Waldemar Rastawicki, Stanisław Kałużewski, Natalia Rokosz

MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2010, 62: 21-28 Waldemar Rastawicki, Stanisław Kałużewski, Natalia Rokosz OCENA PRZYDATNOŚCI IMMUNOENZYMATYCZNEGO ODCZYNU ELISA DO WYKRYWANIA PRZECIWCIAŁ DLA LIPOPOLISACHARYDU PAŁECZEK KLEBSIELLA RHINOSCLEROMATIS U CHORYCH NA TWARDZIEL Zakład Bakteriologii NIZP-PZH w Warszawie Kierownik: prof. dr hab. M. Jagielski Odczynem ELISA poszukiwano swoistych przeciwciał dla antygenu 2a pałeczek K. rhinoscleromatis w 65 próbkach surowicy uzyskanych od osób z klinicznym podejrzeniem twardzieli. Próbki te przysłano w latach 1970-2009 do rutynowych badań odczynem wiązania dopełniacza. Obecność przeciwciał klasy IgA i IgG na poziomie diagnostycznie znamiennym wykryto w 33 (50,8%) a przeciwciał klasy IgM w 28 (43,1%) próbkach surowicy. Przeprowadzone badania wykazały wysoką czułość i swoistość odczynu ELISA z użytym antygenem w poszukiwaniu przeciwciał dla pałeczek twardzieli. Twardziel (scleroma lub rhinoscleroma) jest endemicznie występującą, przewlekłą chorobą zakaźną wywoływaną przez pałeczki Klebsiella rhinoscleromatis. Rezerwuarem zarazka jest wyłącznie człowiek. Do zakażenia dochodzi w następstwie długotrwałego, prawdopodobnie 3-5 letniego kontaktu z chorym, siewcą zarazka, z reguły w warunkach wspólnego bytowania przy nieprzestrzeganiu elementarnych zasad higieny. Powoduje to powstawanie rodzinnych, endemicznych ognisk twardzieli, określanych jako mikroogniska, w których objawowym zakażeniom ulega około 30% osób spośród narażonych na kontakt z siewcą (11, 15). Opisano również przypadki zakażeń szpitalnych, prawdopodobnie związane z długotrwałością hospitalizacji i jej warunkami (Miakinnikowa 1963, cyt. wg 11). Od opisania w 1870 r przez Hebrę twardzieli jako samodzielnej jednostki chorobowej i w dwanaście lat później wykrycia przez Frischa bakterii otoczkowych w patologicznie zmienionej tkance pobranej od chorych ze zmianami twardzielowymi, informacje o występowaniu tej choroby pochodzą głównie z publikacji ogłaszanych przez lekarzy mających pod opieką chorych na twardziel oraz pracowników laboratoriów mikrobiologicznych. Wyraźny wzrost zainteresowania występowaniem zachorowań na twardziel zapoczątkowała publikacja Wołkowicza z 1888 r, w której opisano 86 przypadków tej choroby stwierdzonej w 11 krajach. Do 1932 r. opisano 2.631 przypadków w 18 krajach, do 1959 r. około 10.000 przypadków w 33 krajach a do 1967 r. 9.906 przypadków w 53 krajach (11, 15). Ostatnio w publikacji z 2000 r. podano, że na świecie wykazano 16.000 przypad-

22 W. Rastawicki, S. Kałużewski, N. Rokosz Nr 1 ków twardzieli (3). Są to zapewne niepełne dane o występowaniu twardzieli, gdyż tylko w niewielu krajach rejestrowano i nadal rejestruje się te zachorowania. Od blisko stu lat wiadomo, że twardziel występuje endemicznie na wszystkich kontynentach, z wyjątkiem Australii, oraz że najwięcej informacji o zachorowaniach pochodziło z krajów Europy Środkowej i Wschodniej, gdzie w szeregu ośrodków naukowych i klinicznych, poczynając od 90-tych lat XIX stulecia (Białoruś, Polska, Ukraina) prowadzono badania nad twardzielą i właściwościami pałeczek K. rhinoscleromatis (1, 2, 5, 8, 11, 14) Z terenu Polski, w dawnych granicach, w latach 1894-1936 zebrano i opublikowano dane o 1.025 przypadkach twardzieli leczonej w warunkach szpitalnych, z czego 562 przypadki zgłoszono do oficjalnego krajowego rejestru zachorowań na choroby zakaźne. W następstwie przesunięcia w 1945 r. wschodniej granicy Polski na zachód znaczne obszary endemicznego występowania twardzieli znalazły się poza granicami kraju, na terenie Ukrainy, Białorusi i Litwy. Większość osób emigrujących z tych obszarów do Polski osiedliła się w zachodnich i północnych województwach, co spowodowało istotną zmianę obszaru występowania przypadków twardzieli w naszym kraju (8). W latach 1939-1974, w publikacjach pochodzących z klinik otolaryngologicznych, podano o objęciu leczeniem szpitalnym lub ambulatoryjnym 566 chorych na twardziel (8). Obecnie nie rejestruje się w Polsce przypadków zachorowań na twardziel, chociaż w latach 1973-1998 w trzech laboratoriach prowadzących serologiczną diagnostykę tych zakażeń, badając 484 próbki surowicy pochodzące od osób z klinicznym podejrzeniem twardzieli, u 36 (7,4%) osób wykryto odczynem wiązania dopełniacza diagnostycznie znamienny poziom przeciwciał dla antygenu 2a K. rhinoscleromatis. Badania te przeprowadzono wg. ujednoliconej metodyki przy użyciu preparatu antygenu przygotowanego w Zakładzie Bakteriologii PZH (5, 8). Wielopostaciowość klinicznego obrazu choroby (postacie: atroficzna, naciekowa, guzowata, zlokalizowana i uogólniona oraz postacie mieszane) i znaczne zróżnicowanie ciężkości obrazu klinicznego i długotrwałości jej przebiegu, określanego przez różnych autorów na 20 do 54 lat sprawiają znaczne trudności rozpoznawcze, zwłaszcza w początkowym okresie choroby (11, 15). Zmiany chorobowe, początkowo najczęściej w postaci atroficznych ognisk błony śluzowej górnych dróg oddechowych, z upływem czasu mogą prowadzić do rozwoju nacieków, guzów twardzielowych i zmian zniekształcających nos i górną wargę oraz znacznego upośledzenia drożności dróg oddechowych (głównie krtani i tchawicy) wymagających interwencji chirurgicznej (2, 3, 8, 10, 11, 12, 13, 15, 17, 18). U niektórych osób zamieszkujących z siewcami zarazka twardzieli choroba może przebiegać na tyle skąpoobjawowo, że rozpoznanie zakażenia można uzyskać dopiero po wykonaniu diagnostycznych badań laboratoryjnych. Pałeczki K. rhinoscleromatis izoluje się od około 50% osób nie leczonych antybiotykami, przy czym częstość izolowania zarazka zależy głównie od charakteru zmian i stopnia ich zaawansowania (11). W rozpoznaniu twardzieli przydatne może być również badanie histopatologiczne wycinków z miejsc objętych naciekiem i stwierdzenie w nich komórek Mikulicza, czy ciałek Russela (3, 18). Niezwykle pomocne w diagnostyce zakażeń wywoływanych przez pałeczki K. rhinoscleromatis są badania serologiczne. W surowicy chorych na twardziel wykrywa się przeciwciała dla somatycznego, zlokalizowanego w LPS bakteryjnym, cząstkowego antygenu 2a pałeczek Klebsiella, nie wykrywa się natomiast przeciwciał dla otoczkowego antygenu K3 (5, 8, 11). Poziom przeciwciał dla antygenu 2a jest skorelowany z długotrwałością procesu

Nr 1 Odczyn ELISA w serodiagnostyce twardzieli 23 chorobowego, jego aktywnością i rozległością zmian miejscowych. Ulega on znacznemu podwyższeniu w przebiegu długotrwałej, etiotropowej antybiotykoterapii (11, 18) W serodiagnostyce twardzieli od szeregu lat wykorzystuje się w naszym kraju odczyn wiązania dopełniacza z antygenem 2a pałeczek K. rhinoscleromatis. Ze względu na to, że OWD nie umożliwia oceny poziomu przeciwciał osobno w poszczególnych klasach immunoglobulin podjęto próbę oceny przydatności immunoenzymatycznego odczynu ELISA do wykrywania swoistych przeciwciał u chorych na twardziel. MATERIAŁ I METODY 1. Badane grupy ludzi. 1.1. Osoby chore, podejrzane w badaniu klinicznym o twardziel. Głównym przedmiotem badań były próbki surowicy uzyskane od 65 osób, podejrzanych w badaniu klinicznym o twardziel. Próbki te zostały przysłane do Zakładu Bakteriologii PZH w Warszawie w latach 1970-2009 w celu przeprowadzenia rutynowych badań diagnostycznych odczynem wiązania dopełniacza w kierunku obecności przeciwciał dla antygenu twardzielowego. Próbki surowicy uzyskane w latach 1970-1980 przechowywano w stanie zliofilizowanym, natomiast próbki uzyskane po roku 1980 w temperaturze 20 o C. 1.2. Osoby chore, z wysokim poziomem przeciwciał dla wybranych patogenów bakteryjnych. W celu dokonania oceny swoistości antygenu twardzielowego badaniom w odczynie ELISA poddano 30 próbek surowicy uzyskanych w latach 2000-2009 od osób chorych z wysokim poziomem przeciwciał dla antygenów pałeczek Salmonella sp., Y. enterocolitica, B. burgdorferi, M. pneumoniae, B. pertussis, L. pneumophila i F. tularensis. 1.3. Osoby klinicznie zdrowe. Zbadano próbki surowicy uzyskane w latach 2003-2005 od 30 osób klinicznie zdrowych krwiodawców. Próbki te posłużyły do wyznaczenia diagnostycznie znamiennego poziomu przeciwciał dla antygenu twardzielowego. 2. Odpornościowa surowica królicza. Próbka surowicy uzyskana od immunizowanego pałeczkami K. rhinoscleromatis królika (miano w odczynie OWD 1280) została wykorzystana do określenia optymalnego stężenia lipopolisacharydów wykorzystanych jako antygen w odczynie ELISA. 3. Preparatyka antygenu twardzielowego. Oczyszczony preparat somatycznego antygenu twardzielowego uzyskano we własnym zakresie zmodyfikowaną metodą Boivina ze szczepu K. rhinoscleromatis Rh32 (5). W użytej metodzie zawiesinę bakteryjną po 24-godzinnym wytrząsaniu w 0,5 M kwasie trójchlorooctowym, w temp. 4 o C wirowano, supernatant dializowano wobec wody destylowanej, zagęszczano w ewaporatorze a następnie dodawano 3 objętości 96% etanolu, pozostawiano w chłodni przez 18 godzin dla wyprecypitowania się osadu i ponownie wirowano. Uzyskany osad zawieszano w wodzie destylowanej, ponownie dializowano i liofilizowano. 4. Wykonanie odczynu immunoenzymatycznego ELISA. Odczyn wykonywano na płytkach polistyrenowych firmy Nunc zgodnie z metodyką opisaną uprzednio z uwzględnieniem niezbędnych modyfikacji (16). Poziom przeciwciał dla twardzielowego antygenu oznaczano w klasie immunoglobulin A, G i M w próbkach

24 W. Rastawicki, S. Kałużewski, N. Rokosz Nr 1 surowicy rozcieńczonej 1/100. W badaniach posłużono się kozimi immunoglobulinami sprzężonymi z peroksydazą chrzanową (Cappel MP Biomedicals, Inc) rozcieńczonymi odpowiednio w stosunku 1/1000 (IgA), 1/2000 (IgG) i 1/500 (IgM). Pomiaru absorbancji dokonywano w czytniku firmy AsysTech przy długości fali światła 450 nm. 5. Statystyczne opracowanie wyników. Analizę statystyczną uzyskanych wyników przeprowadzono przy użyciu programu komputerowego Instat tm (Instant Biostatistic). Obliczano średnią arytmetyczną wartość miana przeciwciał i odchylenie standardowe. Istotność różnic w częstości wykrywania przeciwciał w próbkach surowicy osób chorych i osób z grupy kontrolnej oceniano testem niezależności chi-kwadrat z zastosowaniem poprawki Yatesa. Za znamienne statystycznie przyjęto różnice, gdzie poziomy istotności p były mniejsze od 0,05 (p < 0,05). WYNIKI I DYSKUSJA W pierwszym etapie badań, posługując się odpornościową surowicą króliczą oraz wybranymi próbkami surowicy ludzkiej, o wysokim poziomie miana przeciwciał oznaczonym w OWD, ustalono stężenie lipopolisacharydu optymalne do opłaszczenia dołków płytki metapleksowej w odczynie ELISA. I tak, w wyniku miareczkowania przyjęto, że stężenie antygenu twardzielowego będzie wynosić 10 µg/ml. W celu wyznaczenia diagnostycznie znamiennego poziomu przeciwciał dla antygenu twardzielowego zbadano próbki surowicy uzyskane od 30 krwiodawców - klinicznie zdrowych osób. Poziom ten wyznaczono na wysokości średniej arytmetycznej wartości absorbancji (OD) powiększonej o trzy odchylenia standardowe (SD) (Tabela I). Wyniki przeprowadzonych badań wykazały, że w żadnej próbce surowicy uzyskanej od osoby zdrowej nie wykryto przeciwciał na poziomie diagnostycznie znamiennym. Biorąc pod uwagę fakt, iż obecnie w naszym kraju twardziel jest chorobą niezwykle rzadką, uzyskane wyniki badania próbek surowicy krwiodawców były zgodne z oczekiwaniem. Z diagnostycznego punktu widzenia brak tła immunologicznego w populacji osób w Polsce jest sytuacją komfortową, umożliwiającą wyznaczenie wiarygodnego, diagnostycznie znamiennego, poziomu przeciwciał, świadczącego o zakażeniu pałeczkami K. rhinoscleromatis. Tabela I. Poziom przeciwciał dla antygenu twardzielowego w próbkach surowicy uzyskanych od 30 osób klinicznie zdrowych krwiodawców. Badana cecha Średnia arytmetyczna (x) wartości OD Odchylenie standardowe (SD) wartości OD Wartość OD diagnostycznie znamienna (x + 3 SD) Odczyn ELISA z antygenem twardzielowym w klasie przeciwciał: IgA IgG IgM 0,54 0,56 0,48 0,12 0,13 0,14 0,90 0,95 0,90

Nr 1 Odczyn ELISA w serodiagnostyce twardzieli 25 W następnym etapie badań, w celu dokonania oceny swoistości lipopolisacharydowego antygenu twardzielowego, badaniom w odczynie ELISA poddano ogółem 30 próbek surowicy uzyskanych od osób chorych z wysokim poziomem przeciwciał dla antygenów pałeczek F. tularensis (6 próbek), Y. enterocolitica (6 próbek), B. burgdorferi (6 próbek), Salmonella sp. (3 próbki), M. pneumoniae (3 próbki), B. pertussis (3 próbki), L. pneumophila (3 próbki). Przeprowadzone badania wykazały wystąpienie reakcji dodatniej, przynajmniej w jednej badanej klasie immunoglobulin, tylko w przypadku 2 (6,7%) próbek surowicy (jednej próbki uzyskanej od chorego z boreliozą i jednej uzyskanej od osoby z tularemią). Uzyskanie takich wyników może świadczyć o wysokiej swoistości użytego antygenu i jego przydatności do badań diagnostycznych prowadzonych w kierunku twardzieli. Głównym celem naszej pracy było określenie odczynem ELISA poziomu przeciwciał dla antygenu twardzielowego w próbkach surowicy uzyskanych od 65 osób z klinicznym podejrzeniem twardzieli. W próbkach tych, we wcześniej przeprowadzonych rutynowych badaniach odczynem wiązania dopełniacza, oznaczono miano przeciwciał dla tego samego antygenu jakiego użyto w odczynie ELISA. W wyniku przeprowadzonych badań odczynem ELISA wykazano obecność przeciwciał klasy IgA i IgG na poziomie diagnostycznie znamiennym w 33 (50,8%), a przeciwciał klasy IgM, w 28 (43,1%) próbkach surowicy. Statystyczna analiza istotności różnic między wynikami oznaczeń poziomu przeciwciał u osób chorych i osób z grupy kontrolnej wykazała, że odczynem ELISA istotnie częściej (p<0,05) wykrywano przeciwciała na poziomie diagnostycznie znamiennym dla antygenu twardzielowego u osób chorych, z klinicznym podejrzeniem twardzieli. Jednakże, jak wynika z dokładnej analizy przypadków chorobowych, zdecydowana większość wyników dodatnich dotyczyła próbek surowicy uzyskanych w latach siedemdziesiątych i osiemdziesiątych ubiegłego wieku. Natomiast, w przypadku próbek surowicy uzyskanych w przeciągu ostatnich 20 lat, podwyższony poziom przeciwciał dla antygenu twardzielowego wykazano tylko w 8 próbkach. W tabeli II porównano wyniki badania próbek surowicy uzyskanych od wybranych osób chorych przeprowadzonych odczynem wiązania dopełniacza oraz odczynem ELISA (w przypadku OWD za wynik dodatni przyjmując wystąpienie reakcji z surowicą rozcieńczoną 1:5). I tak, we wszystkich próbkach surowicy, w których wykazano we wcześniej Tabela II. Porównanie wyników badania próbek surowicy uzyskanych od wybranych osób chorych przeprowadzonych odczynem wiązania dopełniacza oraz odczynem ELISA w kierunku obecności przeciwciał dla antygenu twardzielowego. Nr próbki/ rok uzyskania surowicy Miano przeciwciał w odczynie wiązania dopełniacza Wartość OD przeciwciał (w rozc. 1/100) oznaczona odczynem ELISA w klasie: IgA IgG IgM 1/1977 240 1,56 1,49 1,53 2/1980 160 1,83 1,46 1,68 3/1982 120 1,74 1,57 1,42 4/1978 30 1,58 1,26 1,10 5/2001 <5 0,76 0,85 1,25 6/2000 <5 0,87 0,89 1,12 7/2003 <5 1,55 1,00 0,61 8/2006 <5 0,33 0,35 0,42

26 W. Rastawicki, S. Kałużewski, N. Rokosz Nr 1 wykonanych badaniach odczynem wiązania dopełniacza podwyższone miano przeciwciał, stwierdzono też odczynem ELISA wysoki poziom przeciwciał we wszystkich trzech klasach immunoglobulin (patrz próbki nr 1-4). W większości próbek surowicy, ujemnych w OWD, nie stwierdzono również przeciwciał odczynem ELISA (patrz próbka nr 8/2006). Jednakże w trzech na 32 badane próbki surowicy ujemne w OWD, wykazano odczynem ELISA podwyższony poziom przeciwciał przynajmniej w jednej klasie immunoglobulin (próbki nr 5-7). Mogłoby to wskazywać na wyższą czułość odczynu ELISA, w porównaniu do OWD, w poszukiwaniu swoistych przeciwciał powstających w wyniku zakażenia pałeczkami K. rhinoscleromatis. W dostępnym piśmiennictwie istnieje tylko jedna publikacja dotycząca wykorzystania odczynu ELISA w serodiagnostyce twardzieli. Trautmann i wsp. (18) do poszukiwania swoistych przeciwciał w przebiegu twardzieli u 17-letniej chorej zastosowali w odczynie ELISA jako antygen zawiesinę żywych pałeczek K. rhinoscleromatis. W pierwszej próbce surowicy, uzyskanej od osoby chorej po 15 miesiącach od początku objawów klinicznych, stwierdzono niski poziom przeciwciał. Po włączeniu leczenia ciprofloksacyną poziom przeciwciał klasy IgG gwałtownie wzrósł osiągając maksymalny poziom (10-krotny przyrost) po około miesiącach 6 miesiącach od początku kuracji antybiotykowej. Nie stwierdzono natomiast diagnostycznie znamiennego przyrostu poziomu przeciwciał klasy IgM, który kształtował się na średniej wysokości uzyskanej podczas badania próbek osób z grupy kontrolnej. Według autorów tak wysoki przyrost poziomu przeciwciał klasy IgG podczas leczenia antybiotykiem może być związany z uwalnieniem się antygenów pałeczek K. rhinoscleromatis z makrofagów (komórek Mikulicza), a co za tym idzie ich lepszej prezentacji układowi immunologicznemu. W pracy Trautmann uzyskano liczne dodatnie reakcje podczas badania próbek surowicy osób chorych z grupy kontrolnej, z dolegliwościami ze strony uszu, nosa i gardła. Prawdopodobną przyczyną wystąpienia tych nieswoistych reakcji krzyżowych było zastosowanie przez tych autorów jako antygenu w odczynie ELISA zawiesiny pałeczek K. rhinoscleromatis zawierających, jak inne drobnoustroje z rodziny Enterobacteriaceae, antygen ECA (6, 7). Jak wynika z badań przeprowadzonych przez Bortkiewicz i Szymanowicz (cyt. za 11) przeciwciała pojawiające się w początkowym okresie twardzieli w około 26% przypadków mogą wyłącznie należeć do klasy IgM. Dominacja ilościowa przeciwciał klasy IgG może mieć miejsce w bardziej zaawansowanym stanie choroby. Badania te przeprowadzono odczynem hemaglutynacji biernej, inaktywując immunoglobuliny klasy M działaniem 2-merkaptoetanolu (11). Podobne spostrzeżenia zostały poczynione również w badaniach wykonanych OWD przez Kałużewskiego (4, 9). Spośród próbek surowicy uzyskanych od 56 chorych na twardziel, u których wykryto przeciwciała w mianie diagnostycznie znamiennym dla antygenu 2a pałeczek Klebsiella, w 36 (64%) próbkach po termicznej inaktywacji immunoglobulin klasy M (65 o C przez 1 godzinę) nie wykryto przeciwciał aktywnych w OWD, natomiast w 20 (36%) próbkach ich poziom znacznie się obniżył (4-32 krotnie), pozostając jednak w mianie diagnostycznie znamiennym dla twardzieli. Wskazywałoby to na znaczny i długo utrzymujący się udział immunoglobulin klasy M w humoralnej odpowiedzi w przebiegu przewlekłej choroby zakaźnej, jaką jest twardziel. Wyniki prezentowanych badań przeprowadzonych odczynem ELISA potwierdzają wcześniejsze spostrzeżenia co do częstego występowania immunoglobulin klasy M w przebiegu twardzieli. W próbkach surowicy uznanych w OWD za dodatnie, wykryliśmy

Nr 1 Odczyn ELISA w serodiagnostyce twardzieli 27 wysoki poziom przeciwciał dla antygenu twardzielowego zarówno w klasie IgG jak i w klasie IgM i IgA. Jest to o tyle ciekawe, że twardziel jest chorobą przebiegającą wyjątkowo przewlekle a objawy kliniczne skłaniające osobę chorą do zgłoszenia się do lekarza mogą trwać przez wiele miesięcy a nawet lat (2, 3, 8, 11). Ponieważ uważa się, że przeciwciała klasy IgM i IgA w większości zakażeń bakteryjnych charakterystyczne są raczej dla ostrej fazy choroby (16), wyniki takie mogłyby wskazywać więc na to, że układ immunologiczny ulegał ciągłej stymulacji antygenami uwalnianymi z komórek Mikulicza. Nie dysponując próbkami surowicy kilkakrotnie uzyskiwanymi od osób chorych w różnych okresach choroby a także informacjami dotyczącymi czasu trwania i obrazu klinicznego choroby, wieku pacjentów i zastosowanego leczenia, nie mogliśmy przeprowadzić pełnej analizy odpowiedzi humoralnej u tych osób w przebiegu twardzieli. Przeprowadzone badania wykazały przydatność odczynu ELISA do poszukiwania przeciwciał dla pałeczek K. rhinoscleromatis w surowicy osób z twardzielą. Odczyn ten, w porównaniu do odczynu wiązania dopełniacza, charakteryzuje się wyższą czułością oraz pozwala na łatwiejsze wystandaryzowanie parametrów jego przeprowadzenia oraz określenie poziomu przeciwciał osobno w poszczególnych klasach immunoglobulin. W. Rastawicki, S. Kałużewski, N. Rokosz APPLICATION OF ENZYME LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA) FOR DIAGNOSIS OF ANTIBODIES TO LIPOPOLYSACCHARIDE OF KLEBSIELLA RHINOSCLEROMATIS IN PATIENTS WITH RHINOSCLEROMA SUMMARY The ELISA were performed on polystyrene microtiter plates (Nunc, MaxiSorp) coated with LPS (2a antigen) at the final concentration of 10 µg/ml. The antigen was extracted from Klebsiella rhinoscleromatis Rh32 by the trichloroacetic acid and separated by ethanol (Boivin method). The antibodies against the LPS were detected by ELISA in serum samples collected from 65 patients suspected in clinical investigation for rhinoscleroma in Poland from 1970 to 2009. Additionally, the specificity of the antigen was tested using serum sample of immunized rabbit and 30 sera of patients from control group, with high level of antibodies to different bacterial pathogens. All serum samples were diluted 1:100. The concentrations of IgA, IgG and IgM antibodies were expressed as optical density (OD) measured at the wavelength of 450 nm. The cut-off limit of serum antibodies was set at mean antibody OD determined in the sera of 30 blood donors exceeded by three standard deviations. The presence of IgA and IgG antibodies were detected by ELISA in 33 (50,8%) and IgM in 28 (43,1%) of patients. Most of the serum samples (75%) with high level of specific antibodies were obtained from patients before 1980. On the other hand antibodies to K. rhinoscleromatis were detected only in 2 (6,7%) patients from the control group and none of blood donors. In conclusion, our home made ELISA, based on purified LPS of K. rhinoscleromatis showed high specificity and sensitivity in the diagnosis of antibodies to K. rhinoscleromatis in comparison to the complement fixation test. The presence of high level of specific IgA, IgG and IgM antibodies in the sera obtained in different stages of disease may showed that during the rhinoscleroma is permanent stimulation of antibody production.

28 W. Rastawicki, S. Kałużewski, N. Rokosz Nr 1 PIŚMIENNICTWO 1. Andraca R, Edson RS, Kern EB. Rhinoscleroma: a growing concern in the United States? Mayo Clinic experience. Mayo Clin Proc 1993; 68:1151-7. 2. Dal Mk, Zaricki LA, Kołomijczenko AJ, Elbert BJ. Skleroma. Gosud Mied Izd, Kijew, 1959. 3. Hart Ca, Rao SK. Rhinoscleroma. J Med. Microbiol 2000; 49:395-6. 4. Kałużewski S. Obraz przeciwciał normalnych u ludzi dla somatycznych (grupowych) antygenów pałeczek Klebsiella. Med Dośw Mikrobiol 1969; 21: 271-84. 5. Kałużewski S. Niektóre cząstkowe antygeny bezotoczkowych wariantów pałeczek Klebsiella z grupy O2. Med Dośw Mikrobiol 1969; 21:25-36. 6. Kałużewski S. Niektóre aspekty wiarygodności metod diagnostyki bakteriologicznej i serologicznej. Roczniki WIHE 1974; 13:31-45. 7. Kałużewski S, Czech Z. Występowanie i zawartość antygenu Kunina (CAE) w pałeczkach Enterobacteriaceae oraz innych bakteriach Gram-ujemnych. Med Dośw Mikrobiol 1976; 28:109-19. 8. Kałużewski S. Twardziel str.378-386. W: Choroby zakaźne i ich zwalczanie na ziemiach polskich w XX wieku. Red. J. Kostrzewski, W. Magdzik, D. Naruszewicz-Lesiuk. PZWL, Warszawa, 2001 9. Kałużewski S. Informacja własna. Dane niepublikowane. 10. Kim NR, Han J, Kwon TY. Nasal rhinoscleroma in a nonendemic area: a case report. J Korean Med. Sci 2003; 18:455-8. 11. Krasilnikow AP, Izraitiel NA. Skleroma (mikrobiołogia, epidemiołogia, diagnostyka).izd. Biełarus, Minsk 1971. 12. Lubin JR, Jallow SE, Wilson WR i inni. Rhinoscleroma with exophthalmus: a case report. Br J Ophthalmol 1981; 65:14-7. 13. Maglad S, Satir AA. Rhinoscleroma a case report. East Afr Med. J 1985; 62:420-2. 14. Muzyka MM, Gubina KM. Problems of the epidemiology of scleroma. I. Geographical distribution of scleroma. J Hyg Epidemiol Microbiol Immunol 1971; 15:233-42. 15. Nowicki W. Twardziel. PZWL, Warszawa 1950 16. Rastawicki W. Humoralna odpowiedź na wybrane antygeny pałeczek Yersinia enterocolitica i Yersinia pseudotuberculosis w przebiegu jersiniozy u ludzi. I. Występowanie i poziom przeciwciał dla somatycznych antygenów pałeczek Yersinia oraz wydzielniczych białek Yop wykrytych odczynem ELISA. Med. Dośw Mikrobiol 2006; 58:303-19. 17. Soni NK, Hemani DD. Scleroma of the eustachian tube: salpingoscleroma. J Laryngol Otol 1994; 108:944-6. 18. Trautmann M, Held Th, Ruhnke M, Schnoy N. A case of rhinoscleroma cured with ciprofloxacin. Infection 1993; 21: 403-406. Otrzymano: 23 II 2010 r. Adres Autora: 00-791 Warszawa, ul. Chocimska 24, Zakład Bakteriologii NIZP-PZH w Warszawie