Wyścigi w polu elektrycznym - czyli słów kilka o nowoczesnych technikach elektromigracyjnych Paweł Kubalczyk Katedra Chemii Środowiska Wydział Chemii UŁ
Mieszaniny Mieszanina to układ dwóch lub więcej składników (pierwiastków lub związków chemicznych) zmieszanych z sobą w dowolnym stosunku i wykazujących swoje indywidualne właściwości 2
Podział mieszanin Mieszaniny niejednorodne (heterogeniczne) Mieszaniny jednorodne (homogeniczne) W mieszaninach niejednorodnych ich składniki można odróżnić bez pomocy aparatury analitycznej, wzrokowo. Np. piasek z wodą, zaprawa murarska, kawa mielona z wodą, groch z fasolą W mieszaninach jednorodnych odróżnienie ich składników jest zazwyczaj niemożliwe gołym okiem, przy pomocy lupy lub mikroskopu. Np. stopy metali (brąz, mosiądz itp.), benzyna, ocet, roztwory wodne soków, powietrze. 3
Niektóre sposoby rozdzielania mieszanin Przesiewanie np. przez sito Sączenie (filtracja) Wirowanie Sedymentacja Dekantacja Odparowanie Krystalizacja Destylacja 4
Historia elektroforezy 1909 rok - Michaelis wprowadza pojęcie elektroforezy Twórcą elektroforezy był szwedzki uczony Arne Tiselius Pierwszy eksperyment rozdzielanie mieszaniny białek, rok 1937 Nagroda Nobla w 1948 roku 1967 rok zastosowanie przez Hjertena szklanych kapilar o średnicy wewnętrznej 3 mm 1983 rok pierwsze kapilary krzemionkowe o średnicy wewnętrznej 100 mm Arne Wilhelm Kaurin Tiselius 1902-1971 1984 rok pierwsze zastosowanie elektroforezy do rozdzielania cząstek nieposiadających ładunku Rozwój aparatury, miniaturyzacja 5
Elektroforeza jest to ruch naładowanych cząstek pod wpływem przyłożonego pola elektrycznego. Elektroforeza to narzędzie analityczne stosowane do analizy i oczyszczania: - bardzo dużych cząsteczek (białka, kwasy nukleinowe) - prostych cząstek (proste jony, aminokwasy, peptydy). 6
Prędkość migracji jonu w elektroforezie v = m e E gdzie v = prędkość jonu µ = e ruchliwość elektroosmotyczna (cm 2 / Vs) E = zastosowane pole elektryczne (V) 7
Ruchliwość jonu m e = q 6phr gdzie q = ładunek jonu h = lepkość roztworu r = promień jonu 8
Prędkość poruszania się jonów w polu elektrycznym V 1 V 2 V 3 V 1 < V 2 < V 3 V 2 = 2V 1 V 3 = 2V 2 = 4V 1 9
Taka sama moc silników 10
Elektroforeza żelowa 11
Elektroforeza makromolekuł jest prowadzona poprzez wprowadzenie cienkiej warstwy próbki do roztworu stabilizowanego porowatą matrycą (żelem). Pod wpływem przyłożonego napięcia molekuły zawarte w próbce poruszają się w żelu z różną prędkością, po zakończeniu rozdzielania są wykrywane w innych miejscach matrycy. 12
Najczęściej stosuje się żele wykonane z agarozy lub poliakrylamidu Agaroza złożony łańcuch cukrowy otrzymywany z morskich wodorostów. Jest ona powszechnie stosowana w żywności (lody, bita śmietana, galaretki). Ma pory o dużej wielkości, dobre do szybkiego rozdzielania dużych cząstek. Wodorosty Poliakrylamid łańcuch złożony z cząsteczek kwasu akrylowego. Jest często używany do tworzyw sztucznych i gumy. Ma mały rozmiar porów, dobry do powolnego rozdzielania drobnych cząsteczek. Akrylamid 13
żel poliakrylamidowy tunele o różnych średnicach Żel jest koloidem w formie stałej (jego 99% stanowi woda). Matryca żelu pełni funkcję sita molekularnego. Podczas elektroforezy, przyłożone pole elektryczne wymusza ruch makromolekuł poprzez pory w żelu. agaroza Makromolekuły migrują z różną prędkością zależną głównie od promienia cząsteczki. 14
W większości urządzeń do elektroforezy żel montowany jest pomiędzy dwoma zbiornikami zawierającymi bufor, w taki sposób aby jedyną drogą przepływu prądu był żel. Żel w postaci pionowej rurki lub płytki (A-B) pozwala na najefektywniejsze wykorzystanie pola elektrycznego. Występują jednak pewne problemy w zaprojektowaniu aparatury, ponieważ połączenia muszą być szczelne, bezpieczne elektrycznie i wygodne w obsłudze. W przypadku podwodnego żelu (submarine gel) jest on umieszczony w pozycji poziomej na platformie pomiędzy zbiornikami z buforem, w taki sposób że na kilka milimetrów jest zanurzony w buforze (C). 15
16
Prawidłowe wprowadzenie próbki do studzienki Nieprawidłowe wprowadzenie próbki, przebita studzienka Zbyt dużo próbki w studzience 17
18
Wizualizacja poprzez barwienie żelu Proteiny są zazwyczaj barwione srebrem lub błękitem Coomassie. Barwienia błękitem Coomassie jest powszechnie stosowane ze względu na prostotę i wygodę. Żel jest zanurzany w roztworze barwnika na kilkadziesiąt minut, a następnie przenoszony do innego roztworu gdzie jest odmywany jego nadmiar, który nie został związany z białkiem. Błękit Coomassie wiąże się z białkiem w stosunku stechiometrycznym, dlatego ta metoda barwienia jest preferowana przy densytometrycznym oznaczaniu ilości białek. 19
Elektroforeza kapilarna
Porównanie elektroforezy kapilarnej z elektroforezą żelową 25-75 cm Żel 5-25 cm 300-400 µm 5-25 cm 1-2 mm 25-75 µm W elektroforezie kapilarnej mamy możliwość zastosowania wyższego napięcia wysoka sprawność, krótsze czasy analizy 21
Budowa aparatury do elektroforezy kapilarnej 22
Powstawanie przepływu elektroosmotycznego Ujemnie naładowana powierzchnia krzemionki (Si-O - ) Przyciągane kationy gromadzą się w pobliżu ściany kapilary Przepływ w kierunku katody pod wpływem zastosowanego pola elektrycznego 23
Kolejność poruszania się jonów w kapilarnej elektroforezie Nurt rzeki V N V w V w V 3 V 2 V 1 V 3 = V N V w, gdy V N > V w V 2 = V N V 1 = V N + V w V 3 = V w V N, gdy V N < V w 24
Migracja wspomagana EOF w kapilarnej elektroforezie strefowej 25
Micelarna elektrokinetyczna chromatografia
Micelarna elektrokinetyczna chromatografia Najczęściej zastosowanie znajdują anionowe środki powierzchniowo czynne, najpopularniejszym z nich jest dodecylosiarczan sodu (SDS). Pojedyncze cząsteczki SDS wprowadzone do wody w odpowiednim stężeniu (powyżej CMC) tworzą micele, hydrofobowe fragmenty zorientowane do środka tworzą rdzeń, fragmenty hydrofilowe zorientowane są na zewnątrz. 27
Micele są tworami dynamicznymi z czasem życia mniejszym niż 10 ms CMC w wodzie 8 mm, w roztworach buforowych nawet 3 mm. System MEKC składa się z dwóch faz: fazy wodnej i micelarnej. Micele posiadają duży ładunek ujemny więc poruszają się w kierunku anody, czyli przeciwnie do EOF z którym wędrują obojętne anality. 28
Trojakiego rodzaju mechanizmy oddziaływania analitu z micelą: (1) włączenie analitu do hydrofobowego rdzenia, (2) adsorpcja analitu na powierzchni i (3) włączenie analitu w charakterze kosurfaktanta. 29
Zasada rozdzielania w micelarnej elektrokinetycznej chromatografii 30
Kapilarne izoelektroogniskowanie
Kapilarne ogniskowanie izoelektryczne polega na rozdzielaniu składników mieszaniny na podstawie różnic w wartościach ich punktów izoelektrycznych. Punkt izoelektryczny (pi) to taka wartość ph dla której dana cząsteczka nie posiada ładunku lub posiada ładunek netto równy 0. Przykładem mogą być białka, peptydy, aminokwasy. 32
Ogniskowanie polega na skupieniu w jednym miejscu w kapilarze (odpowiednie ph) cząsteczek o określonym punkcie izoelektrycznym. 33
Zastosowanie technik elektromigracyjnych Przemysł farmaceutyczny Przemysł chemiczny Przemysł kosmetyczny Przemysł spożywczy Medycyna Ochrona środowiska Rolnictwo Laboratoria badawcze Kryminalistyka 34