MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2013, 65: 87-91 Ocena aktywności lipolitycznej szczepów Enterococcus faecium The evaluation of lipolytic activity of strains of Enterococcus faecium Joanna Wróblewska, Sylwia Kożuszko, Eugenia Gospodarek Katedra i Zakład Mikrobiologii Collegium Medicum im. L. Rydygiera w Bydgoszczy Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu Oceniono lipolityczną aktywność 45 szczepów Enterococcus faecium izolowanych z krwi, płynów z jamy brzusznej oraz materiału ropnego (wymaz z rany i ropy), na podłożu agarowym wzbogaconym estrem kwasu tłuszczowego (Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 80) oraz egg yolk. Szczepy E. faecium istotnie częściej wykazywały aktywność lipolityczną na podłożu wzbogaconym w Tween 20 niż z dodatkiem Tween 40, Tween 60, Tween 80 i egg yolk. Nie wykazano statystycznie istotnych różnic w zależności od miejsca izolacji badanych szczepów. Słowa kluczowe: aktywność lipolityczna, Enterococcus faecium ABSTRACT Introduction: Little is known about the involvement of hydrolytic enzymes such as lipases as virulence factors in infections involving Enterococcus spp. Methods: A total of 45 isolates of E. faecium were investigated. Lipolytic activity of enterococcal strains was determined by Tryptic Soy Agar containing Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 80 and egg yolk. Results: We detected that E. fecium strains produced lipases more frequently on Tween 20 agar (71.1% strains) than on Tween 40 agar, Tween 60 agar, Tween 80 agar, egg yolk agar (respectively 33.3%, 24.4%, 20.0%, 31.1%). Our results indicate that lipase may be a virulence factor in E. faecium. Conclusions: Studies suggest that source of isolation from clinical materials (blood, wound and fluid from the abdominal cavity) does not have an influence on the ability hydrolysis esters. Key words: lipolytic activity, Enterococcus faecium
88 J. Wróblewska, S. Kożuszko, E. Gospodarek Nr 2 WSTĘP Paciorkowce z rodzaju Enterococcus uznawane są za fizjologiczną mikroflorę dolnego odcinka układu pokarmowego. W ciągu ostatnich dwóch dekad stały się istotnym czynnikiem zakażeń szpitalnych o wzrastającej częstości występowania, co wiąże się z narastającą opornością na antybiotyki, jak również obecnością czynników wirulencji, które wpływają na przebieg zakażenia (3, 5, 9). Enzymy zewnątrzkomórkowe, np. lipazy uważane są za istotny czynnik wirulencji bakterii. Lipazy to enzymy hydrolityczne, które są odpowiedzialne, między innymi, za hydrolizę estrów. Zdolność szczepów bakteryjnych do hydrolizy substratów tłuszczowych może mieć wpływ na umożliwienie przeżycia bakterii w różnych warunkach środowiskowych (15). Celem pracy była ocena wpływu rodzaju substratu na aktywność lipolityczną badanych szczepów E. faecium, oraz porównanie aktywności lipolitycznej badanych szczepów w zależności od ich miejsca izolacji. MATERIAŁ I METODY S z c z e p y b a k t e r i i. Badaniem objęto 45 szczepów E. faecium izolowanych z materiału klinicznego w Zakładzie Mikrobiologii Klinicznej Szpitala Uniwersyteckiego nr 1 im. dr. A. Jurasza Collegium Medicum w Bydgoszczy, Uniwersytetu Mikołaja Kopernika w Toruniu i poradniach przyklinicznych tego szpitala. Każdy izolat pochodził od innego pacjenta. Z materiału ropnego (wymaz z rany, ropy) zidentyfikowano 24 szczepy, z krwi - 11 i 10 szczepów z płynów z jamy brzusznej. Szczepy do gatunku identyfikowano na podstawie wyników reakcji biochemicznych ujętych w kartach GP systemu VITEK 2 Compact (biomérieux). W y t w a r z a n i e e n z y m ó w l i p o l i t y c z n y c h. Zdolność do wytwarzania enzymów lipolitycznych oceniono według metody Burbianka i wsp. (4). Szczepy enterokoków posiewano poprzez wkłucie w podłoże TSA (Tryptic Soy Agar, Becton-Dickinson) z dodatkiem 1% roztworu: Tween 20 (roztwór zawierający ester kwasu laurynowego, o liczbie atomów węgla w reszcie kwasu tłuszczowego 12) (Sigma), Tween 40 (roztwór zawierający ester kwasu palmitynowego, o liczbie atomów węgla w reszcie kwasu tłuszczowego 16) (Sigma), Tween 60 (roztwór zawierający ester kwasu stearynowego, o liczbie atomów węgla w reszcie kwasu tłuszczowego 18) (Sigma) lub Tween 80 (roztwór zawierający ester kwasu oleinowego, o liczbie atomów węgla w reszcie kwasu tłuszczowego 18) (Sigma) oraz 0,5% egg yolk (Sigma). Kontrolę stanowiły te same szczepy posiane na podłożu TSA bez dodatku substratów kwasu tłuszczowego. Po 6 dobach inkubacji w temperaturze 37 o C oceniono zdolność badanych szczepów do hydrolizy tłuszczów w warunkach tlenowych. O wyniku dodatnim, uwarunkowanym zdolnością danego szczepu do wytwarzania zewnątrzkomórkowej lipazy, świadczyło pojawienie się stref zmętnienia wokół kolonii bakterii. O b l i c z e n i a s t a t y s t y c z n e. Zastosowano test dwóch frakcji, w modyfikacji uwzględniającej próbki o niskiej liczebności. W celu weryfikacji hipotezy o równości frakcji obliczano wartość statystyki U opartej na przekształceniu arcus sinus. Funkcja arc sin x jest wyrażona w stopniach. Statystyka U ma w przybliżeniu rozkład normalny (Gaussa), a wartości p < 0,04 są istotne statystycznie (11).
Nr 2 Lipolityczna aktywność E. faecium 89 WYNIKI Lipolityczne właściwości badanych szczepów E. faecium przedstawiono w tabeli I. Wśród szczepów E. faecium ogółem aktywność lipolityczną wykazywało 32 (71,1%) szczepy. Wszystkie szczepy wykazujące aktywność lipolityczną na podłożu z dodatkiem Tween 20, hydrolizowały również Tween 40, Tween 60, Tween 80 i egg yolk. Dwa szczepy izolowane z płynu z jamy brzusznej hydrolizowały estry kwasów tłuszczowych i egg yolk. Żaden szczep izolowany z krwi nie wykazywał aktywności lipolitycznej na wszystkich badanych podłożach. Cztery (16,6%) szczepy wyosobnione z materiału ropnego hydrolizowały Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 80 i egg yolk. Dodatek substratu umożliwiającego ocenę aktywności lipolitycznej wpływał znacząco na ocenę zdolności hydrolizy estrów kwasów tłuszczowych i egg yolk przez szczepy E. faecium, tzn. szczepy E. faecium znamiennie częściej wykazywały aktywność lipolityczną, gdy w ocenie uwzględniono podłoże wzbogacone w Tween 20 w porównaniu z Tween 40, Tween 60, Tween 80 i egg yolk (p < 0,0001). Tabela I. Aktywność lipolityczna E. faecium. Rodzaj materiału Ogólna liczba szczepów TSA z dodatkiem: Tween 20 Tween 40 Tween 60 Tween 80 Egg yolk n % n % n % n % n % Płyn z jamy brzusznej 10 7 70,0 2 20,0 2 20,0 2 20,0 3 30,0 Krew 11 8 72,7 4 36,7 2 18,2 0 0,0 2 18,2 Materiał ropny 24 17 70,8 9 37,5 7 29,1 7 29,1 9 37,5 Ogółem 45 32 71,1 15 33,3 11 24,4 9 20,0 14 31,1 n - liczba szczepów wykazujących aktywność lipolityczną Nie wykazano statystycznie istotnych różnic porównując aktywność lipolityczną szczepów izolowanych z wymazów z ran i ropy w porównaniu do szczepów, które pochodziły z krwi i płynów z jamy brzusznej (p > 0,05). DYSKUSJA Dane o lipolitycznej aktywności enterokoków są ograniczone i często sprzeczne, a aktywność lipolityczna określana jest najczęściej dla gatunków niechorobotwórczych izolowanych ze środków spożywczych (1, 7, 14) i porównywana do aktywności lipolitycznej szczepów z rodzaju Lactococcus sp. i Lactobacillus sp. (10). Do badania lipolitycznej aktywności w niniejszej pracy wykorzystano podłoże TSA odpowiednio wzbogacone w Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 80 i egg yolk. Wzrost liczby atomów węgla w kwasie tłuszczowym wchodzącym w skład Tween, wpłynął znacząco w sposób hamujący na zdolność hydrolizy danego estru, co jest zgodne z wynikami badań innych autorów (10). Moreno i wsp. (10) wykazali, że krótkie kwasy tłuszczowe o liczbie atomów węgla w reszcie kwasu tłuszczowego 3, 4, 6 i 10, stymulują aktywność lipolityczną szczepów E. faecalis, natomiast nienasycone kwasy tłuszczowe, np. kwas oleinowy nie są
90 J. Wróblewska, S. Kożuszko, E. Gospodarek Nr 2 dobrym substratem dla oceny aktywności lipolitycznej. Odmienne wyniki otrzymali Sarantinopoulos i wsp. (12), którzy badali 129 szczepów enterokoków i wykazali, że 90,0% szczepów E. faecium hydrolizowało estry zawierające kwasy tłuszczowe o liczbie atomów węgla od czterech do 18. Barbosa i wsp. (2) badali 44 szczepy E. faecium izolowane z tradycyjnie fermentowanych produktów mięsnych. Zastosowali oni hodowlę z dodatkiem substratu umożliwiającego ocenę hydrolizy estrów kwasów tłuszczowych (autorzy nie podali w publikacji jaki to substrat). Żaden szczep E. faecium nie wykazywał aktywności lipolitycznej. Arizcun i wsp. (1) oceniając częstość występowania lipaz u enterokoków, badali dwa szczepy E. faecium, które nie wykazywały aktywności lipolitycznej. Wyniki uzyskali posługując się komercyjnymi testami Api - zym. Nieliczni autorzy opublikowali wyniki dotyczące oceny zdolności hydrolizy estrów przez szczepy z rodzaju Enterococcus m.in. E. faecalis i E. fecium wyosobnione z materiału klinicznego. Z badań własnych wynika, że w ocenie aktywności lipolitycznej nie jest istotne pochodzenie szczepu. Semedo i wsp. (13) porównali aktywność lipolityczną enterokoków izolowanych z materiału klinicznego i z żywności. Stwierdzili, że aktywność lipolityczna ogółem występuje u 49,0% szczepów, przy czym 63,0% szczepów izolowano z żywności. Odsetek szczepów rozkładających estry kwasów tłuszczowych był następujący: 51,0% u E. faecalis, 16,0% u E. durans i 11,0% u E. faecium. Aktywności lipolitycznej nie stwierdzono wśród następujących gatunków enterokoków: E. avium, E. durans, E. faecium, E. hirae, E. mundtii, E. pseudoavium i E. sulfureus. Elsner i wsp. (6) wykazali, że 31 (35,0%) szczepów E. faecalis i jeden szczep E. faecium, które izolowano z krwi wykazywały aktywność lipolityczną. Były to odsetki znacznie niższe niż otrzymane w obecnych badaniach. Przeprowadzone w niniejszej pracy badania sugerują, że aktywność lipolityczna jest powszechną cechą szczepów E. faecium. Nasze wyniki wskazują, że lipazy mogą być czynnikiem wirulencji u E. faecium. Różnice w otrzymanych wynikach mogą być związane z tym, że bakteryjne lipazy według Hasan i wsp. (8), wykazują różnice we właściwościach biochemicznych i katalitycznych, spowodowanych wybiórczością substratu. W dalszych badaniach należy wyjaśnić znaczenie omawianego czynnika wirulencji w patogenezie zakażeń enterokokowych. WNIOSKI 1. Aktywność lipolityczna jest cechą powszechną wśród szczepów E. faecium. 2. Rodzaj materiału, z którego izolowano szczepy E. faecium nie ma bezpośredniego wpływu na ujawnienie zdolności hydrolizy estrów kwasów tłuszczowych oraz egg yolk. 3. Najlepszym substratem w ocenie aktywności lipolitycznej szczepów E. faecium okazał się ester kwasu laurynowego. PIŚMIENNICTWO 1. Arizcum C, Barcina Y, Torre P. Identification and characterization of proteolytic activity of Enterococcus spp. isolated from milk and Roncal and Idiazábal cheese. Int J Food Microbiol 1997, 38: 17 24
Nr 2 Lipolityczna aktywność E. faecium 91 2. Barbosa J, Gibbs PA, Teixeira P. Virulence factors among enterococci isolated from traditional fermented meat products produced in the North of Portugal. Food Control 2010, 21: 651 6 3. Bronk M, Samet A. Szpitalne bakteriemie enterokokowe. Post Mikrobiol 2008, 47: 339-44 4. Burbianka M, Pliszka A, Burzyńska S. Mikrobiologia żywności. Wydawnictwo Lekarskie PZWL. Warszawa 1983 5. Cetinkaya Y, Falk P, Mayhall CG. Vancomycin-resistant enterococci. Clin Microbiol Rev 2000, 13: 686-707 6. Elsner HA, Sobottka I, Mack D i inni. Virulence factors of Enterococcus faecalis and Enterococcus faecium blood culture isolates. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2000, 19: 39 42 7. Giraffa G. Functionality of enterococci in dairy products. Int J Food Microbiol 2003, 88: 215 22 8. Hasan F, Shah AA, Hameed A. Methods for detection and characterization of lipases: A comprehensive review. Biotechnol Adv 2009, 27: 782 98 9. Jett BD, Huycke MM, Gilmore MS. Virulence of enterococci. Clin Microbiol Rev 1994, 7: 462-78 10. Moreno MRF, Sarantinopoulos P, Tsakalidou E, De VuystL. The role and application of enterococci in food and health. Int J Food Microbiol 2006, 106: 1 24 11. Sachs L. Applied Statistics. Berlin Springer Verlg 1982. 12. Sarantinopoulos P, Kalantzopoulos G, Tsakalidou E. Effect of Enterococcus faecium on microbiological, physicochemical and sensory characteristics of Greek Feta cheese. Int J Food Microbiol 2002, 76: 93 105 13. Semedo T, Santos MA, Lopes MFS i inni. Virulence Factors in Food, Clinical and Reference Enterococci: A Common Trait in the Genus? System Appl Microbiol 2003, 26: 13 22 14. Serio A, Chaves-López C, Paparella A., Suzzi G. Evaluation of metabolic activities of enterococci isolated from Pecorino Abruzzese cheese. Int Dairy J 2010, 20: 459-64 15. Stehr F, Kretschar M, Kröger C i inni. Microbial lipases as virulence factors. J Mol Catal B-Enzym 2002: 22: 347 55 Otrzymano: 4 VII 2013 r. Adres Autora: 85-094 Bydgoszcz, ul. Skłodowskiej-Curie 9, Katedra i Zakład Mikrobiologii, Collegium Medium im. L. Rydygiera w Bydgoszczy, Uniwersytetu Mikołaja Kopernika w Toruniu