Mgr Agnieszka Góral Dziedzina: nauki biologiczne Dyscyplina: biologia Otwarcie: 28.06.2013 r. Temat: Białko CacyBP/SIP: oddziaływanie z białkiem szoku cieplnego Hsp90 oraz rola w odpowiedzi komórek na działanie czynników stresowych Promotor: prof. dr hab. Anna Filipek Recenzenci: prof. dr hab. Barbara Lipińska, prof. dr hab. Wiesława Widłak
STRESZCZENIE Białko szoku cieplnego Hsp90 (ang. Heat shock protein 90), zwane też białkiem opiekuńczym lub molekularnym czaperonem (ang. molecular chaperone) jest niezbędne do prawidłowego fałdowania i aktywacji wielu białek uczestniczących w ważnych procesach i ścieżkach przekazywania sygnału w komórce. Hsp90, obok innych białek szoku cieplnego, pełni też kluczową rolę w ochronie innych białek przed skutkami działania stresu [Taipale i wsp., 2010; Verma i wsp., 2016]. Hsp90 posiada aktywność ATPazową, która jest ściśle regulowana przez modyfikacje potranslacyjne oraz oddziaływanie z różnymi białkami współopiekuńczymi (ko-czaperonami; ang. co-chaperones). Jednym z takich ko-czaperonów Hsp90 jest Sgt1 (ang. Suppressor of G2 allele of Skp1) [Kitagawa i wsp., 1999; Zabka i wsp., 2008] CacyBP/SIP (ang. Calcyclin Binding Protein / Siah-1 Interacting Protein), białko homologiczne z Sgt1, zostało odkryte jako białko wiążące kalcyklinę (S100A6) i Siah-1 [Filipek i Wojda, 1996; Filipek i Kuźnicki, 1998; Matsuzawa i Reed, 2001]. CacyBP/SIP występuje w wielu typach komórek i tkanek ssaków. Białko to, poprzez oddziaływanie z różnymi ligandami (m.in. białkami z rodziny S100, składnikami kompleksu ligazy ubikwityny Siah-1 i Skp1, białkami cytoszkieletu aktyną, tubuliną i tropomiozyną, czy kinazą ERK1/2) jest zaangażowane w procesy takie jak ubikwitynacja, organizacja cytoszkieletu, jak również proliferacja i różnicowanie komórek [Schneider i Filipek, 2011; Topolska-Woś i wsp., 2016]. Biorąc pod uwagę częściową homologię w sekwencji aminokwasowej koczaperonu Sgt1 i białka CacyBP/SIP oraz opublikowane dane sugerujące możliwość wiązania się CacyBP/SIP z Hsp90 [Lee i wsp., 2004; Gano i Simon, 2010], celem niniejszej rozprawy doktorskiej było dokonanie charakterystyki oddziaływania CacyBP/SIP z Hsp90 oraz określenie roli CacyBP/SIP w odpowiedzi komórek na działanie czynników stresowych. W pierwszym etapie badań wykonano szereg doświadczeń mających na celu potwierdzenie sugestii dotyczących oddziaływania CacyBP/SIP z Hsp90. Wykorzystując metodę ko-immunoprecypitacji oraz wykonując test ligacji zbliżeniowej (PLA) wykazano, iż CacyBP/SIP, podobnie jak Sgt1, występuje w kompleksach tworzonych z udziałem Hsp90 w cytoplazmie ludzkich komórek HEp-2. Dalsze badania pokazały, że CacyBP/SIP wiąże się najprawdopodobniej z domeną środkową Hsp90, a zahamowanie aktywności Hsp90 przy użyciu dwóch inhibitorów, radicicolu czy nowobiocyny, nie hamuje tworzenia się kompleksów CacyBP/SIP-Hsp90. Potwierdzono również, iż CacyBP/SIP wiąże się
z Hsp90 w sposób bezpośredni. Ponadto pokazano, iż pomimo podobieństwa sekwencji CacyBP/SIP i Sgt1, białka te nie współzawodniczą ze sobą o wiązanie się z Hsp90. Co więcej, biorąc pod uwagę fakt, iż CacyBP/SIP wykazuje włąściwości fosfatazowe względem kinazy ERK1/2 [Kilańczyk i wsp., 2011], wykonano doświadczenia z zastosowaniem elektroforezy dwukierunkowej (2D) w celu zbadania wpływu CacyBP/SIP na poziom form Hsp90 o różnych wartościach punktu izoektrycznego (pi). Uzyskane wyniki wskazują, że CacyBP/SIP może defosforylować Hsp90. Jednak w celu określenia wpływu CacyBP/SIP jako fosfatazy na aktywność Hsp90 niezbędne są dalsze badania. W kolejnym etapie pracy określono rolę białka CacyBP/SIP w odpowiedzi komórek na działanie czynników stresowych. Punktem wyjścia do tej części pracy było sprawdzenie wpływu szoku cieplnego oraz inhibitorów Hsp90, radicicolu i nowobiocyny, na poziom białka CacyBP/SIP w komórkach HEp-2. Przeprowadzona metodą Western blot analiza wykazała, iż działanie wymienionych czynników nie powoduje obniżenia poziomu CacyBP/SIP. Na tej podstawie można było przypuszczać, że CacyBP/SIP nie jest substratem Hsp90 lecz może działać jako białko współopiekuńcze. Następnie wykazano, stosując test MTT, że komórki HEp-2 z nadekspresją CacyBP/SIP-3xFLAG cechowały się zwiększoną odpornością w warunkach stresu, co sugerowało właściwości opiekuńcze CacyBP/SIP wobec innych białek. Rzeczywiście, testy przeprowadzone w warunkach in vitro pokazały, że CacyBP/SIP, podobnie jak Hsp90, hamuje indukowaną termicznie agregację syntazy cytrynianowej oraz chroni lucyferazę przed denaturacją. Z uwagi na fakt, iż ekspresja białek związanych z odpowiedzią komórki na stres, w tym wielu białek opiekuńczych i współopiekuńczych, jest regulowana przez czynnik transkrypcyjny Hsf1 (ang. Heat shock factor 1) podjęto próbę sprawdzenia, czy czynnik ten może aktywować ekspresję genu CacyBP/SIP. Analiza in silico sekwencji promotora genu CacyBP/SIP oraz wstępne wyniki testu lucyferazy i analizy poziomu CacyBP/SIP po nadekspresji Hsf1-FLAG w komórkach HEp-2 wydają się potwierdzać udział tego czynnika transkrypcyjnego w regulacji ekspresji CacyBP/SIP w warunkach stresu. Podsumowując, w niniejszej rozprawie doktorskiej wykazano, iż CacyBP/SIP jest nowym ligandem białka Hsp90. Właściwości opiekuńcze CacyBP/SIP wobec innych białek oraz możliwa rola w regulacji aktywności Hsp90 sugerują udział CacyBP/SIP w ochronie komórek przed działaniem czynników stresowych.
ABSTRACT Heat shock protein 90 (Hsp90) is a molecular chaperone essential for the proper folding and activation of a myriad of substrate proteins involved in many important cellular processes and signaling pathways. Furthermore, Hsp90, together with other heat shock proteins, plays a key role in protecting other proteins from the effects of cellular stress [Taipale et al., 2010; Verma et al., 2016]. Hsp90 exhibits ATPase activity that is tightly regulated by posttranslational modifications and the interaction with different co-chaperones. One of the Hsp90 co-chaperones is Sgt1 (Suppressor of G2 allele of Skp1) [Kitagawa et al., 1999; Zabka et al., 2008]. The CacyBP/SIP protein (Calcyclin Binding Protein / Siah-1 Interacting Protein), a homolog of Sgt1, was discovered as a calcyclin (S100A6) and Siah-1 binding partner [Filipek & Wojda, 1996; Filipek & Kuźnicki, 1998; Matsuzawa & Reed, 2001]. CacyBP/SIP is present in a variety of mammalian cells and tissues. The protein has been shown to interact with many ligands including some members of the S100 protein family, components of a ubiquitin ligase complex Skp1 and Siah-1, some cytoskeletal proteins tubulin, actin and tropomyosin, and ERK1/2 kinase. Therefore, CacyBP/SIP seems to be involved in various cellular processes such as ubiquitination, cytoskeleton dynamics as well as cell proliferation and differentiation [Schneider & Filipek, 2011; Topolska-Woś et al., 2016]. Taking into account the partial homology in the amino acid sequence between the Sgt1 co-chaperone and the CacyBP/SIP protein, and the published data suggesting possible CacyBP/SIP-Hsp90 interaction [Lee et al., 2004; Gano & Simon, 2010], the aim of this work was to confirm and characterize the interaction between CacyBP/SIP and Hsp90 and to elucidate the role of CacyBP/SIP in the cellular stress response. At first, a set of experiments was performed in order to verify whether CacyBP/SIP interacts with Hsp90. Immunoprecipitation and proximity ligation assay (PLA) have revealed that CacyBP/SIP, similarly to Sgt1, forms complexes with Hsp90 in the cytoplasm of human HEp-2 cells. Moreover, it was shown that the middle domain of Hsp90 is involved in CacyBP/SIP binding and that the inhibition of Hsp90 activity by two distinct inhibitors, radicicol and novobiocin, had no effect on CacyBP/SIP-Hsp90 complex formation. The direct character of CacyBP/SIP-Hsp90 interaction was also confirmed and, moreover, it was shown that despite the homology between CacyBP/SIP and Sgt1, the proteins did not compete for the binding with Hsp90. Taking into account the phosphatase activity of CacyBP/SIP towards
ERK1/2 kinase [Kilanczyk et al., 2011], experiments using two dimentional (2D) electrophoresis were performed in order to check the effect of CacyBP/SIP on the level of Hsp90 forms with different isoelectric points (pi). The obtained results have shown that, indeed, CacyBP/SIP might dephosphorylate Hsp90, however, further studies are required to better understand the possible role of CacyBP/SIP as a phosphatase, in the regulation of Hsp90 activity. In the subsequent step, the involvement of CacyBP/SIP in the cellular stress response was examined. At the beginning, the influence of heat shock and two Hsp90 inhibitors, radicicol and novobiocin, on the CacyBP/SIP protein level in HEp-2 cells was examined. Western blot analysis has shown that none of the stress conditions mentioned above evoked a decrease in the CacyBP/SIP protein level in these cells. Based on these results it can be concluded that CacyBP/SIP is not a Hsp90 substrate and thus may act as a Hsp90 co-chaperone. Next, the MTT assay has shown that the HEp-2 cells with overexpression of CacyBP/SIP-3xFLAG were more resistant to stress, which suggests the chaperone properties of CacyBP/SIP. Indeed, in vitro assays have shown that CacyBP/SIP, similarly to Hsp90, is able to protect citrate synthase from temperature-induced aggregation and luciferase from thermal denaturation. Due to the fact that the expression of proteins involved in the cellular stress response is regulated mainly by the Hsf1 (Heat Shock Factor 1) transcription factor, it seemed interesting to check the possibility of CacyBP/SIP gene promoter activation by Hsf1. In silico analysis has revealed putative Hsf1 binding sites within the sequence of the CacyBP/SIP gene promoter. Also, preliminary results obtained using luciferase assay and the analysis of the CacyBP/SIP protein level in HEp-2 cells overexpressing Hsf1-FLAG suggest the involvement of Hsf1 in the regulation of CacyBP/SIP gene promoter under stress conditions. In conclusion, results presented in this dissertation indicate that CacyBP/SIP is a novel Hsp90 ligand. The intrinsic chaperone properties towards other proteins and putative role in the regulation of Hsp90 activity suggest the involvement of CacyBP/SIP in the cellular stress response.