Roczniki Instytutu Przemysłu Mięsnego i Tłuszczowego T. XXXIX 2002 Bożena Grześ, Edward Pospiech Zmiany winkuliny i desminy w mięsie młodego bydła poddanym peklowaniu i ich wpływ na jego właściwości Słowa kluczowe: mięso bydlęce, winkulina, desmina, peklowanie, elektroforeza, przemyte miofibryle, wyciek wirówkowy, western blotting, wodochłonność, kruchość Wstęp Przy produkcji wołowiny przeznaczonej na cele kulinarne zwraca się szczególną uwagę na jej kruchość. Wytrawny konsument oceniając jakość mięsa interesuje się również jego soczystością, która dla technologa jest wykładnikiem wodochłonności. Dotychczasowe badania nad polepszeniem wodochłonności i kruchości mięsa wiązano głównie ze zmianami we frakcji białek miofibrylamych i łącznotkankowych, w tym przede wszystkim z formami kolagenu. Obecnie istotną rolę w kształtowaniu powyższych właściwości, szczególnie mięsa pochodzącego od młodych zwierząt, przypisuje się białkom cytoszkieletowym (Huff-Lonergan i Lonergan 1999; Taylor i in. 1995). Spośród nich coraz częściej analizuje się białka wchodzące w skład struktur, które spinają miofibryle z warstwą sarkolemy i noszą nazwę kostamer. Do grupy tych białek zalicza się winkulinę i desminę. Stwierdzono, że podczas pierwszych 24 do 72 h od uboju szybkość ich degradacji jest zgodna z tempem fragmentaryzacji włókna mięśniowego i kruszenia mięsa (Taylor i in. 1995). Sugeruje się przy tym, ze udział powyższych struktur w kształtowaniu tej tak ważnej z konsumenckiego punktu widzenia właściwości jest większy od zmian białek linii Z. Przemiany białek cytoszkieletowych w mięsie są zależne od oddziaływania wielu czynników, zarówno przed- jak i poubojowych. Pierwsze z nich wiąże się głównie z gatunkiem i wiekiem zwierząt, natomiast drugie - z warunkami przechowywania i określonymi zabiegami przetwórczymi. Zastosowanie w technologii mięsa typowego zabiegu jakim jest peklowanie powoduje, że zmiany występujących w nim białek lub struktur, które tworzą zachodzą intensywnie (Grześ i in. 1996; Paterson i in. 1988). Do soli stosowanych w czasie peklowania należą najczęściej chlorek sodu, azotyny i fosforany. Ten ostatni związek jest jednak stosowany w naszym przetwórstwie z dużymi ograniczeniami. Dlatego zamiast fosforanów od paru lat z powodzeniem stosuje się węglany. Dotychczasowe obserwacje zmian białek cytoszkieletowych w wyniku działania soli ograniczono zwykle do ich degradacji i zmian w strukturze miofibryli. Tymczasem najnowsze badania pokazują, że zmiana właściwości fizykochemicznych mięsa może być wynikiem nie tylko rozpadu białek ale i zmian w strukturze, w której są one umiejscowione (Grześ i in. 1996, 1998). Ocenę tę umożliwia zastosowanie elektrofo 139
rezy i immunoblottingu. W związku z tym celem pracy było prześledzenie zmian winkuliny i desminy we frakcji miofibrylamej i w wycieku wirówkowym z tkanki oraz określenie ich wpływu na kształtowanie wodochłonności i kruchości mięsa. Metodyka Materiałem doświadczalnym był mięsień czterogłowy uda (m. ąuadriceps femoris) pobrany z 7 tusz młodego bydła rasy nizinnej czarno-białej po 72 h od uboju. Jego wartość ph wahała się w granicach 5,6+5,7. Mięsień ten dzielono na cztery części wydzielając następujące próby: K - kontrolną, A - peklowaną solanką azotynową, F - peklowaną solanką azotynową z dodatkiem fosforanów, W - peklowaną solanką azotynową z dodatkiem węglanów. Próbę kontrolną (K) podzielono dodatkowo na dwa kawałki. Jeden z nich oznaczono symbolem Ko i poddano badaniu bezpośrednio po pobraniu z tuszy (72 h od uboju). Drugi kawałek (K) analizowano po dalszym 48 h przechowywaniu (120 h od uboju) i stanowił on próbę odniesienia dla prób przeznaczonych do peklowania. Do peklowania mięsa zastosowano solankę azotynową (A) zawierającą sól kuchenną, azotyn i askorbinian sodu oraz wzbogaconą dodatkiem pirofosforanu (F) lub węglanu sodu (W). Zabieg ten prowadzono w dwóch etapach. Najpierw próby A, F, W poddano nastrzyknięciu odpowiednią solanką peklującą. Zakładaną końcową zawartość składników soli peklujących po nastrzyku przedstawiono w tabeli I. Tabela I Zakładana końcowa zawartość składników soli peklujących wprowadzonych do mięsa w wyniku nastrzyku Table I Expected finał content ofcuring salts added to meat after injection process Rodzaj próby Kind of sample chlorek sodu chloride azotyn sodu nitrite Rodzaj i ilość soli (%) Type and amount o f salt (%) askorbinian sodu ascorbate pirofosforan sodu pyrophosphate węglan sodu carbonate A 2,00 0,015 0,03 0,00 0,00 F 2,00 0,015 0,03 0,125 0,00 W 2,00 0,015 0,03 0,00 0,20 Wielkość nastrzyku wynosiła 10%. Następnie próby przetrzymywano przez 48 h w solance zalewowej w temp. 4 C. Stężenie solanek zalewowych było 10-krotnie niższe w stosunku do stężenia solanek nastrzykowych. Wyciek wirówkowy pozyskano w wyniku odwirowania (18000 g, 2 C, 20 min.) 6 g mięsa na wirówce K24. Na podstawie jego ilości określono zdolność wiązania wody przez tkankę (WHC). 140
Frakcję przemytych miofibryli pozyskano w wyniku 3-krotnej ekstrakcji przy użyciu rigor buforu (75 mm KCL, 10 mm KH PO, 2 mm M gc l, 2 mm EGTA o ph =7.0) zawierającego 0.1 mm PMSF (Fritz i in.219^1). Naważkę pjfóby stanowiło 2 g mięsa. Analizę elektroforetyczną białek przemytych miofibryli i wycieku wirówkowego przeprowadzono w 10% żelu poliakrylamidowym z SDS (SDS-PAGE) korzystając z metody opracowanej przez Fritza i in. (1991). Wielkość nanoszonej na żel próby przemytych miofibryli i wycieku wirówkowego była zależna od stężenia białka. M aksymalna objętość próby wynosiła 8 jj.1. Dokładną identyfikację wybranych białek przeprowadzono przy pomocy western blottingu (Fritz i Greaser 1991). Do reakcji pierwszorzędowej użyto monoklonalnych przeciwciał winkuliny (V IN -ll-5, rozcieńczonej do 2 (ig/ml) i desminy (DE-U-10, rozcieńczonej do 1 ig/ml). Zastosowanie drugorzędowego przeciwciała (IgG znakowanej alkaliczną fosfatazą w rozcieńczeniu 1:7500) pozwoliło na wykrycie miejsc wiążących pierwszorzędowe przeciwciało z antygenem. Poszukiwany antygen wywoływano za pomocą reakcji barwnej w roztworze TBS (50 mm Tris-HCl, ph 7.5, 0.2 M NaCl) zawierającym 2% mieszaninę odczynników barwiących. Analizę kruchości prób mięsa bydlęcego (K, A, F, W) przeprowadzono po ogrzewaniu wyprodukowanych z nich modelowych konserw typu szynka wołowa. Proces obróbki cieplnej konserw prowadzono w temp. 80 C, którą kontrolowano aż do osiągnięcia wartości pasteryzacyjnej P w zakresie 160-162 min. Po pasteryzacji konserwy schładzano przez 30 min. w strumieniu zimnej wody. Pomiaru tekstury dokonano po 5 dniach ich przechowywania w temp. 4 C na urządzeniu firmy Instron model 1140. Instrumentalną ocenę tego wyróżnika przeprowadzono za pomocą testu penetracji, który polegał na dwukrotnym pomiarze siły zagłębienia się płasko ściętego trzpienia o średnicy 11,3 mm na głębokość równą 80% pierwotnej wielkości próby w kształcie walca (o średnicy 25,4 mm i wysokości 20 mm). Wielkość trzpienia oraz głębokość jego penetracji wzorowano na wcześniejszych badaniach (Chrystall i in. 1994). Za miarę kruchości przyjmowano za Voisey em (1976) wielkość siły penetrowania pierwszego ucisku. Podczas pomiaru ułożenie włókien było prostopadłe do kierunku działania siły. Zmiany masy po peklowaniu i ogrzewaniu prób określono z różnicy masy przed i po zabiegu. W yniki i dyskusja Wyniki z pomiarów wodochłonności na podstawie ilości wycieku wirówkowego oraz instrumentalnej oceny kruchości wskazują na istotny wpływ rodzaju soli na te cechy badanego mięsa (tab. II). Podobne tendencje obserwuje się podczas analizy zmian masy mięsa bydlęcego zarówno po peklowaniu jak i po ogrzewaniu (tab.iii). W przypadku pierwszego zabiegu nastąpił istotny w stosunku do próby kontrolnej (K) przyrost masy pozostałych prób bez względu na skład zastosowanej solanki. Nieznaczne różnice w przyroście masy między próbą peklowaną solanką azotynową (A) a fosforanową (F) odpowiadały przy tym obserwacjom poczynionym podczas pomiaru wielkości wycieku wirówkowego (tab. II i III). Zabieg ogrzewania spowodował natomiast ubytki masy, które były istotnie mniejsze w próbie peklowanej solanką węglanową (W) w porównaniu do pozostałych prób poddanych soleniu (A, F) (tab. III). Uzyskane 141
Tabela II Zmiany ilości wycieku wirówkowego oraz siły penetrowania mięsa bydlęcego Table II Changes o f centrifugal drip amount and penetration force ofbovine meat Oznaczenia próby Kind ofsample Wyciek wirówkowy Kruchość Centrifugal drip (%) Ko 23.44 - Penetration force (N) K 21.46 113.75b A 92.08b F 15.12b 67.60a W 0.54a 62.00a a,b,c - wartości średnie oznaczone w kolumnach różnymi literami różnią się istotnie przy P < 0,01; mean values in columns marked with various letters dijfer significantly at P < 0,01 4^Oocr Tabela III Zmiany masy mięsa bydlęcego po peklowaniu i ogrzewaniu Weight changes ofbovine meat after curing and cooking Table III Oznaczenia próby Kind of sample po peklowaniu after curing (%) Rodzaj zmian Type of changes po ogrzewaniu w stosunku do masy po peklowaniu after cooking in relation to weight after curing (%) po ogrzewaniu w stosunku do masy przed peklowaniem after cooking in relation to weight before curing (%) Ko - - - K (-)2,82a ( )38,25b (-)40,00 A (+)1 l,85b (-)37,39b (-)29,97b F (-)35,26b (-)27,57b W (+) 16,85 (-)30,57a ( ) 18,86a + 00 oot r a,b,c - wartości średnie oznaczone w kolumnach różnymi literami różnią się istotnie przy P < 0,01; mean values in columns marked with various letters dijfer significantly at P < 0,01 wyniki wskazują więc na wyraźne różnice w zdolności zatrzymywania wody przez mięso (WBC) i szczególnie korzystny wpływ solanki opartej na węglanach. We wcześniejszych badaniach przeprowadzonych zarówno na mięśniach bydła (Taylor i in. 1995), jak i drobiu (Tomaszewska - Gras i in. 1997) wykazano zróżnicowaną 142
szybkość rozpadu winkuliny po uboju. Taylor i in. (1995) obserwowali szybkie zmiany tego białka w m. semimembranosus i wolne w m. biceps femoris. W pierwszym z nich stwierdzili oni znaczną (prawie 50%) jego degradację już po 24 h od uboju. W drugim mięśniu rozpad winkuliny przebiegał wolniej. Jednak jeszcze po 6 dobach przechowywania obu mięśni w chłodni wykryto w nich to białko. Natomiast w przypadku badania mięśnia piersiowego z kurcząt (Tomaszewska - Gras i in. 1997) wykazano całkowitą destrukcję tego białka w ciągu 72 h od uboju. W niniejszej pracy na elektroforegramach przemytych miofibryli z mięsa tylko przechowywanego w chłodni (Ko i K) jak również poddanego peklowaniu (A, F, W) nie stwierdzono winkuliny. Jej pasmo o masie 130 kda wykryto natomiast w wycieku wirówkowym pozyskanym z mięsa po 72 h (Ko) i 120 h (K, A, F) od uboju (ryc. 1). Wynika z tego, że obok prawdopodobnej degradacji winkuliny następowało jej uwalnianie ze struktury cytoszkieletowej tkanki do otaczającego środowiska. Konsekwencją powyższego procesu było prawdopodobnie większe rozluźnienie cytoszkieletu zewnętrznego, co mogło sprzyjać poprawie wodochłonności i kruchości tkanki (tab. II). Polepszenie tych właściwości nie musiało być więc związane z degradacją winkuliny lecz z pękaniem struktur, które tworzy to białko. Warto przy tym zwrócić uwagę na fakt, że nie zaobserwowano istotnych różnic w intensywności pasma winkuliny zarówno między próbami tylko przechowywanymi (Ko i K) jak i poddanymi peklowaniu (A, F) (ryc. 1). 1 2 3 4 5 6 7 8 9 winkulina vinculin f i s Ł %, : ; r - > \ ^ ' f 1 v'.j ',*?»' ii ' r ' : y.:-. Y$ > {A v& 6r ' ' - \'v * m % v... I iy* ' ł M?' Ryc. 1 Western blotting przemytych miofibryli i wycieku z mięśnia czterogłowego uda z użyciem monoklonalnego przeciwciała winkuliny VIN-11-5. Pasmo: 1 - przemyte miofibryle z próby Ko, 2 - przemyte miofibryle z próby K, 3 - przemyte miofibryle z próby A, 4 - przemyte miofibryle z próby F, 5 - przemyte miofibryle z próby W, 6 - wyciek wirówkowy z próby Ko, 7 - wyciek wirówkowy z próby K, 8 - wyciek wirówkowy z próby A, 9 - wyciek wirówkowy z próby F Fig. 1 Western blotting of washed myofibrils and centrifugal drip from bovine ąudriceps femoris with the use of monoclonal antibody ofvinculin VIN-ll-5. Description oflanes: 1 - myofibrils from control sample (Ko) analysed 72h after slaughter, 2 - myofibrils from control sample (K) analysed 120h after slaughter, 3 myofibrils from cured meat A, 4 -myofibrils from cured meat F, 5 - myofibrils from cured meat W, 6 - centrifugal drip (cd)from Ko sample, 7 - cdfrom K sample, 8 - cdfrom A cured meat, 9 - cdfrom F cured meat 143
\ W odróżnieniu od winkuliny, we frakcji przemytych miofibryli zidentyfikowano desminę, białko o masie 53 kda (ryc. 2). Pasma tego białka nie wykryto w wycieku wirówkowym z tkanki. Porównując intensywność wybarwienia desminy między próbami tylko przechowywanymi w chłodni przez 72 h (Ko) i 120 h (K) od uboju stwierdzono wyraźnie postępującą degradację tego białka. Powyższe obserwacje są zgodne z wynikami badań Ho i wsp. (1996), którzy stwierdzili postępujący rozpad tego białka w mięśniu półścięgnistym (m. semitendinosus) bydła. Zanik pasma odpowiadającego desminie nastąpił po 7 dniach poubojowego przechowywania. Ocena rozdziałów elektroforetycznych za pomocą monoklonalnego przeciwciała desminy DE-U-10 wykazała ponadto niewielkie zróżnicowanie w intensywności pasma odpowiadającego temu białku w przypadku prób mięsa poddanych peklowaniu (ryc. 2). 1 2 3 4 5 6 7 8 9.»«*.v«/ desmina des min ««mm mm Ryc. 2 Western blotting przemytych miofibryli i wycieku wirówkowego z mięśnia czterogłowego uda z użyciem monoklonalnego przeciwciała desminy DE-U-10. Objaśnienia pasm jak na ryc. 1. Fig. 2 Western blotting ofwashed myofibrils and centrifugal drip from bovine ąudriceps femoris with the use ofmonoclonal antibody ofdesmin DE-U-10. Description oflanes - as infig 1. Intensywność ta była nawet zbliżona do pasma desminy w mięsie badanym bezpośrednio po 72 h od momentu uboju (Ko). Zastosowane solanki (A, F, W) prawdopodobnie więc ograniczały rozpad tego białka, co w konsekwencji mogło stanowić o niewielkim jego oddziaływaniu na procesy wiązania wody przez tkankę i jej kruszenia. Wnioski 1. Oddziaływanie soli peklujących na winkulinę i desminę było zróżnicowane i zależne od rodzaju białka. 2. Przechowywanie i solenie sprzyjało uwalnianiu winkuliny ze struktur cytoszkieletu badanego mięsa, co mogło wpłynąć na polepszenie kruchości i wodochłonności. 144
3. Hamowanie procesu degradacji desminy przez sole peklujące może świadczyć o niewielkim oddziaływaniu tego białka na poprawę właściwości mięsa. 4. Analiza wycieku wirówkowego z mięsa bydlęcego pozwalała na pełniejsze uchwycenie zmian w jego białkach, co było niemożliwe w oparciu o badania białek przemytych miofibryli. Piśm iennictwo 1. Chrystall B.B., Culioli J., Demeyer D., Honikel K.O., Molier A.J., Purslow P., Schwagele F., Shorthose R. and Uytterhaegen L., 1994 - Recommendation of reference methods for assessment of meat tenderness - Proc. 40th ICoMST, The Haąue, Netherlands, S-V.06. pp.1-6. 2. Fritz J.D., GreaserM.L., 1991 - Changes in titin and nebulin in postmortem bovine muscle revealed by gel electrophoresis, western blotting and immunofluorescence microscopy - J. Food Sci. 56(3), 607-610,615. 3. Grześ B., Pospiech E., Dolata K., Stefańska D., 1998 - Changes in collagen content o f cured and cooked meat - Pol. J. Food Nutr. Sci.,48(2), 221(S)-226(S). 4. Grześ B., Pospiech E., Greaser M.L., Mozdziak P.E., Sośnicki A.A., 1996 - Effect of various salts on apperance of myosin and OC-actinin in centrifugal drip of meat - Proc. 42nd ICoMST, Norway, Lillehammer, 388-389. 5. Ho C.Y., Stromer M.H., Robson R.M., 1996 - Effect of electrical stimulation on postmortem titin, nebulin, desmin and troponin-t degradation and ultrastructural changes in bovine longissimus muscle - J. Anim. Sci. 74, 1563-1575. 6. Huff-Lonergan E., Lonergan S.M., 1999 - Postmortem mechanisms of meat tenderization. The roles of the structural proteins and the calpain system - Quality Attributes of Muscle Foods. Wyd. przez Xiong Y.L., Ho Ch.T., Shahidi F., Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York, 229-251. 7. Paterson B.C., Parrish F.C.Jr., Stromer M.H., 1988 - Effects of salts and pyrophosphate on the physical and chemical properties of beef muscle. J. Food Sci. 53(5), 11258-1265. 8. Taylor R.G., Geesink G.H., Thompson V.F., Koohmaraie M., Goli D.E., 1995 - Is Z- disk degradation responsible for postmortem tenderization - Meat Sci. 40,413-423. 9. Tomaszewska-Gras J., Schreurs F., Kijowski J., 1997 - Post-mortem changes in cytoskeletal proteins of chicken breast muscles studies by fiat bed dodecyl sulfatepolyacrylamide gel elektrophoresis and western blotting - 12. Europejskie Sympozjum Jakość mięsa i produktów drobiarskich, Poznań, Streszczenia referatów i doniesień, 86-95. 10. Voisey P.W., 1976 - Engineering assesment and critiąue of instruments used for meat tenderness evaluation - J. Texture Stud. 7 (1), 11-48. Streszczenie Celem pracy było prześledzenie zmian wybranych białek cytoszkieletowych, w tym winkuliny i desminy, oraz określenie ich wpływu na kształtowanie podstawowych właściwości mięsa bydlęcego poddanego przechowywaniu i peklowaniu. Obserwację 145
białek prowadzono we frakcji miofibrylamej i w wycieku wirówkowym z tkanki przy użyciu elektroforezy SDS-PAGE i western blottingu. Wykazano zróżnicowane oddziaływanie soli peklujących na badane białka mięśniowe. Przechowywanie i solenie sprzyjało uwalnianiu winkuliny ze struktur cytoszkieletu badanego mięsa. Proces degradacji desminy był hamowany przez sole peklujące. Bożena Grześ, Edward Pospiech Changes of vinculin and desmin in cured beef and their influence on meat properties Summary The aim of the study was to evaluate changes of selected cytoskeletal proteins, particularly vinculin and desmin, and determination of their influence on basie properties of bovine meat, which was cured and stored. The observation of proteins was conducted on the fraction of washed myofibrils and centrifugal drip from muscle tissue using PAGE-SDS and western-blotting. An effect of curing salts on investigated proteins varied between them. Storage of meat and its curing favored vinculin liberation from cytoskeletal structure. The degradation of desmin was restrained by curing salts. Adresy autorów: dr inż. Bożena Grześ Akademia Rolnicza w Poznaniu Instytut Technologii Mięsa ul. Wojska Polskiego 31 60-624 Poznań, Polska Przyjęto do druku: 27 lutego 2003 prof. dr hab. Edward Pospiech Akademia Rolnicza w Poznaniu Instytut Technologii Mięsa ul. Wojska Polskiego 31 60-624 Poznań, Polska i Instytut Przemysłu Mięsnego i Tłuszczowego Dział Surowcowo Inżynieryjny w Poznaniu ul. Głogowska 239 60-111 Poznań, Polska