone Słabe Zmumifikowane Normalne 1 2 3 4 5 6 7 57 112 dni PRRS-hmb 6 8 0 0 54 108 dni PRRS-hm 6 1 0 0 649 112 dni PRRS-hm 3 7 0 0 58 112 dni PRRS-hm 4 4 3 0 166 112 dni PRRS-tcc 0 2 6 1 164 113 dni PRRS-tcd 2 2 5 1 80 110 dni PRRS-tce 2 2 2 2 Ogółem 23 26 16 4
178 609 9 ciąg dalszy tabeli 1 1 2 3 4 5 6 7 II. Grupa nie eksponowana kontrolna 52 114 dni - 0 0 0 11 56 115 dni - 0 0 0 12 163 116 dni - 1 0 0 7 Ogółem 1 0 0 30 (a) = Normalny okres ciąży świń - 114 dni b = PRRSV - dodatnie inokulum z homogenatu płuc świni gnotobiotycznej c = PRRS V z hodowli tkanek, 103,0 dawka zakaźna immunofluorescencyjna 50 na ml (FAID 50/ml) d =PRRSV z hodowli tkanek, 104,0 FAID50/ml e = PRRSY z hodowli tkanek, 105,0 FAID50/ml Tabela 2 Wyniki urodzeń u loch immunizowanych ISU-P i nie immunizowanych Locha nr Miano IFA Długość ciąży Martwo urodzone Słabe Zmumifikowane Normalne 57 V + 113 dni 2* 0 0 7 58 V + 114 dni 4 0 3 11 476 V + 113 dni 0 0 1 10 480 V + 114 dni 0 0 0 12 52 C - 111 dni 5 7 0 0 477-112 dni 2 8 0 0 Ogółem 6 szcz. 7 kont. 0 szcz. 15 kont. 4 szcz. 0 kont 40 szcz. 0 kont. + miano IFA>20 - miano IFA<20 V szczepiona C kontrolna Tabela 3 Podsumowanie doświadczenia z inaktywowaną szczepionką PRRSY Grupa szczepionki Średnia SN prowokacja Średnia SN po prowokacjia Izolacja wirusa BEI, PRRS-Carbopol n=2 <1:2 1:82 neg/neg BEI, PRRS-FCA/FIA n=2 <1:2 1:4 neg/neg BEI, PRRS-Adi B n=2 <1:2 1:5 neg/neg Form, PRRS-Carbopol n=2 <1:2 1:23 neg/poz Form, PRRS-FCA/FIA n=2 <1:2 1:2 neg/neg Form, PRRS-Adi B n=2 1:3 1:8 neg/neg Grupa pozornej szczepionki pozorny AG-carbopol n=2 <1:2 <1:2 poz/poz Pozorny AG-FCA/FIA n=2 <1:2 <1:2 poz/poz Pozorny AG-Adi B n=2 <1:2 <1:2 poz/poz a = odpowiedź SN 19 dnia po prowokacji, koniec doświadczenia b = izolacja wirusa z osocza dowolnego dnia w testowym okresie 19 dni po prowokacji izolacja wirusa wykrywana CPE w komórkach 9009B i potwierdzana barwieniem immunofluorescencyjnym tych komórek PRRSV grupowo-swoistym przeciwciałem monoklonalnym SDOW17.
10 178 609 Aczkolwiek wynalazek został wyżej opisany szczegółowo w celu ilustracji, należy rozumieć, że szczegóły są wyłącznie w tym celu i że osoby doświadczone w technice mogą wprowadzać modyfikacje, bez odchodzenia od ducha i zakresu wynalazku, chyba że może to być ograniczone zastrzeżeniami patentowymi. Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 60 egz. Cena 2,00 zł.