WŁAŚCIWOŚCI MORFOLOGICZNYCH WARIANTÓW PAŁECZEK ESCHERICHIA COLI

MED. DOŚW. MIKROBIOL., 21, 62: 51-58 Patrycja Zalas-Więcek, Eugenia Gospodarek, Dorota Kamińska WŁAŚCIWOŚCI MORFOLOGICZNYCH WARIANTÓW PAŁECZEK ESCHERICHIA COLI Katedra i Zakład Mikrobiologii Collegium Medicum im. Ludwika Rydygiera w Bydgoszczy Uniwersytetu Mikołaja Kopernika w Toruniu Kierownik: dr hab. n. med. E. Gospodarek, prof. UMK Porównano lekowrażliwość, właściwości adhezyjne oraz wzory chromosomalnego DNA morfologicznych wariantów kolonii pałeczek Escherichia coli. U 9,% z nich stwierdzono różnice we wrażliwości na antybiotyki. Zdolnością adhezji do cewników moczowych różniło się 4,% wariantów. Warianty o morfologii kolonii jasnych w wyższym odsetku niż warianty o morfologii kolonii ciemnych adherowały do wszystkich objętych badaniem cewników. Metodą PFGE u 35% wariantów wykazano 1% podobieństwa genetycznego. Pozostałe warianty były blisko ze sobą spokrewnione. Zróżnicowanie kolonii wśród szczepów bakteryjnych opisywano już w pierwszej połowie XX wieku (5). Od tego czasu powstało wiele hipotez dotyczących przyczyn występowania i znaczenia tego zjawiska w biologii drobnoustrojów. Podejrzewa się, że przyczyną powstawania wariantów morfologicznych (morfotypów) są m. in., warunki stresowe panujące w środowisku lub w żywym organizmie, które mobilizują bakterie do wytworzenia cech umożliwiających im adaptację i przeżycie w niesprzyjających warunkach (2, 4). Oceniając biologiczne właściwości morfotypów niejednokrotnie wykazywano różnice, jednak pewne cechy pozostawały dla nich wspólne (8, 12). Dlatego celem pracy było porównanie lekowrażliwości, właściwości adhezyjnych oraz wzorów chromosomalnego DNA morfologicznych wariantów kolonii pałeczek Escherichia coli. MATERIAŁ I METODY Materiał. Materiał do badań stanowiło 1 spośród 159 szczepów E. coli (badanych w kierunku zdolności do tworzenia wariantów morfologicznych) izolowanych w Katedrze i Zakładzie Mikrobiologii Szpitala Uniwersyteckiego nr 1 im. dr A. Jurasza Collegium Medicum im. Ludwika Rydygiera w Bydgoszczy Uniwersytetu Mikołaja Kopernika w Toruniu (SU CM UMK), w latach 23-26. Szczepy wyosobniono od chorych leczonych w klinikach i poradniach SU CM UMK. Każdy szczep pochodził od innego chorego. Szczepy te wzrastały na podłożu MacConkeya (Becton Dickinson) w postaci dwóch rodzajów kolonii

52 P. Zalas-Więcek, E. Gospodarek, D. Kamińska Nr 1 jasnych i ciemnych. Identyfikację, ocenę lekowrażliwości oraz ocenę właściwości adhezyjnych prowadzono dla ich poszczególnych wariantów morfologicznych. Metody. W identyfikacji szczepów uwzględniano następujące cechy: morfologię kolonii na podłożu MacConkey Agar, zdolność fermentacji laktozy, wytrącanie dezoksycholanu sodu. W celu potwierdzenia zdolności wytwarzania tryptofanazy przy jednoczesnym wykluczeniu zdolności wytwarzania ureazy, wykorzystano podłoże z mocznikiem i L-tryptofanem (L-tryptofan 3 g/l, mocznik 2 g/l, KH 2 PO 4 2 g/l, czerwień krezolowa,2% r-r w 5% alkoholu etylowym, NaCl 5 g/l, pepton Difco 1 g/l, agar czysty 2 g/l, H 2 O destylowana). Dla szczepów laktozo-ujemnych przynależność gatunkową określano z użyciem kart do identyfikacji drobnoustrojów Gram-ujemnych (GNI+) (biomérieux), które odczytywano za pomocą automatycznego systemu VITEK (biomérieux). Oznaczanie lekowrażliwości wariantów morfologicznych szczepów E. coli. Wrażliwość pałeczek E. coli na antybiotyki i chemioterapeutyki oceniano metodą krążkowo-dyfuzyjną na podłożu Mueller Hinton 2 Agar (MHA) (Becton Dickinson). Stosowano krążki z następującymi antybiotykami i chemioterapeutykami: ampicylina (1 μg), tikarcylina (75 μg), piperacylina (1 μg) (Becton Dickinson), ampicylina z sulbaktamem (1/1 μg) (Mast Diagnostics), tikarcylina z kwasem klawulanowym (75/1 μg) (Oxoid), piperacylina z tazobaktamem (1/1 μg) (Mast Diagnostics), cefalotyna (3 μg), cefazolina (3 μg), cefoksytyna (3 μg), cefprozil (3 μg), cefuroksym (3 μg), cefoperazon (75 μg), cefpodoksym (1 μg), cefotaksym (3 μg), ceftazydym (3 μg) (Becton Dickinson), cefepim (3 μg) (Mast Diagnostics), aztreonam (3), imipenem (1 μg) (Mast Diagnostics), gentamicyna (1 μg) (Becton Dickinson), tobramycyna (1 μg), amikacyna (3 μg) (Oxoid), netilmicyna (3 μg), tetracyklina (3 μg) (Mast Diagnostics), ofloksacyna (5 μg), ciprofloksacyna (5 μg) (Becton Dickinson), chloramfenikol (3 μg), fosfomycyna (2 μg) (Mast Diagnostics), nitrofurantoina (3 μg), trimetoprim/sulfametoksazol (1,25/23,75 μg) (Becton Dickinson). Krążki dobierano zgodnie z rekomendacjami Krajowego Ośrodka Referencyjnego ds. Lekowrażliwości Drobnoustrojów (KORLD) (9). Dodatkowo zastosowano krążki zawierające cefoperazon z sulbaktamem (3/75 μg) (Becton Dickinson). Inkubację prowadzono przez 18-2 godzin w temperaturze 35 C, w atmosferze tlenowej. Strefy zahamowania wzrostu bakterii wokół krążków z antybiotykami interpretowano jako wrażliwy, średnio wrażliwy, oporny zgodnie z obowiązującymi zaleceniami Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) (13). W celu kontroli poprawności wykonania oznaczenia lekowrażliwości stosowano szczep wzorcowy z Amerykańskiej Kolekcji Kultur Typowych (ang. American Type Culture Collection, ATCC) E. coli ATCC 25922. Ocena adhezji wariantów morfologicznych szczepów E. coli do cewników moczowych wykonanych z różnych materiałów syntetycznych. W badaniu użyto cewników moczowych wykonanych z różnych materiałów syntetycznych: cewnik Foley a (lateks, L), cewnik Foley a (lateks silikonowany, LS), cewnik Nelaton (polichlorek winylu, PCV). Ocenę adhezji pałeczek E. coli do cewników moczowych wykonano stosując metodę opisaną przez Richardsa i wsp. (wg 1) w modyfikacji własnej. Z 2-godzinnej hodowli na podłożu MacConkey Agar wykonywano zawiesinę o gęstości,5 według skali MacFarlanda w jałowym bulionie mózgowo-sercowym (ang. Brain Heart Infusion Broth, BHI, Becton Dickinson). Następnie umieszczano w niej 1,5-cm. fragment jałowego cewnika moczowego i inkubowano 24 godziny w temperaturze 37 C.

Nr 1 Morfologiczne warianty E. coli 53 Cewnik przemywano dwukrotnie PBS o ph 7,2, przenoszono do 3 ml jałowego podłoża BHI i dodawano jedną kroplę 1% wodnego roztworu chlorku 2,3,5 - trójfenylotetrazoliowego (TTC, Sigma). Po dwóch godzinach inkubacji w temperaturze 37 C oceniano obecność czerwonego formazanu powstającego w reakcji redukcji TTC prowadzonej przez aktywne metabolicznie drobnoustroje. Przyjęto następującą skalę umowną: brak adhezji brak zmiany zabarwienia cewnika, słaba adhezja lekkie punktowe zaróżowienie powierzchni cewnika, średnia adhezja zaróżowienie powierzchni cewnika, silna adhezja silne zaczerwienienie powierzchni cewnika. Kontrolę stanowiły jałowe cewniki moczowe umieszczone w jałowym podłożu BHI, z którymi postępowano tak, jak z próbą badaną. Ocena genetycznego podobieństwa morfologicznych wariantów szczepów E. coli. Ocenę genetycznego podobieństwa morfologicznych wariantów E. coli prowadzono metodą elektroforezy w zmiennym polu elektrycznym (Pulsed-Field Gel Electrophoresis, PFGE). Typowanie morfotypów E. coli prowadzono z użyciem metody opisanej przez Ejrnaes i wsp. (6) z własną modyfikacją. Z 2-godzinnych hodowli prowadzonych w temperaturze 37 C na agarze MacConkeya wykonano zawiesiny bakteryjne w,9% NaCl o gęstości 2 według skali MacFarlanda. Do jałowych probówek typu Eppendorf przenoszono po 1 ml zawiesiny, wirowano 2 minuty przy 12 RPM. Uzyskany supernatant odpipetowywano, a osad zawieszano w 15 μl buforu TE1 (1 mm Tris-HCl, ph 8,, 1 mm EDTA ph 8,). Zawiesinę komórek bakteryjnych mieszano z taką samą objętością 2,% agarozy (ang. Low Melting Point, LMP) (BioRad) i umieszczano w foremkach do bloczków. Po zestaleniu w temperaturze 4 C przez 2 minut, uformowane bloczki inkubowano 18-2 godzin w temperaturze 54 C w 1 ml buforu litycznego (5 mm Tris-HCl, ph 8,, 5 mm EDTA, ph 8,, 1% laurylosarkosyl) z 53 μl proteinazy K o stężeniu 19 mg/ml (Fermentas). Następnie przemywano je trzykrotnie w jałowej wodzie destylowanej i dwukrotnie w buforze TE2 (1 mm Tris-HCl, ph 8,, 1 mm EDTA, ph 8,), po 3 minut w temperaturze pokojowej w warunkach łagodnego mieszania. Przed etapem restrykcji bloczki przemywano w buforze Tango (Fermentas). Trawienie DNA chromosomalnego prowadzono przez 2 godzin w temperaturze 37 C w buforze Tango przy pomocy enzymu restrykcyjnego Xba I (Fermentas) w końcowym stężeniu 5 U/ml. Bloczki przemywano w buforze TE2, a następnie w buforze,5 x TBE (1, M Tris base,,9 M Boric acid, 1 mm EDTA, ph 8,4) (BioRad) w temperaturze pokojowej. W kolejnym etapie badań wykorzystywano ½ każdego bloczka. Rozdział DNA chromosomalnego prowadzono w 1% żelu agarozowym (ang. Pulsed Field Certified Agarose) (BioRad), w buforze,5 x TBE z dodatkiem 2 ml 1 mm roztworu tiomocznika (Thiourea) (Sigma), z wykorzystaniem aparatu CHEF Mapper (BioRad). Zastosowano następujące warunki elektroforezy: czas trwania pulsu 2-35 sekund, napięcie 6 V, kąt 12, temperatura 14 C. Elektroforezę prowadzono przez 2 godzin. Wzorzec wielkości fragmentów DNA stanowił Lambda Ladder Standard (LL) (BioRad). Po zakończeniu elektroforezy żel barwiono roztworem bromku etydyny (Sigma) (2 minut), a następnie przemywano w wodzie destylowanej (3 minut). Wyniki rozdziału DNA obserwowano i fotografowano w świetle UV (Gel Doc 2) (BioRad). Dane archiwizowano w programie Quantity One (BioRad). Uzyskane wyniki analizowano przy użyciu programu Molecular Analyst Fingerprint (BioRad). W celu ustalenia podobieństwa wariantów morfologicznych stosowano następujące parametry: współczynniki Dice, tolerancja położenia

54 P. Zalas-Więcek, E. Gospodarek, D. Kamińska Nr 1 1,5%. Za identyczne uznano warianty, które wykazały 1% podobieństwa w dendrogramie wykreślonym z zastosowaniem wyżej wymienionego programu. Metody statystyczne. W celu zbadania zależności między dwiema zmiennymi zastosowano: test χ 2 (gdy liczebność próby była większa od 4 oraz wszystkie oczekiwane liczebności były nie mniejsze niż 5), test χ 2 z poprawką Yatesa (gdy liczebność próby była większa niż 4 oraz którakolwiek z oczekiwanych liczebności była mniejsza niż 5) i dokładny test Fishera (gdy liczebność próby była nie większa niż 2) (14). Celem stwierdzenia istnienia różnic między dwiema zmiennymi skorzystano z testu dwóch wskaźników struktury (11, 14). Wszystkie testy przeprowadzono przy ustalonym poziomie istotności α=,5. WYNIKI Ocena wrażliwości na antybiotyki i chemioterapeutyki morfologicznych wariantów szczepów E. coli. Różnice we wrażliwości na antybiotyki stwierdzono u 9,% wariantów morfologicznych (Tabela. I). Warianty o morfologii kolonii jasnych były w wyższym odsetku wrażliwe na cefalotynę, cefpodoksym, tetracyklinę i fosfomycynę, a warianty o morfologii kolonii ciemnych w wyższym odsetku wrażliwe na amoksycylinę z kwasem klawulanowym i piperacylinę z tazobaktamem, cefazolinę, cefprozil i cefoperazon (Tabela I). Różnice te nie były znamienne statystycznie. Ocena adhezji do cewników moczowych morfologicznych wariantów szczepów E. coli. Warianty o morfologii kolonii jasnych w wyższym odsetku adherowały do wszystkich uwzględnionych w badaniu cewników moczowych niż warianty o morfologii kolonii ciemnych (Ryc. 1). Cztery (4,%) spośród 1 par badanych wariantów morfologicznych wykazywały różnice w adhezji do cewników (Ryc. 2). Warianty o morfologii kolonii jasnych i ciemnych w najwyższym odsetku silnie adherowały do cewników z PCV (odpowiednio, 2,% i 4,%) (Ryc. 3). Warianty o morfologii kolonii jasnych Warianty o morfologii kolonii ciemnych 1,% 8,% 5,% 2,% 4,% 4,% 1,% 3,% 6,% 4,% 2,% 5,% 8,% 6,% 6,% 9,% 7,%,% Cewnik L Cewnik LS Cewnik z PCV Cewnik L Cewnik LS Cewnik z PCV Ryc. 1. brak adhezja Adhezja do cewników moczowych wariantów morfologicznych (n=2) dysocjujących szczepów E. coli

Nr 1 Morfologiczne warianty E. coli 55 a. 6j. Cewnik L Cewnik LS Cewnik z PCV Słaba adhezja Brak adhezji Silna adhezja b. 6c. Ryc. 2. Brak adhezji Brak adhezji Brak adhezji Zróżnicowana adhezja do cewników moczowych wariantów morfologicznych szczepu E. coli nr 6 (j wariant o koloniach jasnych, c wariant o koloniach ciemnych) Cewnik z PCV Cewnik LS 1 1 2 7 9 Warianty o morfologii kolonii jasnych Cewnik L 1 3 6 Cewnik z PCV 4 6 Warianty o morfologii kolonii ciemnych Cewnik LS 2 8 Cewnik L 1 4 5,% 2,% 4,% 6,% 8,% 1,% Ryc. 3. brak słaba średnia silna Adhezja do cewników moczowych wariantów o morfologii kolonii jasnych (n=1) i ciemnych (n=1) szczepów dysocjujących E. coli z uwzględnieniem stopnia adhezji Ocena genetycznego podobieństwa morfologicznych wariantów szczepów E. coli z zastosowaniem metody PFGE. W grupie morfologicznych wariantów szczepów E. coli (n=2) stwierdzono obecność dwóch par i jednej trójki morfotypów (35,%)

56 P. Zalas-Więcek, E. Gospodarek, D. Kamińska Nr 1 wykazujących 1% podobieństwa, jeden morfotyp blisko spokrewniony z powyższą trójką oraz 6 par morfotypów blisko ze sobą spokrewnionych (6,%) (Ryc. 4). Ryc. 4. Dendrogram uzyskany dla wariantów morfologicznych dysocjujących szczepów E. coli (n=2) DYSKUSJA Morfologiczne zróżnicowanie kolonii szczepów bakteryjnych nie wydaje się być zjawiskiem bardzo powszechnym, jednak występującym u różnych gatunków drobnoustrojów i prawdopodobnie mającym wpływ na zdolność wywoływania zakażeń. Świadczą o tym wyniki uzyskane w badaniach własnych oraz badaniach uzyskanych przez innych autorów (3, 7, 1, 15). Gospodarek (7) obserwowała morfologiczne zróżnicowanie kolonii wśród 142 (1,6%) szczepów pałeczek Acinetobacter sp. Autorka wykazała odrębność niektórych właściwości biologicznych u opisanych wariantów. Dotyczyły one hemaglutynacji naturalnych krwinek króliczych, aglutynacji z surowicami odpornościowymi, właściwości hydrofobowych komórek oraz wrażliwości na antybiotyki. Z kolei Jachna-Sawicka (1) badając właściwości bakteriocynogenne pałeczek Acinetobacter sp. obserwowała zróżnicowanie morfologiczne kolonii u 28 (2,6%) spośród 136 szczepów. Warianty morfologiczne różniły się właściwościami izoantagonistycznymi. Warianty o morfologii kolonii ciemnych częściej niż warianty o morfologii kolonii jasnych wykazywały wrażliwość na bakteriocyny. W badaniach własnych zróżnicowanie morfologiczne kolonii wykazano u 1 (6,3%) spośród 159 szczepów E. coli. Większość par wariantów wykazała różnice we wrażliwości na antybiotyki, a zdolnością adhezji do cewników moczowych różniło się 4,% wariantów, co znalazło swoje odzwierciedlenie w wynikach uzyskanych dla tych wariantów w ocenie podobieństwa genetycznego z wykorzystaniem metody PFGE. Dużą różnorodność szczepów obserwuje się wśród Neisseria meningitidis (15). Zjawiska sprzyjające temu różnicowaniu prawdopodobnie zdarzają się często, co tłumaczy nie tylko heterogenną naturę populacji meningokoków, ale także prawdopodobnie sukces ewolucyjny tych niebezpiecznych dla człowieka bakterii. Wyselekcjonowane warianty N. meningitidis

Nr 1 Morfologiczne warianty E. coli 57 mogą być bardziej wirulentne, co pozwala im unikać odpowiedzi ze strony układu immunologicznego i szybciej rozprzestrzeniać się w populacji ludzkiej. Wśród szczepów Staphylococcus aureus stwierdzono obecność wariantów o małych koloniach zależnych od tymidyny (ang. thymidine-dependent small-colony variants, TD- SCVs), które izolowano z wydzieliny dróg oddechowych chorych na mukowiscydozę, a które związane były z przewlekłymi i opornymi na leczenie zakażeniami (3). Sugeruje się, że te morfologiczne warianty są hipermutacyjne. Na podstawie analizy porównawczej stwierdzono, że warianty TD-SCVs wykazywały istotnie wyższy współczynnik mutacji ( 1-7 ) niż warianty izolowane z przypadków mukowiscydozy (ang. cystic fibrosis, CF) i warianty izolowane z innych zakażeń o normalnym fenotypie (nie-cf NCVs). Ponadto oporność na antybiotyki inne niż beta-laktamowe (gentamycyna, ciprofloksacyna, erytromycyna, fosfomycyna i rifampicyna) była istotnie bardziej rozpowszechniona u wariantów TD-SCVs niż wśród wariantów CF i nie-cf. Hipermutacja występująca u wariantów TD- SCVs stymuluje prawdopodobnie antybiotykooporność tych wariantów oraz zdolności adaptacyjne predysponujące do występowania przewlekłych zakażeń. Ponieważ warianty morfologiczne szczepów bakteryjnych różnią się ekspresją właściwości biologicznych, a zróżnicowanie tych cech może mieć istotne znaczenie w wywoływaniu zakażeń, to nie powinno się pomijać występowania wariantów morfologicznych szczepów w toku diagnostyki mikrobiologicznej, a w przyszłości należałoby bliżej zbadać to zjawisko. P. Zalas-Więcek, E. Gospodarek, D. Kamińska COMPARISON OF THE PROPERTIES OF THE MORPHOLOGICAL VARIANTS OF E. COLI STRAINS SUMMARY The aim of this study was comparison of the antimicrobial sensitive, adhesive properties and genetic relatedness of the morphological variants of E. coli strains. This study included 1 of E. coli strains isolated in the Clinical Microbiology Department of dr. A. Jurasz University Hospital nr 1 in 23-26, which have grown in two morphological variants light and dark variant. Ninety percent of morphological variants of E. coli strains differed among themselves in antibiotic sensitivity. Forty percent of morphological variants differed among themselves in adhesion to catheters. The light-colony variants more often adhered to all used catheters. The PFGE analysis of chromosomal DNA showed that 35,% of morphological variants (two pairs and one triple) had 1,% relatedness, and the rest of them were closely related. PIŚMIENNICTWO 1. Adler B, Sasakawa C, Tobe T, Makino S, Komatsu K, Yoshikawa M. A dual transcriptional activation system for the 23 kb plasmid genes coding for virulence-associated antigens of Shigella flexneri. Mol Microbiol 1989; 3: 627-35 2. Aertsen A, Michiels CW. Diversify or die: generation of diversity in response to stress. Crit Rev Microbiol 25; 31: 69-78

58 P. Zalas-Więcek, E. Gospodarek, D. Kamińska Nr 1 3. Besier S, Zander J, Kahl BC i inni. The thymidyne-dependent small-colony-variant phenotype is associated with hypermutability and antibiotic resistance in clinical Staphylococcus aureus isolates. Antimicrob Agents Chemother 28; 52(6): 2183-9 4. Boles BR, Thoendel M, Singh PK. Self-generated diversity produces insurance effects in biofilm communities. Proc Natl Acad Sci USA 24; 11: 1663-5 5. Braun W. Bacterial dissociation. A critical review of phenomenon of bacterial variation. Bacteriol Rev 1947; 11: 75-114 6. Ejrnaes K, Sandvang D, Lundgren B, Ferry S, Holm S, Monsen T, Lundholm R, Frimodt-Moller N. Pulsed-field gel electrophoresis typing of Escherichia coli strains from samples collected before and after pivmecillinam or placebo treatment of uncomplicated community-acquired urinary tract infection in women. J Clin Microbiol 26; 44: 1776-81 7. Gospodarek E. Ocena wybranych właściwości biologicznych pałeczek Acinetobacter sp. Akademia Medyczna im. Ludwika Rydygiera w Bydgoszczy, praca habilitacyjna, Bydgoszcz 1999 8. Häußler S. Biofilm formation by the small colony wariant phenotype of Pseudomonas aeruginosa. Environ Microbiol 24; 6: 546-61 9. Hryniewicz W, Sulikowska A, Szczypa K, Gniadkowski M, Skoczyńska A. Rekomendacje doboru testów do oznaczania wrażliwości bakterii na antybiotyki i chemioterapeutyki. Post Mikrobiol 25; 44: 175-92 1. Jachna-Sawicka K. Właściwości bakteriocynogenne pałeczek Acinetobacter spp. Collegium Medicum im. Ludwika Rydygiera w Bydgoszczy Uniwersytetu Mikołaja Kopernika w Toruniu, praca doktorska, Bydgoszcz 26 11. Krysicki W, Bartos J, Dyczka W i inni. Rachunek prawdopodobieństwa i statystyka matematyczna w zadaniach cz. II. Statystyka matematyczna. Warszawa: PWN 22 12. Leung MJ, Nuttall N, Pryce TM, Coombs GW, Pearman JW. Colony variation in Staphylococcus lugdunensis. J Clin Microbiol 1998; 36: 396-8 13. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; fifteenth informational suplement 25; CLSI/NCCLS M1-S15 (M2-A8 and M7-A6) 14. Stanisz A. Przystępny kurs statystyki w oparciu o program STATISTICA PL na przykładach z medycyny. Kraków: StatSoft Polska 21 15. Taha MK, Deghmane AE, Antignac A i inni. The duality of virulence and transmissibility in Neisseria meningitidis. Trends Microbiol. 22; 1:376-82 Otrzymano: 11 I 21 r. Adres Autora: 85-94 Bydgoszcz, ul. M. Curie-Skłodowskiej 9, Katedra i Zakład Mikrobiologii, Collegium Medicum im. Rydygiera w Bydgoszczy, Uniwersytet M. Kopernika w Toruniu