PRODUKCJA BIOMASY CZ. 4 Przemysł fermentacyjny dostarcza na rynek duże ilości wyrobów takich jak: wino, piwo i spirytus. Przy wyrobie tych napojów wykorzystuje się funkcje życiowe komórek drożdży, przekształcających cukry w etanol. Roztwory sacharozy mogą być bezpośrednio poddane fermentacji z udziałem drożdży, natomiast wielocukry (np. skrobia) nie ulegają fermentacji i muszą być uprzednio poddane hydrolizie do tzw. cukrów fermentujących, głównie cukrów prostych i dwucukrów metabolizowanych przez drożdże. Stężenia alkoholu uzyskiwane w odfermentowanych środowiskach nie są zbyt wysokie (przeważnie do 18% obj.). Gorzelnictwo jest to gałąź przemysłu fermentacyjnego obejmująca produkcję spirytusu surowego na drodze fermentacji alkoholowej cukrów, a następnie wydzielenie tego spirytusu z odfermentowanego zacieru w procesie destylacji. Do produkcji spirytusu wykorzystuje się wiele surowców roślinnych zawierających różne węglowodany. Można je podzielić na dwie grupy: - surowce zawierające wielocukry: ziemniaki, zboża, odpady krochmalnictwa, mąki, kasze, otręby; - surowce zawierające cukry bezpośrednio fermentujące (głównie sacharozę, glukozę, fruktozę): melas, buraki cukrowe, trzcinę cukrową, marchew, owoce świeże i suszone, odpady przemysłu owocowego. Wino jest to napój otrzymywany przez fermentację alkoholową winogron albo moszczu gronowego (wino gronowe) lub owoców, względnie moszczu owocowego (wino owocowe). Takie określenie stosowane jest w Polsce, natomiast w Unii Europejskiej kraje winiarskie zezwalają na stosowanie nazwy wino tylko w celu określenia wina gronowego wyprodukowane z owoców rosnących w ściśle określonych rejonach. Wszelkie napoje otrzymane z innych owoców niż winogrona nie mogą nazywać się winem, lecz powinny być określane w inny sposób (np. wino jabłkowe jest nazywane cydrem). - wino gronowe - napój otrzymywany przez fermentację alkoholową świeżych winogron lub moszczu gronowego. Jest to definicja ogólna, która w różnych krajach ulega pewnym zmianom, zezwalającym np. również na produkcję win z suszonych winogron. - Polskie Wino - napój o stężeniu alkoholu od 9 % do 18 % obj., otrzymany w wyniku fermentacji alkoholowej z winogron lub moszczu gronowego. Nazwa zastrzeżona dla win gronowych wyprodukowanych w Polsce. - wina owocowe - wyprodukowane z innych owoców niż winogrona, np.: z jabłek, porzeczek, agrestu, wiśni. Mogą wykazywać moc od 9 18% obj. Zasadnicza różnica pomiędzy winami gronowymi a owocowymi polega na rodzaju surowca, natomiast sposób uzyskania wina jest podobny, chociaż przy winach owocowych bardziej skomplikowany. Moszcz gronowy z dojrzałych winogron zawiera dostateczną ilość cukru do otrzymania wina o odpowiedniej mocy, zapewniającą mniejszą lub większą trwałość wina. Moszcz z innych owoców zawiera przeważnie zbyt mało cukru, a zbyt wiele kwasów i dlatego musi być we właściwy sposób doprawiony, tzn. dosłodzony i ewentualnie rozcieńczony wodą. - miody pitne - są to napoje o stężeniu alkoholu od 9 % do 18 % obj., otrzymane w wyniku fermentacji alkoholowej wodnego roztworu miodu pszczelego (brzeczki miodowej), z ewentualnym dodatkiem ziół aromatycznych lub przypraw korzennych, - napoje winopochodne są to napoje zawierające objętościowo od 4,5% do 15,0% alkoholu i zawierają minimum 50% obj. win gronowych, owocowych lub miodu pitnego. - napoje winopodobne są to napoje o stężeniu alkoholu od 9% do 15% obj., różniące się od win owocowych i miodów pitnych mniejszym udziałem soków lub miodu w nastawie, otrzymane w wyniku fermentacji alkoholowej nastawu na fermentowane napoje winiarskie inne niż Polskie Wino. Podział win w zależności od: a. Barwy: - białe o barwie od jasnożółtej lub zielonkawej do brązowej; - czerwone o barwie od jasnoczerwonej do ciemnowiśnowej; - różowe o barwie od różowej do jasnoczerwonej. b. Zawartości alkoholu: - lekkie, o mocy 9 11% obj.; - średnio mocne 11 14% obj.; - mocne 14 18% obj.; wzmocnione (alkoholizowane) o mocy powyżej 18% obj. c. Zawartości cukru (cukry redukujące po inwersji g/l): Wina gronowe Wina owocowe Wytrawne do 10 do 15 Półwytrawne powyżej 10 30 powyżej 15 30 Półsłodkie powyżej 30 60 powyżej 30 60 Deserowe słodkie powyżej 60 powyżej 60 100 Bardzo słodkie powyżej 100 Sposób produkcji wina jest nieco odmienny dla win białych, czerwonych i różowych. Przy produkcji win białych poddaje się fermentacji oddzielony od miazgi moszcz z winogron białych, natomiast przy produkcji win czerwonych fermentuje się nie
moszcz, lecz miazgę winogron czarnych, przy czym w czasie fermentacji barwniki i garbniki zawarte w skórce winogron czarnych przechodzą do moszczu, co daje wina zabarwione na czerwono o odpowiedniej cierpkości. Wina różowe produkuje się w sposób pośredni, tzn. fermentuje się miazgę winogron czarnych tylko przez bardzo krótki czas, po czym oddziela się lekko zabarwiony moszcz i poddaje dalszej fermentacji już bez miazgi. Wino może zawierać dodatek barwników spożywczych, karmelu lub cukru palonego. Wymagania normatywne dla win Ekstrakt bezcukrowy Białe i różowe Czerwone Wino jednorodne z porzeczki agrestu i jeżyny nie mniej niż [g/l] Wina gronowe 15 17 Wina owocowe 15 19 15 Wina specjalne: - wina alkoholizowane z dodatkiem alkoholu etylowego pochodzenia rolniczego lub destylatu owocowego, - wina aromatyzowane z dodatkiem dozwolonych na podstawie przepisów o warunkach zdrowotnych żywności i żywienia, ziół aromatycznych, przypraw korzennych lub naturalnych i identycznych z naturalnymi substancji aromatycznych, - wermuty gronowe wino ziołowe, Nazwa wina pochodzi od niemieckiej nazwy piołunu Wermutkraut, który jest podstawowym składnikiem wermutowych mieszanek ziołowych. Winem podstawowym jest wino białe. Oprócz piołunu w skład mieszanek ziołowych wchodzą m.in. kolendra, tatarak, tysiącznik, krwawnik, majeranek, goździki, gałka muszkatołowa, cynamon, wanilia i wiele innych, - wina musujące i gazowane są to wina pozostające w stanie silnego nasycenia dwutlenkiem węgla (ciśnienie ok. 0,4-0,5 MPa) i wykazują zwykle umiarkowaną ilość alkoholu (10 12%),. Wysoki stopień nasycenia CO 2 osiąga się przez dodatek cukru do wina i wtórną fermentacją w naczyniu zamkniętym (wina musujące), lub przez sztuczne wysycenie CO 2 z butli (wina gazowane). Rodzaje drożdży stosowanych w winiarstwie: a. Wina lekkie: (10% alkoholu): - białe Chablis (Fr), Sauternes (Fr), Riesling (D); - czerwone - Bordeaux (Fr). b. Wina stołowe: (11-14%alkoholu): - białe Bingen (H), Steinberg (D), Tokay (H), Johannisberg; - czerwone Bordeaux, Bingen, Chambertin (Fr), Burgund (Fr). c. Wina słodkie deserowe; (>14% alkoholu): - białe Bingen, Tokay, Madera (Portug.), Sherry (Hiszp.); - czerwone Portwein (Portug.), Malaga (Hiszp.), Burgund (Fr). Wady wina - są to braki obniżające jego wygląd lub smak, które dają się łatwo usunąć. Zwykle spowodowane są złą jakością surowca lub nieodpowiednim sposobem składowania moszczu. - brak klarowności (w winach trudno klarujących się: śliwkowe, gruszkowe, agrestowe), - opalescencja - lekka biało mleczna, spowodowana jest dużą zawartością substancji pektynowych lub białek i garbników (usuwa się taniną, żelatyną), - czernienie wina - spowodowane nadmiarem żelaza i garbników przy niskiej zawartości kwasów, - brunatnienie - na skutek kontaktu z powietrzem, - zbyt niska moc - poniżej 8%, - nieodpowiednia kwasowość zbyt wysoka, powyżej 12 g/l, zbyt niska, poniżej 9 g/l, - nadmierna goryczka (nadgniłe owoce) w celu korekcji należy wino dobrze wysiarkować i skupażować. Choroby wina są to zmiany wywołane działaniem i rozwojem szkodliwych drobnoustrojów, które powodują znaczne pogorszenie się wyglądu i trwałości oraz obniżenie właściwości zapachowo-smakowych. - Tworzenie się kożucha - najczęściej spotykane, spowodowane zakażeniem przez drożdże - Mycoderma vini, Candida, Hansenula, Torulopsis, Pichia, - Zaoctowanie - tzw. sztych octowy" - wywołane przez drobnoustroje tlenowe z rodzaju Acetobacter, - Fermentacja mlekowa - tzw. sztych mlekowy", objawia się zapachem kiszonej kapusty lub zsiadłego mleka oraz utratą klarowności Lactobacillus, Pediococus i Leuconostoc, - Posmak mysi myszka", a przy silnym rozwoju choroby zapach mysich ekstrementów wraz z utratą klarowności zakażenie bakteriami z rodzaju Lactobacillus lub drożdżami z rodzaju Brettanomyces, - Śluzowacenie wina - zakażenie bakteryjne z rodzaju Streptococus, Pediococus i Leuconostoc, pleśnie Aureobasidium pullulans, a także drożdże z rodzaju Pichia i Torulopsis, - Fermentacja mannitowa zmętnienie, zapach psujących się owoców, octowanie, śluzowacenie tworzy się mannitol,
kwas octowy i mlekowy. Chorobę powodują bakterie z rodzajów: Lactobacillus brevis. Destylacja prosta Destylacja jest bardzo użyteczną metodą rozdziału wieloskładnikowych mieszanin ciekłych, a tym samym oczyszczania substancji lotnych. Polega ona na odparowaniu najbardziej lotnego w danych warunkach ciśnienia i temperatury składnika, a następnie na skropleniu par i zebraniu skroplonej cieczy (destylatu). Podczas ogrzewania cieczy prężność pary wzrasta aż do momentu, gdy staje się równa ciśnieniu atmosferycznemu i rozpoczyna się wrzenie czyli parowanie w całej objętości cieczy. Temperatura wrzenia cieczy jest to więc temperatura, w której prężność par cieczy jest równa ciśnieniu atmosferycznemu. Rozróżnia się cztery typy destylacji: destylację prostą, destylację frakcyjną, destylację z parą wodną i destylację pod zmniejszonym ciśnieniem. W destylacji prostej pary cieczy poddaje się skropleniu przez bezpośrednie oziębianie, co pozwala z reguły tylko na zagęszczenie składników mieszaniny w poszczególnych coraz wyżej wrzących frakcjach. Poniższy rysunek przedstawia typowy zestaw do destylacji prostej. Kolbę destylacyjną zawierającą ciecz (i kamyczek wrzenny) umieszcza się w płaszczu grzejnym lub na łaźni wodnej. Montuje się nasadkę destylacyjną, chłodnicę (w zależności od temperatury wrzenia cieczy wodną lub powietrzną) oraz przedłużacz. Niekiedy te części aparatury stanowią całość, noszącą wówczas nazwę chłodnicy destylacyjnej. Zintegrowany w ten sposób zestaw znacznie ułatwia montaż aparatury. Chłodnicę wodną podłącza się do wody w taki sposób, aby woda wpływała niższym, a wypływała wyżej położonym tubusem. U wylotu umieszcza się odbieralnik. Może to być kolba stożkowa, kolba okrągłodenna lub butelka ze szlifem. W zasadzie nie powinno się używać zlewki. Termometr umieszcza się w ten sposób, aby zbiorniczek rtęci znajdował się naprzeciw wlotu par do chłodnicy. Szlify w zestawionej aparaturze należy posmarować cienką warstwą smaru pamiętając, że nadmiar smaru zanieczyszcza destylowaną ciecz. Istotną sprawą jest dobór odpowiedniego rozmiaru kolby destylacyjnej. Przy rozpoczęciu destylacji kolba nie powinna być napełniona więcej niż do 2/3 objętości. Dodanie kamyczka wrzennego ma na celu zapewnienie równomiernego wrzenia, ułatwia bowiem powstawanie pęcherzyków pary. Bez kamyczków wrzennych następuje przegrzewanie cieczy i jej rzucanie. Jeśli zapomniano o kamyczku wrzennym, a ciecz jest już gorąca i prawdopodobnie przegrzana, to przed dodaniem kamyczka wrzennego należy ciecz ochłodzić. W przeciwnym razie może nastąpić gwałtowne wrzenie i wyrzucenie cieczy z naczynia. Uwaga: Kamyczki wrzenne są jednorazowego użytku i po każdym przerwaniu wrzenia należy dodać świeży kawałek niepolewanej porcelany. Po rozpoczęciu wrzenia można zauważyć pierścień skraplającej się pary, podnoszący się w kolbie i nasadce. Termometr zaczyna wskazywać wzrost temperatury aż do chwili, gdy zacznie się destylacja. Ogrzewanie należy wyregulować tak, aby szybkość destylacji wynosiła 1-2 krople na sekundę. Przy silnym grzaniu duża ilość destylatu przechodzi jako niżej wrzący przedgon. Jeśli destylacja jest zbyt wolna można, to z powodu strat ciepła można nie zaobserwować prawdziwej temperatury wrzenia. Uwaga: Nigdy nie należy destylować substancji "do sucha"! I. Analiza fermentacji Wykonanie ćwiczenia 1. Opisać wygląd makroskopowy beztlenowych hodowli drożdży. 2. Oznaczyć masę kolby i poziom cieczy (porównać z masa wyjściową). 3. Określić liczbę komórek drożdży w komorze Thoma (przed pobraniem materiału hodowlę wymieszać). Komórki liczymy pod mikroskopem w komorze Thoma. W razie konieczności wykonujemy 10-krotne rozcieńczenie hodowli w płynie fizjologicznym. Przy średniej liczbie komórek w jednym kwadraciku (a) i rozcieńczeniu (n), zawartość komórek (L) w 1ml wynosi: L = 4 x 10 6 x a x n [jtk/ml]
4. Oznaczanie mocy - pomiar metodą piknometryczną Do kolby destylacyjnej odmierzyć cylindrem miarowym 150ml hodowli. Zmontować zestaw do destylacji prostej i po uruchomieniu przepływu wody przez chłodnicę, ostrożnie prowadzić destylację zbierając destylat do zlewki o objętości 100 cm 3. Destylację zakończyć z chwilą uzyskania ok. 50ml destylatu - pozostałość w kolbie destylacyjnej zachować do oznaczenia ekstraktu rzeczywistego!!! Destylat przelać do cylindra miarowego o pojemności 100 cm 3 i uzupełnić wodą destylowaną do poziomu co najmniej 50 cm 3 (zanotować dokładną ilość destylatu i dodanej wody). Czysty i suchy piknometr zważyć na wadze analitycznej, następnie napełnić go wodą destylowaną o temp. ok. 20 C i ponownie zważyć. Tak samo postąpić z otrzymanym destylatem napełnić piknometr i zważyć. Gęstość destylatu (d) obliczyć ze wzoru: d = P 1 P 2 + m P 2 P 0 + m P 0 masa piknometru pustego [g] P 1 masa piknometru z destylatem o temperaturze 20 0 C [g] P 2 masa piknometru z wodą o temperaturze 20 0 C [g] m poprawka na ważenie w powietrzu, która wynosi 0,0012 Na podstawie gęstości destylatu odczytać zawartość alkoholu etylowego z tablic (załącznik) - pomiar metodą areometryczną Otrzymany destylat przelać do cylindra i zmierzyć zawartość alkoholu za pomocą areometru Trallesa (alkoholomierza). W tym celu 30-40ml destylatu wlać do cylindra szklanego i powoli włożyć areometr. Po 1-2 minutach odczytać stężenie alkoholu. - pomiar metodą refraktometryczną Oznaczyć stężenie procentowe alkoholu w destylacie za pomocą refraktometru. 5. Oznaczanie ekstraktu rzeczywistego - pomiar metodą areometryczną Pozostałość po destylacji przenieść do cylindra miarowego o pojemności 250 cm 3 i dopełnić wodą destylowaną do 150 cm 3 i oznaczyć zawartość ekstraktu rzeczywistego za pomocą areometru Ballinga. Ok. 30-40ml roztworu przelać do cylindra szklanego i powoli włożyć areometr. Po 1-2 minutach odczytać zawartość ekstraktu. - pomiar metoda refraktometryczną Pomiar wykonujemy refraktometrem lunetowym MASTER-TA z automatyczną kompensacją temperatury. W tym celu podnosimy osłonę pryzmatu, pipetą nanosimy ok. 1 ml roztworu tak, aby zamykając osłonę ciecz równomiernie, bez pęcherzyków powietrza pokryła cały pryzmat. Następnie patrząc przez lunetkę odczytujemy wynik w 0 Brix.. (skala po lewej stronie w 0 Brix, skala po prawej stronie 0 T.A.) Po wykonaniu pomiaru refraktometr dokładnie płuczemy pod bieżącą wodą i wycieramy delikatnie do sucha papierowym ręcznikiem. II. Opracowanie wyników Wykonać następujące obliczenia: - w oparciu o zawartość ekstraktu przed i po destylacji obliczyć na podstawie poniższego równania reakcji stężenie etanolu wytworzonego przez drożdże C 12 H 22 O 11 + H 2 O 4C 2 H 5 OH + CO 2 - w oparciu o moc uzyskanego destylatu (metody piknometryczna, areometryczna, nefelometryczna) obliczyć stężenie etanolu wytworzonego przez drożdże. Uzyskane wyniki wraz z opisanymi wnioskami zamieścić w sprawozdaniu. III. Zagadnienia teoretyczne: - destylacja prosta.
- temperatura wrzenia - podział win - drożdże stosowane do wyrobu wina - wady i choroby wina IV. Literatura: 1. Kunicki-Goldfinger W.; Życie bakterii; Wyd. PWN; Warszawa; 1998 2. Libudzisz Z. Kowal K.; Mikrobiologia techniczna; Wyd. Politechniki Łódzkiej; 2000 3. Bednarski W., Reps A.; Biotechnologia żywności; WNT; Warszawa; 2003. Zależność pomiędzy gęstością wodnych roztworów etanolu w 20 C, a udziałem objętościowym etanolu d, kg/m 3 Udział obj., % d, kg/m 3 Udział obj., % d, kg/m 3 Udział obj., % d, kg/m 3 Udział obj., % 789,3 100,00 842 85,95 895 66,12 948 40,01 790 99,86 843 85,62 896 65,69 949 39,38 791 99,66 844 85,29 897 65,27 950 38,75 792 99,46 845 84,96 898 64,85 951 38,11 793 99,26 846 84,62 899 64,42 952 37,45 794 99,06 847 84,28 900 63,99 953 36,78 795 98,85 848 83,94 901 63,56 954 36,11 796 98,63 849 83,60 902 63,13 955 35,41 797 98,42 850 83,26 903 62,70 956 34,71 798 98,21 851 82,91 904 62,26 957 34,00 799 98,00 852 82,57 905 61,82 958 33,26 800 97,76 853 82,22 906 61,38 959 32,52 801 97,53 854 81,87 907 60,94 960 31,75 802 97,30 855 81,52 908 60,50 961 30,98 803 97,08 856 81,16 909 60,05 962 30,18 804 96,84 857 80,81 910 59,60 963 29,35 805 96,59 858 80,45 911 59,16 964 28,52 806 96,35 859 80,10 912 58,70 965 27,67 807 96,11 860 79,74 913 58,25 966 26,83 808 95,86 861 79,38 914 57,80 967 25,96 809 95,61 862 79,02 915 57,33 968 25,09 810 95,36 863 78,65 916 56,87 969 24,19 811 95,11 864 78,29 917 56,40 970 23,29 812 94,85 865 77,92 918 55,93 971 22,38 813 94,58 866 77,53 919 55,46 972 21,46 814 94,32 867 77,18 920 54,99 973 20,53 815 94,06 868 76,81 921 54,50 974 19,59 816 93,79 869 76,43 922 54,02 975 18,64 817 93,52 870 76,06 923 53,54 976 17,69 818 93,24 871 75,68 924 53,05 977 16,76 819 92,97 872 75,30 925 52,56 978 15,85 820 92,69 873 74,92 926 52,08 979 14,95 821 92,41 874 74,54 927 51,57 980 14,05 822 92,12 875 74,15 928 51,07 981 13,17 823 91,84 876 73,77 929 50,57 982 12,31 824 91,54 877 73,30 930 50,07 983 11,45 825 91,25 878 73,00 931 49,56 984 10,61 826 90,96 879 72,60 932 49,04 985 9,77 827 90,66 880 72,21 933 48,52 986 8,94 828 90,36 881 71,82 934 48,00 987 8,13 829 90,07 882 71,42 935 47,47 988 7,33 830 89,76 883 71,03 936 46,93 989 6,55 831 89,45 884 70,63 937 46,39 990 5,70 832 89,15 885 70,23 938 45,85 991 5,02 833 88,84 886 69,83 939 45,28 992 4,29 834 88,52 887 69,42 940 44,74 993 3,58 835 88,21 888 69,02 941 44,17 994 2,87 836 87,89 889 68,60 942 43,60 995 2,17 837 87,57 890 68,19 943 43,03 996 1,49 838 87,25 891 67,78 944 42,44 997 0,81 839 86,93 892 67,37 945 41,84 998 0,13 840 86,60 893 66,95 946 41,24 998,2 0,00 841 86,27 894 66,53 947 40,62