Agnieszka Kowalczyk, Monika Michniewicz, Ma gorzata Robak 1

Acta Sci. Pol., Biotechnologia 8(3) 2009, 15-24 BIOREMEDIACJA Z UDZIA EM DRO D Y YARROWIA LIPOLYTICA: UNIERUCHOMIONE W ALGINIANIE KOMÓRKI ORAZ ICH WP YW NA AUTOCHTONICZN MIKROFLOR GLEBY I KIE KOWANIE OWSA Agnieszka Kowalczyk, Monika Michniewicz, Ma gorzata Robak 1 Uniwersytet Przyrodniczy we Wroc awiu Streszczenie. W pracy sprawdzano wp yw warunków atmosferycznych na trwa o alginianowych zawieraj cych unieruchomione komórki dro d y Yarrowia lipolytica podczas ich przetrzymywania w terenie przez pi jesienno-zimowych miesi cy. W warunkach laboratoryjnych badano wp yw dodatku dro d y Y. lipolytica na kie kowanie owsa i mikroflor autochtoniczn gleby. Po okresie zimowego przechowywania granulki zawiera y ywe dro d e Y. lipolytica. Obecno pozytywnie wp yn a na autochtoniczn mikroflor, powoduj c wzrost liczby mikroorganizmów. W testach laboratoryjnych dodatek preparatu dro d y (zawiesina lub granulki) spowodowa wzrost liczby mikroorganizmów gleby i poprawi kie kowanie owsa. Otrzymane wyniki zdecydowanie zach caj do kontynuacji bada nad produkcj biopreparatów dro d y Y. lipolytica przeznaczonych do bezpo redniego wprowadzania do gleby. S owa kluczowe: Yarrowia lipolytica, bioremediacja gleby, stabilno alginianowych WST P Wielu geologów uwa a, e ropa naftowa postrzegana jako zanieczyszczenie rodowiska nie stanowi problemu. Jest biologicznego pochodzenia i naturalnie wyst puje w gruncie. Niestety, ju niewielka jej ilo na tyle zmienia smak wody, e nie jeste my w stanie wypi nawet kilku jej yków. Dlatego powierzchniowe zanieczyszczenia gruntów zwi zkami ropopochodnymi, mog cymi ostatecznie dyfundowa do uj wody pitnej, staj si zagro eniem dla rodowiska, podobnie jak obszary ska one, na których z racji st enia tych substancji nie ma ycia. W Polsce wielu naukowców zaj o si ju tym problemem, szukaj c mikrobiologicznych preparatów efektywnie oczyszczaj cych ska ony teren [Lisowska i D ugo ski 2003, Mrozik i in. 2005, Wójcik i Tomaszewska Adres do korespondencji Corresponding author: Ma gorzata Robak, Katedra Biotechnologii i Mikrobiologii ywno ci, Uniwersytet Przyrodniczy we Wroc awiu, ul. Norwida 25, 50-375 Wroc aw, e-mail: malgorzata.robak@up.wroc.pl

16 A. Kowalczyk i in. 2005]. Niemniej wi kszo z tych preparatów zawiera a bakterie. Natomiast do usuwania zanieczyszcze ropopochodnych zdolne s tak e dro d e z gatunku Yarrowia lipolytica [Robak 2006]. Wchodz one równie w sk ad preparatów stosowanych w celu wzbogacenia ryzosfery [Vassilev i in. 2001a, 2001b] i poprawy przyswajalno ci fosforu [Takita i in. 1999]. Dro d e te w postaci wolnych i immobilizowanych w alginianie wapnia komórek by y wykorzystane do biodegradacji zwi zków ropopochodnych w glebie metod in situ w okolicy Bornego Sulinowa [ oga a i in. 2005]. Wprowadzenie biomasy dro d y do odwiertów doprowadzi o do zaniku zanieczyszczenia (obserwowanego wcze niej jako anomalia, okre lona i umiejscowiona przez pomiary elektrooporowe oraz elektromagnetyczne) i jednocze nie znacznie wzbogaci o mikroflor gleb [Robak i in. 2007, oga a i in. 2008]. Obserwowany post p oczyszczania gruntu metod in situ jest wynikiem dzia alno ci dro d y, metabolizuj cych szkodliwe substancje do komponentów komórkowych i wydzielaj cych metabolity sprzyjaj ce rozwojowi innych organizmów. Obumieraj ce komórki dro d y wzbogacaj dodatkowo gleb w cenne sk adniki pokarmowe. Obficie zaczyna rozwija si mikroflora, poprawia si ukorzenienie i rozwój ro lin. Przy analizie mikrobiologicznej gleby nale y jednak pami ta, e ilo mikroorganizmów w glebie jest zmienna w zale no ci od pór roku, temperatury, ilo ci opadów, a tak e samej struktury gleby [Paul i Clark 2000]. Cz sto trudne jest ilo ciowe porównanie flory mikrobiologicznej z tego samego obszaru podlegaj cego zmieniaj cym si warunkom atmosferycznym. Mo liwa jest jedynie ocena przyrostu liczby drobnoustrojów w odniesieniu do kontrolnej próby gleby pobranej w tym samym czasie z przyleg ego nie poddanego bioremediacji terenu. Celem pracy by o zbadanie wp ywu szczepionki dro d owej na autochtoniczn mikroflor gleby przechowywanej w odizolowanych pojemnikach zakopanych na g boko 0,6 metra na okres zimy oraz okre lenie dawki i postaci szczepionki Y. lipolytica daj cej najlepsze wyniki w odniesieniu do kie kowania owsa. W pracy badano tak e wp yw postaci preparatu: wolnych komórek (zawiesina) i unieruchomionych w alginianie wapnia (granulki) na zmiany liczebno ci mikroflory gleby i kie kowanie owsa. Wyznaczono równie trwa o preparatu immobilizowanych dro d y poprzez pomiar spr - ysto ci poddanych dzia aniu ró nych czynników. MATERIA I METODY Dro d e: do bada wykorzystano szczep dro d y Y. lipolytica A-101 pochodz cy z kolekcji Katedry Biotechnologii i Mikrobiologii ywno ci Uniwersytetu Przyrodniczego we Wroc awiu. Zapas kultury przechowywano na skosie YM w temperaturze 4ºC. Pod o a: pod o e inokulacyjne w 1 l zawiera o: 2 g peptonu, 2 g ekstraktu dro d owego oraz 40 g syropu glukozowego; pod o e wzrostowe w 1 l zawiera o 1 g ekstraktu dro d owego, 70 g syropu glukozowego, 1 g MgSO 4 x 7 H 2 O, 5 g NH 4 Cl oraz 0,5 g KH 2 PO 4. Hodowla: Biomas uzyskano z hodowli prowadzonej w bioreaktorze AK 210 w temperaturze 28 o C, przy sta ym ph 5,5 (dozowanie NaOH) i napowietrzaniu 1,2 lxmin -1, przez 48 godzin. Inokulum stanowi o dziesi procent obj to ci hodowli. Po 48-godzinnej hodowli otrzymano 5 l zawiesiny biomasy zawieraj cej 6x10 9 komórek dro d y w 1 ml, a w przeliczeniu na such mas 10,8 gxl -1. Acta Sci. Pol.

Bioremediacja z udzia em dro d y 17 Immobilizacja komórek dro d y: do 2000 ml 2,5% alginianu sodu dodawano 500 ml zag szczonej biomasy (zawieraj cej 3 x 10 9 kom x ml -1 ), mieszano, a powsta y roztwór wkraplano za pomoc wieloig owej dyszy do 0,2-molowego roztworu chlorku wapnia. Otrzymano 2,5 l. Ilo komórek w 1 ml wynosi a 1,7 x 10 9. Gleba do oceny trwa o ci pochodzi a z trzech miejsc: z Bornego Sulinowa, Brzegu (gleba po rafinacji oleju rzepakowego) i Granicznej (gleba kontrolna). W celu sprawdzenia wytrzyma o ci powsta ych w procesie immobilizacji dro d y Y. lipolytica oraz ywotno ci wolnych komórek, po wymieszaniu preparatów dro d y z trzema rodzajami gleby (w proporcjach podanych w tab. 1), zakopano je w specjalnych zamkni tych pojemniczkach na g boko ci oko o 0,6 m i przechowywano przez okres pi ciu miesi cy: od 31 pa dziernika do 25 marca. Ko cowa obj to ka dej próby wynosi a 100 ml. Próby wykonano w trzech powtórzeniach. W poni szej tabeli (tab. 1) przedstawiono zawarto gleby oraz szczepionki w poszczególnych wariantach eksperymentu. Próbki gleby po wykopaniu z terenu poddano analizie makroskopowej, sensorycznej, mikrobiologicznej oraz zbadano twardo. Tabela 1. Ilo gleby, oraz p ynnej biomasy dro d y (zawiesiny) w zastosowanych wariantach eksperymentu Table 1. Quantity of soil, beads and yeasts biomass (suspension) in performed variants of experiments Obj to Volume [ml] Miejsce pobrania gleby Soil provenence Gleba:Zawiesina Gleba:Granulki Soil:Suspension Soil:Beads Borne Sulinowo 50:50 50:50 75:25 Brzeg 50:50 50:50 75:25 Granicznaa 50:50 50:50 75:25 Gleba kontrolna Control soil 100 100 100 Analiza mikrobiologiczna: oznaczenie ogólnej liczby drobnoustrojów wykonano metod PCA (plate count agar) na agarze od ywczym. Do oceny ogólnej liczby dro d y i ple ni u yto pod o a agarowego z oksytetracyklin (0,1 gxl -1 ). W celu sprawdzenia obecno ci dro d y Y. lipolytica podobne makroskopowo kolonie przesiewano na pod o- e MMT z dodatkiem 1% heksadekanu [Robak 2002] i pod o e do oceny produkcji kwasów o ph 6,8 zawieraj ce w 1 l 150 g glukozy; 1,0 g MgSO 4 ; 1,5 g NH 4 Cl; 0,2 g KH 2 PO 4, 1 ml roztworu pierwiastków ladowych, 300 μg tiaminy, 22 μg czerwieni bromofenolowej oraz 25 g agaru. W przypadku wzrostu dro d y na pod o u z heksadekanem oraz zmiany zabarwienia pod o a z czerwieni bromofenolow z czerwonego na ó ty produkcja kwasów organicznych mo na przypuszcza o obecno ci dro d y Y. lipolytica. W celu sprawdzenia aktywno ci dro d y unieruchomionych w granulkach posiano je na wy ej wymienione pod o a: do produkcji kwasu cytrynowego oraz do wzrostu na heksadekanie. Analiza twardo ci : twardo kontrolnych ( wie ych), przechowywanych w lodówce, poddanych dzia aniu: temperatury, rodków czysto ci oraz wykopanych z ziemi zbadano za pomoc aparatu INSTRON 5544. Biotechnologia 8(3) 2009

18 A. Kowalczyk i in. Ocena kie kowania owsa: szalki Petriego nape niono gleb w ilo ci 80 g na p ytk, a nast pnie dodano 0,2 lub 2 ml zawiesiny dro d y, albo 0,8; 8 g zawieraj cych dro d e. Po wymieszaniu, na powierzchni gleby na ka d p ytk, wy o ono po 10 ziarniaków owsa. Ka da próba zosta a wykonana w czterech powtórzeniach. Hodowle prowadzono w temperaturze pokojowej, przez okres 24 dni. Pod o e znajduj ce si w p ytce podlewano 25 ml wody destylowanej 2 razy dziennie. Po zako czeniu rekultywacji gleby ziarno zosta o zebrane i okre lono procent ziarna, które wykie kowa o, zmierzono d ugo korzonków, hypokotylu i listków poszczególnych ro lin. WYNIKI I DYSKUSJA W pracy sprawdzano wytrzyma o ci powsta ych w procesie immobilizacji dro d y Y. lipolytica na czynniki rodowiska. W pierwszej kolejno ci badano wp yw niskiej temperatury na ywotno unieruchomionych dro d y podczas ich przetrzymywania w glebie przez okres jesienno-zimowy (~5 miesi cy). W celu zachowania warunków naturalnych pojemniczki z gleb i szczepionk zakopano w ziemi na g boko ci oko o 60 cm. Po okresie przechowywania wykonano porównawcz analiz mikrobiologiczn (rys. 1 i 2). Uzyskane wyniki wskazuj na pozytywny wp yw dodanych dro d y na mikroflor zamkni tej w pojemnikach gleby. Pomimo e ilo mikroorganizmów by a zdecydowanie mniejsza ni w analizach wcze niejszych (jesiennych), wida wzrost liczby mikroorganizmów w próbkach z dodatkiem. Kolejnym dowodem na dzia alno Y. lipolytica mimo mrozu by o wykazanie obecno ci ywych dro d y wykorzystuj cych heksadekan oraz powoduj cych zakwaszenie pod o a hodowlanego w granulkach alginianowych. Granulki te stwierdzono we wszystkich próbach, ale by y stosunkowo ma o wytrzyma e na zgniecenie (tab. 2). W naturalnych warunkach, po dwuletnim okresie pobytu w glebie granulki ulegaj rozk adowi (dane nie publikowane), podobnie jak ulegaj rozpadowi pod wp ywem rodków czysto ci (tab. 3) i nie nadaj si do stosowania w przypadku cieków neutralizowanych NaOH. Obok pozytywnego wp ywu dodatku dro d y Y. lipolytica na autochtoniczn mikroflor wykazano, e ich obecno w glebie (zarówno w postaci zawiesiny, jak i alginianowych) stymulowa a proces kie kowania ziarna oraz rozwój kie ków (tab. 4). Dro d e powodowa y wzrost d ugo ci korzonków, hypokotylu i listków ro lin w porównaniu z ro linami uzyskanymi w próbie kontrolnej. Udzia wykie kowanego ziarna w ich obecno ci równie by wi kszy ni w próbie kontrolnej. W próbach z dodatkiem zawiesiny dro d y najlepsze wyniki uzyskano przy obj to ci 2 ml zawiesiny, gdzie ziarno wykie kowa o w 67,5%, a rednie d ugo ci korzeni, hypokotylu i listków wynosi y odpowiednio: 4,16, 2,78 i 4,62 cm. Nieco mniejszy procent skie kowanego ziarna uzyskano w próbach z dodatkiem 0,8 g : 62,5%. Za to rednie d ugo ci korzeni, hypokotylu oraz listków by y najwi ksze ze wszystkich prób, bo wynosi y odpowiednio: 6,44, 3,15 i 6,00 cm. W próbie kontrolnej wykie kowa o 47% ziarniaków, a rednie d ugo ci korzeni, hypokotylu oraz listków liczy y odpowiednio 2,32, 1,66 i 2,8 cm. Zatem dodatek unieruchomionych dro d y ponad dwukrotnie poprawi mierzone parametry kie kowania owsa. Acta Sci. Pol.

Bioremediacja z udzia em dro d y 19 Log JTKxg -1 CFUxg -1 5 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 50 ml gleby + 50 ml 75 ml gleby + 25 ml 50 ml gleby + 50 ml zawi esiny Kontrola Control 100ml gleby Stosunek gleby do dro d y Soil-yeasts ratio Borne Sulinowo Brzeg Graniczna Rys. 1. Ogólna liczba bakterii w próbkach gleby przechowywanych przez 3 miesi ce zimy Fig. 1. Total number of bacteria in soil samples maintained during 3 winter months Log JTKxg 5-1 CFUxg -1 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Kontrola Control 50 ml gleby + 50 ml 75 ml gleby + 25 ml 50 ml gleby + 50 ml 100ml gleby zawiesiny Stosu nek gleby do dro d y Soil-yeast ratio Borne Sulinowo Brzeg Graniczna Rys. 2. Ogólna liczb dro d y i ple ni w próbkach gleby przechowywanych przez 3 miesi ce zimy Fig. 2. Total number of yeast and molds in soil samples maintained during 3 winter months Biotechnologia 8(3) 2009

20 A. Kowalczyk i in. Tabela 2. Warto si y [N] potrzebnej do zgniecenia alginianowych oraz ocena wizualna Table 2. Value of force [N] needed to crack alginate beads and beads visual appreciation Rodzaj Type of beads wie o otrzymane Freshly obtained Po 133 dniach w glebie After 133 days in soil Po 7 dniach w ciekach After 7 days in wastewater treatment wie o otrzymane Freshly obtained Po 13 dniach w glebie After 13 days In soil Po 30 dniach w glebie After 30 days in soil * rednia si a [N] z 10 pomiarów Means force [N] of 10 measures rednica Diameter of beads [mm] Si a zgniecenia* Crack force * [N] Ocena wizualna Visual appreciation IMMOBILIZACJA I IMMOBILISATION I 2,0 4,63 spr yste, prze roczyste, kuliste, wszystkie granulki p k y 4,5 3,92 elastic, transparent, round, all beads cracked 1,7 Pomiar niemo liwy Immossible to measure 2,0 1,59 suche, drobne, sp aszczone, bez spr ysto ci, mi kkie, barwa ziemi, adne nie p kaj, wszystkie s mia d one dry, small, flat, without previous elasticity, soft, soil colored, all did not cracked but were deformed to flat form spr yste, ma o prze roczyste, kuliste, wszystkie granulki p k y elastic, nontransparent, round, all beads crack IMMOBILIZACJA II IMMOBILISATION II 1,5 5,17 5,0 6,92 3,5 6,59 3,3 11,40 spr yste, prze roczyste, kuliste, wszystkie granulki p k y elastic, transparent, round, all beads crack mniej spr yste ni wie e, barwa ziemi, kuliste, nie wszystkie p kaj, niektóre ulegaj zmia d eniu less elastic, non all cracked, soil colored, some were deformed to flat form barwa ziemi, cz ciowo sp aszczone, nie wszystkie p kaj, niektóre ulegaj zmia d eniu soil colored, some flat, non all cracked, some were deformed to flat form Acta Sci. Pol.

Bioremediacja z udzia em dro d y 21 Tabela 3. Wp yw rodków czysto ci na trwa o. Warto si y [N] potrzebna do zgniecenia Table 3. Effect of detergents on beads form. Value of force [N] needed to crack the beads Rodzaj Type of algina te beads Woda kontrola Water control Proszek do prania Dosia Washing powder Dosia P yn do mycia naczy Ludwik Liquid dishes cleaner Ludwik P yn do mycia naczy Pur extra Liquid dishes cleaner Pur extra rodek czyszcz co-dezynfekuj cy Domestos Liquid cleaner- -disinfector Domestos * rednia si a [N] z 10 pomiarów Means force [N] of 10 measures rednica Diameter of beads [mm] Si a zgniecenia * Crack force * [N] Uwagi Notes 1,5 4,63 Kszta t kulisty po 7 dniach 5,0 6,56 Round form after 7 days 1,5 Ca kowicie up ynnione po 24 h 5,0 Totally liquefied after 24 hours 1,5 Ca kowicie up ynnione po 48 h Totally liquefied after 48 hours Up ynnione cz ciowo po 48 h 5,0 Partially liquefied after 48 hours 1,5 Up ynnione cz ciowo po 48 h 5,0 Partially liquefied after 48 hours 1,5 Up ynnione ca kowicie po 48h 5,0 Partially liquefied after 48 hours Wszystkie wymienione czynniki s kolejnymi dowodami na wielokierunkow mo liwo wykorzystania dro d y Y. lipolytica. Szczególnie, e jest to gatunek niepatogeniczny dla cz owieka [Yoshida i Hashimoto 1986]. Mo e by zatem wykorzystany nie tylko w bioremediacji gleby zanieczyszczonej rop, ale tak e w oczyszczaniu rodowiska z pestycydów [Prz do i in. 2004], poprawiaj c ukorzenianie i rozwój ro lin [Vassilev i in. 2001a, 2001b]. Mo liwe jest równie jednoczesne stosowanie preparatów dro d y oraz wysiewu ro lin charakteryzuj cych si zdolno ciami do fitoremediacji [Kondzielski i Buczkowski 1999]. Podsumowuj c, mo na stwierdzi, e otrzymane wyniki zdecydowanie zach caj do dalszej kontynuacji bada nad bioremediacj gleby ze zwi zków ropopochodnych przy u yciu dro d y Y. lipolytica. W szczególno ci nad produkcj biopreparatów dro d y tego gatunku przeznaczonych do bezpo redniego wprowadzania do gleby. WNIOSKI 1. Dodatek preparatu dro d y (wolne lub unieruchomione komórki, wp ywa na wzrost liczby mikroorganizmów gleby i poprawia rozwój ro lin. 2. Preparat immobilizowanych dro d y wykazuje pozytywne dzia anie po 5-miesi cznym jesienno-zimowym okresie przechowywania w glebie na g boko ci 0,6 m i zawiera ywe komórki. 3. Uzyskane granulki ulegaj up ynnieniu w obecno ci rodków czysto ci. Biotechnologia 8(3) 2009

22 A. Kowalczyk i in. Podzi kowanie. Autorzy dzi kuj dr hab. Agnieszce Kicie z Katedry Technologii Rolnej i Przechowalnictwa Uniwersytetu Przyrodniczego we Wroc awiu za pomoc przy pomiarze spr ysto ci alginianowych. PI MIENNICTWO Kondzielski I., Buczkowski R.,1999. Fitoremediacja nowa, obiecuj ca metoda stosowana w ochronie rodowiska. Ekologia i Technika, 3, 79 84. Lisowska K., D ugo ski J., 2003 Biodegradacja zwi zków ropopochodnych przez grzyby strz pkowe. Biotechnologia, 4(63), 92 100. Mrozik A., Piotrowska-Seget Z., abu ek S., 2005. Bacteria in bioremediation of hydrocarbon contaminated environments. Post. Mikrobiol., 44 (3), 227 23. Paul E.A., Clark E.F., 2000. Mikrobiologia i biochemia gleb. Lublin. Prz do D., Robak M., Steininger M., 2004. Biodegradation of chloroorganic pesticides by Yarrowia lipolytica, [in:] New agrochemicals and their safe use for health and environment, Chemistry for Agriculture, 5, 326 331. Robak M., 2002. Studia nad wykorzystaniem octanu i wydzielaniem cytrynianu przez dro d e Yarrowia lipolytica. Zesz. Nauk. AR Wroc., Technologia ywno ci, Nr 442, Rozprawy CXCII, 1 91. Robak M., 2006. Czy mo liwa jest bioremediacja rodowiska z udzia em dro d y Yarrowia lipolytica? Ekonatura, 3, 22 23. Robak M., oga a B., Rymowicz W., Wojtatowicz M., 2006. Zg oszenie patentowe P-38007. Robak M., oga a B., Seweryn M., Dubiel R., 2007. Zastosowanie dro d y Yarrowia lipolytica do usuwania zanieczyszcze ropopochodnych z gruntu metod in situ. III Kongres Biotechnologii, Pozna, poster T2/47. Takita E., Koyama H., Hara T., 1999. Organic Acid Metabolism in Aluminium-Phosphate Utilizing Cells of Carrot (Daucus carota L.). Plant Cell Physiol., 40(5), 489 495. Vassilev N., Vassileva M., Azcon R., Medina A., 2001a. Application of free and Ca-alginateentrapped Glomus deserticola and Yarrowia lipolytica in soil-plant system. Journal of Biotechnology, 91, 237 242. Vasilev N., Vassileva M., Azcon R., Medina A., 2001b. Interactions of an arbuscular mycorrhizal fungus with free or co-encapsulated cells of Rhizobium trifoli and Yarowia lipolytica inoculated into soil-plant system. Biotechnology Letters, 23, 149 151. Wójcik P., Tomaszewska B., 2005. Biotechnologia w remediacji zanieczyszcze organicznych. Biotechnologia 4 (71),156-172. Yoshida M., Hashimoto K., 1986. Assessment of the pathogenicity of yeast used in the production of single cell protein. Agric. Biol. Chem., 50(8), 2117 2118. oga a B., Robak M., Rymowicz W., Wzientek K., Rusin M., Maruszczak J., 2005. Geoelectrical Observation of Yarrowia lipolytica Bioremediation of Petrol-Contaminated Soil. Polish Journal of Environmental Studies, 14 (5), 665 669. oga a B., Dubiel R., Robak M., Zuberek W.M., Wzientek K., 2008. Observation of the bioremediation of oil contaminated soils-application of EM and resistivity imaging methods, Near Surface 2008, 14th European Meeting of Environmental and Engineering Geophysics, Kraków, BO4, str. 4. Acta Sci. Pol.

Bioremediacja z udzia em dro d y 23 YARROWIA LIPOLYTICA IN BIOREMEDIATION: CELLS ENTRAPPED IN ALGINATE AND THEIR INFLUENCE ON AUTOCHTHONIC MICROFLORA AND OATS GERMINATION Abstract. In this work the influence of atmospheric conditions on stability of alginate beads containing immobilized Yarrowia lipolytica yeast cells after their storage in field during five months of autumn-winter was measured. In laboratory, the influence of soil supplementation by yeasts on oats germination and autochthonic soil microflora was analyzed. Autumn-winter storaged beads contained living Y. lipolytica yeasts. Beads presence had a positive effect on autochthonic microflora, causing increase of microbial cells number. In laboratory tests, supplementation of soil by yeasts preparation (suspension or beads) caused amelioration of oats germination and increase in autochthonic microbial cells number. Obtained results clearly encourage to continue the study on formulation of Y. lipolytica yeasts bioproduct, designated to direct soil application. Key words: Yarrowia lipolytica, soil bioremediation, alginate beads stability Zaakceptowano do druku Accepted for print: 30.09.2009 Do cytowania For citation: Kowalczyk A., Michniewicz M., Robak M., 2009. Bioremediacja z udzia em dro d y Yarrowia lipolytica: unieruchomione w alginianie komórki oraz ich wp yw na autochtoniczn mikroflor gleby i kie kowanie owsa. Acta Sci. Pol. Biotechnol. 8(3), 15 24. Biotechnologia 8(3) 2009