DA-273191.00-1 - GOTOWE PODŁOŻA DIPSLIDE NA PŁYTKACH INSTRUKCJE STOSOWANIA DA-273191.00 Wersja: Lipiec 2003 BD BBL Dermatoslide PRZEZNACZENIE BBL Dermatoslide jest to system płytki dwustronnej przeznaczony do wykrywania i izolacji grzybów patogennych wywołujących powierzchowne zakażenia skóry, włosów i paznokci. ZASADY I OBJAŚNIENIE PROCEDURY Metoda mikrobiologiczna. Grzyby odgrywają główną rolę w zakażeniach skóry i przyległości, takich jak włosy i paznokcie. Czynnikami zakaźnymi zwykle i najczęściej są grzyby wytwarzające grzybnie z gatunku Trichophyton, Epidermophyton i Microsporum, ale także innych. Przyczyną powierzchownych zakażeń skóry mogą być także gatunki drożdżaków, takie jak Candida albicans. W celu wykrycia czynników zakaźnych i umożliwienia właściwej identyfikacji i leczenia należy stosować zarówno podłoża selektywne (wybiórcze), jak i nieselektywne. Podłoże 1 jest zmodyfikowanym podłożem agarowym przeznaczonym do wykrywania dermatofitów wg Taplina, szczególnie, ale nie tylko, grzybów z gatunków Trichophyton, Epidermophyton i Microsporum. W podłożu tym peptony zapewniają obecność azotu, a także są źródłem zasadowych produktów, wytwarzanych przez dermatofity. 1 Po przekształceniu peptonów w produkty zasadowe, nastąpi zmiana barwy czerwieni fenolowej (wskaźnika) z żółtej na czerwoną. Glukozę dodaje się jako składnik odżywczy oraz w celu umożliwienia zakwaszania środowiska przez grzyby zdolne do pierwotnego wykorzystywania glukozy. Większość grzybów innych niż dermatofity, w tym drożdżaki i pleśniaki (jeśli mogą rosnąć na podłożu) wykorzystuje glukozę. Powoduje to wytwarzanie kwasu i brak zmiany barwy czerwieni fenolowej, która jest wskaźnikiem ph. 2,3 Cykloheksymid jest czynnikiem hamującym wzrost pleśniaków i niepatogennych drożdżaków. Inhibitorami bakterii są chloramfenikol i gentamycyna. Kilka drobnoustrojów, w tym saprofity, drożdżaki i bakterie, ma zdolność na podłożu i zmiany barwy z czerwonej na żółtą. Jednak są one łatwe do rozpoznania ze względu na swoją charakterystyczną morfologię kolonii. Podłoże 2 to agar słodowy (Malt agar) służący do wykrywania drożdżaków. Wymienione podłoże stosuje się w celu wykrycia wszystkich rodzajów grzybów, w tym pleśniaków i drożdżaków. Wyciąg słodowy zawiera wszystkie niezbędne składniki pokarmowe umożliwiające wzrost grzybów. Niskie ph podłoża powoduje częściowe lub całkowite bakterii, którymi skażona jest próbka materiału, natomiast jest czynnikiem dobrze tolerowanym przez grzyby. 4,5 BBL Dermatoslide stosuje się w celu pierwszej izolacji grzybów, zwłaszcza dermatofitów, pochodzących z różnych rodzajów powierzchownych zakażeń. Można go również używać jako podłoża transportowego do przesyłania próbek z gabinetu lekarskiego do laboratoriów analitycznych. ODCZYNNIKI BBL Dermatoslide Skład* w przeliczeniu na litr wody oczyszczonej Podłoże 1 Podłoże 2 Trzustkowy hydrolizat kazeiny 15,0 g Wyciąg słodowy 30,0 g Papainowy hydrolizat mączki sojowej 5,0 Agar 18,0 Chlorek sodu 5,0 ph 4,0 ± 0,2 Agar 20,0 Glukoza 10,0 Czerwień fenolowa 0.2 Cykloheksymid 0,5 Chloramfenikol 0,1 Gentamycyna 0,1
ph 5,5 ± 0,1 *Dostosowany i (lub) uzupełniony zgodnie z wymaganiami w celu spełnienia kryteriów wydajności. ŚRODKI OSTROŻNOŚCI. Wyłącznie do zastosowań profesjonalnych. Nie należy używać płytek, jeżeli widoczne są na nich ślady skażenia mikrobiologicznego, odbarwienia, wyschnięcia, pęknięcia lub inne oznaki pogorszenia jakości. W przypadku stosowania BBL Dermatoslide jako podłoża do transportu próbek z gabinetu lekarskiego do laboratorium diagnostycznego należy przestrzegać lokalnych przepisów prawa dotyczących przewozu materiałów medycznych. Procedury aseptycznej techniki pracy z produktem, zagrożenia biologiczne oraz usuwanie zużytego produktu opisano w dokumencie OGÓLNA INSTRUKCJA DOTYCZĄCA STOSOWANIA. Podczas pobierania i pracy z próbkami oraz dodatnimi płytkami zawierającymi czynniki zakaźne należy używać rękawic ochronnych. WARUNKI I OKRES PRZECHOWYWANIA Dostarczone zestawy BBL Dermatoslide należy przechowywać aż do momentu użycia w oryginalnym opakowaniu, w zaciemnionym pomieszczeniu, w temperaturze 15 20 C. Nie zamrażać, nie wysuszać, unikać wahań temperatury oraz przegrzewania. Nieotwarte płytki pochodzące z otwartego opakowania zawierającego 10 płytek mogą być wykorzystane do momentu upływu wskazanej daty ważności. Po otwarciu należy natychmiast zużyć płytki. KONTROLA JAKOŚCI PRZEZ UŻYTKOWNIKA Przygotować zawiesiny wymienionych poniżej szczepów, zgodne ze standardem McFarlanda 0,5. Przygotować dla każdego drobnoustroju przygotować probówkę (dostatecznie szeroką, aby można było umieścić w niej nośnik agarowy BBL Dermatoslide) zawierającą 20 do 25 ml jałowego roztworu soli fizjologicznej, po czym dodać do niej 1 ml wspomnianej wyżej zawiesiny szczepu. Otworzyć BBL Dermatoslide, wyjąć nośnik agarowy, zanurzyć go na krótko w zawiesinie szczepu testowego, po czym postępować zgodnie z opisem badania płynnych próbek, zamieszczonym w części Procedura testowa. Inkubować przez 5 do 7 dni w temperaturze 35 ± 2 C. Należy sprawdzić wygląd powierzchni agaru pod kątem drobnoustrojów, tak jak to opisano w części Interpretacja wyników. Szczepy Podłoże 1 Podłoże 2 Trichophyton * mentagrophytes ATCC 9533 Candida albicans ATCC 10231 Candida glabrata ATCC 2001 Aspergillus nige r Całkowite zahamowanie ATCC 16404 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Całkowite zahamowanie Enterococcus faecalis ATCC 29212 Staphylococcus aureus ATCC 25923 Całkowite zahamowanie Bez posiewu Żółte, przejrzyste do lekko mętnego Bezbarwne do jasnobursztynowego *Należy zauważyć, że wzrost dermatofitów na tym podłożu może być słabszy lub może wymagać dłuższego czasu w stosunku do na podłożu 1. DA-273191.00-2 -
PROCEDURA Dostarczane materiały BBL Dermatoslide. Sprawdzane pod względem obecności drobnoustrojów. Materiały niedostarczane Pomocnicze pożywki hodowlane, odczynniki, wyposażenie laboratoryjne oraz narzędzia do pobierania próbek zgodnie z opisem. Typy próbek BBL Dermatoslide można stosować do wszystkich próbek, w których podejrzewa się obecność grzybów powodujących zakażenia skóry, włosów, paznokci itd. Pobieranie próbek, posiew i procedura testowa Przed użyciem należy skontrolować wzrokowo wygląd powierzchni agaru pod względem jałowości, pozostawiając BBL Dermatoslide nieotwarte. Zapisać na probówce nazwisko chorego, numer próbki i datę posiewu. Przed posiewem należy wyjąć płytkę z plastikowej probówki, unikając dotykania powierzchni podłoży agarowych. Skóra: Przed usunięciem łusek skórnych należy oczyścić zakażone miejsce, używając 70% alkoholu etylowego lub izopropylowego. Zawsze należy stosować jałowe narzędzia do pobierania próbek. Łuski należy usuwać z suchych i łuszczących się zmian poprzez ich zeskrobanie skalpelem od zmienionych zapalnie brzegów w kierunku zdrowej skóry. Skalpele jednorazowego użytku mogą łatwo zranić skórę (najlepiej jest używać tylko grzbietu ostrza). Należy dokładne zeskrobać duży obszar i pobrać tak dużo materiału, jak to możliwe. W przypadku zmian wykazujących cechy ostrego zapalenia lub pęcherzowych, należy ostrożnie usunąć skórę tworzącą pęcherz za pomocą nożyczek lub kleszczyków. Posiew takiego materiału powinno się wykonać razem z posiewem zawartości pęcherza oraz, jeśli to możliwe, łusek pochodzących z obszaru otaczającego zmianę. W przypadku zmian naciekających lub ziarniniakowych materiał należy pobierać z głębszych warstw oraz z fałdów skórnych ostrą łyżką lub lancetem do szczepień. Pobrany materiał należy umieścić na skrawku papieru filtracyjnego lub bezpośrednio na BBL Dermatoslide. Jeśli przy pobieraniu próbek stosuje się bezpośrednią technikę należy ostrożnie zeskrobać powierzchnię skóry ostrym narzędziem i następnie delikatnie przycisnąć powierzchnię BBL Dermatoslide do badanego miejsca skóry, zaczynając od podłoża 1. Włosy: Należy kleszczykami wyrwać matowe, pozbawione połysku włosy wraz z korzeniem. Zakażone włosy łamią się i wypadają łatwiej niż zdrowe. Jeśli używa się lampy Wooda należy pobrać włosy, które wykazują fluorescencję, nawet jeśli w świetle dziennym wyglądają na zdrowe. Jeśli widoczne są tzw. czarne punkciki, należy podważyć i usunąć zakażone włosy z buławki włosa, używając krawędzi skalpela. Nie należy wykorzystywać obciętych włosów jako próbki materiału. Rozmieścić włosy na obu podłożach płytki. Delikatnie wcisnąć włosy w podłoże agarowe za pomocą kleszczyków. Paznokcie: W przypadku zakażenia zlokalizowanego pod paznokciem ostrożnie, nożyczkami, pilnikiem do paznokci lub skalpelem, usuwa się wszystkie makroskopowo zmienione powierzchowne części paznokcia. Następnie pobiera się odłamki paznokcia z łożyska paznokcia. W przypadku powierzchownego zakażenia odłamki paznokcia lub małe cząstki podobne do pyłu zeskrobuje się z powierzchni płytki paznokciowej. Nie należy wykonywać posiewów przy użyciu BBL Dermatoslide z wykorzystaniem dużych fragmentów paznokcia wycinanych z usuniętego paznokcia. Najlepszym wyjściem jest zastosowanie urządzenia do opiłowywania paznokci. Należy wykonać posiew materiału na obu stronach płytki. Próbki pobierane za pomocą wacików lub kleszczyków: Należy równomiernie rozmieścić materiał na obu podłożach agarowych (zaczynając od agaru 1) za pomocą jałowych wacików lub kleszczyków. Większe części należy delikatnie wcisnąć w podłoże agarowe, używając kleszczyków w celu zapewnienia kontaktu pomiędzy materiałem a powierzchnią agaru. Należy DA-273191.00-3 -
zauważyć, że waciki usunięte z zakażonych obszarów nie są właściwym materiałem do hodowli dermatofitów. Aby uzyskać dalsze informacje na temat metod pobierania i rodzajów materiałów, należy zapoznać się piśmiennictwem. 3,4,6 Po pobraniu materiału i wykonaniu posiewu, należy ponownie włożyć płytki do probówki i dokładnie docisnąć zakrętkę. BBL Dermatoslide należy inkubować w temperaturze 25 30 C do 4 tygodni. Codziennie należy sprawdzać wygląd powierzchni podłoży agarowych. W celu dalszego postępowania lub identyfikacji patogenów płytki z posiewem można także przesłać do specjalistycznego laboratorium. Wyniki Po okresie inkubacji należy wzrokowo skontrolować wygląd powierzchni agaru bez otwierania probówek. Podłoże 1: dermatofitów powoduje zmianę barwy podłoża znajdującego się pod spodem kolonii z żółtej na czerwoną, nawet przed osiągnięciem przez kolonie pełnego. W miarę postępu barwa całego podłoża stopniowo staje się czerwona i widoczna robi się biała, szara lub żółtawa grzybnia. Próbkę materiału uznaje się za ujemną pod względem obecności dermatofitów w przypadku, gdy na danym podłożu nie stwierdza się żadnego po okresie inkubacji. Niektóre saprofityczne pleśniaki, które są zanieczyszczeniem, także mogą rosnąć na podłożu 1. Jednak w takim przypadku kolonie i grzybnia zwykle są widoczne, zanim nastąpi zmiana barwy podłoża. Po wydłużonym okresie inkubacji niektóre drożdżaki oporne na działanie cykloheksymidu (np. Candida albicans) także mogą zmieniać barwę podłoża z żółtej na czerwoną. Drożdżaki można odróżnić od dermatofitów, ponieważ tworzą one kolonie o gładkich obrysach niezawierające grzybni. Podłoże 2: Na tym podłożu rosną wszystkie grzyby (w tym drożdżaki). Drożdżaki wrażliwe na działanie cykloheksymidu (Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida krusei, Candida [=Torulopsis] glabrata i pozostałe) na podłożu 2 zwykle tworzą kolonie o gładkich obrysach, bez stwierdzanego na podłożu 1. Należy zauważyć, ze niektóre dermatofity mogą wymagać dłuższego okresu inkubacji na podłożu 2 niż na podłożu 1 lub może wystąpić jedynie ich słaby wzrost. trzeba pamiętać, że do pełnej identyfikacji patogenów wyizolowanych na omawianej płytce konieczne są dalsze testy, takie jak badania mikroskopowe i/lub biochemiczne. 3,4 Większość tych metod jest dostępna jedynie w laboratoriach diagnostycznych i zwykle nie można ich wykonać w gabinecie lekarskim. Zatem wszystkie płytki zanurzeniowe z wynikami wątpliwymi lub jednoznacznie dodatnimi należy wysyłać do laboratorium analitycznego, wykonującego testy mykologiczne. Po wykorzystaniu wszystkie zużyte probówki oraz pozostałe skażone materiały należy przed wyrzuceniem poddać sterylizacji lub spalić. Szczegółowe informacje przedstawiono w dokumencie OGÓLNA INSTRUKCJA DOTYCZĄCA STOSOWANIA. CHARAKTERYSTKA WYDAJNOŚCIOWA I OGRANICZENIA PROCEDURY BD BBL Dermatoslide to dwustronne płytki przeznaczone do izolacji grzybów i należy ich używać jedynie do hodowli grzybów wywołujących powierzchowne zakażenia (skóry, włosów i paznokci). 2-5 Podłoże 1 jest standardowym selektywnym podłożem do hodowli dermatofitów (np. z gatunków Trichophyton, Epidermophyton i Microsporum). 3,5 Dodatkowo na podłożu rosną drożdżaki oporne na działanie cykloheksymidu, takie jak Candida albicans. Opisane podłoże hamuje wzrost bakterii. DA-273191.00-4 -
Cykloheksymid zawarty w tym podłożu hamuje wzrost niektórych patogennych grzybów, w tym niektórych szczepów Microsporum. Jednak wymienione szczepy będą rosły na podłożu tych 2 płytek. Podłoże 2 jest uniwersalnym podłożem służącym do izolacji grzybów, w tym gatunków saprofitycznych. Mała wartość ph cechująca opisywane podłoże hamuje wzrost większości bakterii, które mogą być obecne w materiale jako zanieczyszczenia lub patogeny. 2,6 Liczba gatunków, które mogą wykazywać wzrost na podłożach na omawianych płytkach, jest duża i nie ogranicza się jedynie do drobnoustrojów wymienionych w części Wyniki i ich interpretacja. BD BBL Dermatoslide jest przeznaczony do pierwotnego izolowania i ilościowego oznaczania drobnoustrojów. Do przeprowadzenia dalszych testów, szczególnie jeśli na podłożach omawianego systemu występują hodowle mieszane, konieczne są hodowle pochodne na odpowiednich podłożach płytkowych w celu uzyskania czystych hodowli, niezbędnych do pełnej identyfikacji i badania wrażliwości na antybiotyki. 3,6 Nie należy stosować płytek zanurzeniowych do wykonywania testów wrażliwości z użyciem krążków dyfuzyjnych. PIŚMIENNICTWO 1. Taplin, D., et al. 1969. Isolation and recognition of dermatophytes on a new medium (DTM). Arch. Dermatol. 99: 203. 2. MacFaddin, J. D. 1985. Media for isolation-cultivation-identification- maintenance of medical bacteria, vol. 1, p. 275-284. Williams & Wilkins, Baltimore, MD. 3. Summerbell, R.C. 2003. Trichophyton, Microsporum, Epidermophyton, and agents of superficial mycoses. In: Murray, P. R., E. J. Baron, J.H. Jorgensen, M. A. Pfaller, and R. H. Yolken (ed.). Manual of clinical microbiology, 8th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 4. Larone, D.H. 1995: Medically important fungi - a guide to identification. 3 rd edition. ASM Press, Washington. 5. Atlas, R.M. 1993. Handbook of Microbiological media. CRC Press, Boca Raton, FL. 6. Sutton, D.A. 2003. Specimen collection, transport, and processing: mycology. In: Murray, P. R., E. J. Baron, J.H. Jorgensen, M. A. Pfaller, and R. H. Yolken (ed.). Manual of clinical microbiology, 8 th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. OPAKOWANIE/DOSTĘPNOŚĆ BBL Dermatoslide Nr kat. 273191 10 płytek DODATKOWE INFORMACJE W celu uzyskania dodatkowych informacji należy skontaktować się z lokalnym przedstawicielem firmy BD. BD Diagnostic Systems Tullastrasse 8 12 D-69126 Heidelberg/Germany Phone: +49-62 21-30 50, Fax: +49-62 21-30 52 16 Reception_Germany@europe.bd.com BD Diagnostic Systems Europe Becton Dickinson France SA 11 rue Aristide Bergès 38800 Le Pont de Claix/France Tel: +33-476 68 3636 Fax: +33-476 68 3292 http://www.bd.com BD, BD logo and BBL are trademarks of Becton, Dickinson and Company. ATCC is a trademark of the American Type Culture Collection. 2003 Becton, Dickinson and Company DA-273191.00-5 -