Zmiany aktywności dysmutazy ponadtlenkowej i katalazy w zróżnicowanych wiekowo krwinkach czerwonych u osób starszych

Olędzki Probl Hig R, Epidemiol Harasym J. 2017, Zmiany 98(1): aktywności 89-98 dysmutazy ponadtlenkowej i katalazy w zróżnicowanych wiekowo krwinkach... 89 Zmiany aktywności dysmutazy ponadtlenkowej i katalazy w zróżnicowanych wiekowo krwinkach czerwonych u osób starszych Changes in activity of superoxide dismutase and catalase in different-age red blood cells in elderly people Remigiusz Olędzki 1/, Joanna Harasym 1,2/ 1/ Katedra Biotechnologii i Analizy Żywności, Uniwersytet Ekonomiczny we Wrocławiu 2/ Laboratorium Bio-Ref Lab, Katedra Biotechnologii i Analizy Żywności, Uniwersytet Ekonomiczny we Wrocławiu Wprowadzenie. Podstawową funkcją erytrocytów jest transport tlenu z płuc do tkanek oraz dwutlenku węgla z tkanek do płuc. Erytrocyty są zdolne do przenoszenia tlenu dzięki zawartości hemoglobiny, która jednakże poprzez proces autooksydacji jest źródłem reaktywnych form tlenu (RFT). Pod wpływem RFT i stresu tlenowego erytrocyty ulegają uszkodzeniom oksydacyjnym i funkcjonują mniej sprawnie. Cel. Znalezienie odpowiedzi na pytanie, czy nowopowstałe erytrocyty u osób starszych wykazują podobną skuteczność w przeciwdziałaniu RFT, co krwinki tego samego wieku biologicznego u osób młodych. Materiały i metody. Materiał stanowiły ludzkie erytrocyty pochodzące od zdrowych osób znajdujących się w różnym okresie starości. Erytrocyty rozdzielano na dwie frakcje młodych i starych krwinek czerwonych oraz mierzono aktywność dysmutazy ponadtlenkowej (ZnCuSOD) i katalazy (CAT) oraz określano zawartość dialdehydu malonowego (MDA). Starszych ( 60 r.ż.) uczestników (łącznie 80 osób) podzielono na 4 grupy wiekowe. Grupę kontrolną stanowiło 20 osób zdrowych w wieku 20-29 lat. Wyniki. Stwierdzono obniżenie aktywności ZnCuSOD we wszystkich grupach badanych ochotników względem grupy kontrolnej oraz w starych erytrocytach względem młodych krwinek. W erytrocytach ochotników z grupy I (70-79 lat) i IV ( 90 lat) zaobserwowano obniżenie aktywności CAT względem grupy kontrolnej. Aktywność katalazy w starych erytrocytach względem młodych erytrocytów była obniżona jedynie w grupie I (60-69 lat) oraz III (80-89 lat). Zanotowano również różnicę w zawartości MDA w erytrocytach pomiędzy grupą kontrolną, a grupami starszych ochotników w wieku 80-89 lat i 90 lat oraz zaobserwowano wzrost MDA w starych erytrocytach względem młodych erytrocytów we wszystkich grupach badanych osób. Wnioski. Wykazano, że poziom obrony antyoksydacyjnej erytrocytów w okresie ich ponad studniowego życia, zarówno u młodych, jak i starszych osób zdrowych nie jest stały i ulega obniżeniu w procesie fizjologicznego starzenia się organizmu. Introduction. The primary function of erythrocytes is oxygen transport from lungs to tissues and carbon dioxide from tissues to lungs. Erythrocytes carry oxygen due to the presence of hemoglobin which however, by autooxidation, is a source of reactive oxygen species (ROS). Under the ROS influence and oxidative stress erythrocytes undergo oxidative damage and function less efficiently. Aim. To determine whether newly formed erythrocytes in the elderly show similar efficacy in preventing ROS as cells of the same biological age in young people. Material & Method. The material were erythrocytes from healthy people at different stages of old age. Erythrocytes were separated into two fractions young and old, and the activity of superoxide dismutase (ZnCuSOD), catalase (CAT) and content of malondialdehyde (MDA) were measured. The control group consisted of 20 healthy people aged 20-29 years. Results. The decreased activity of ZnCuSOD was found in all groups and in old vs. young erythrocytes. The decreases in CAT activity was observed within the erythrocytes of group I (70-79 years) and IV ( 90 years). The activity of catalase in old vs. young erythrocytes was reduced only in groups I (60-69 years) and III (80-89 years). There was also a significant difference in the MDA concentrations in erythrocytes between the controls and the groups aged 80-89 years and 90 years and its increase was reported in old vs. young erythrocytes in all groups. Conclusion. The level of antioxidant defense of erythrocytes during their over 100-day lifespan is not constant both in young and old healthy individuals and is reduced in the process of physiological aging. Key words: oxidative stress, antioxidant defense mechanisms, red blood cells, reactive oxygen species, aging Słowa kluczowe: stres oksydacyjny, mechanizmy obrony antyoksydacyjnej, krwinki czerwone, reaktywne formy tlenu, starzenie Probl Hig Epidemiol 2017, 98(1): 89-98 www.phie.pl Nadesłano: 29.08.2016 Zakwalifikowano do druku: 15.01.2017 Adres do korespondencji / Address for correspondence dr Remigiusz Olędzki Katedra Biotechnologii i Analizy Żywności, Uniwersytet Ekonomiczny ul. Komandorska 118/120, 53-345 Wrocław tel. 713 68 07 69, e-mail: remigiusz.oledzki@ue.wroc.pl

90 Probl Hig Epidemiol 2017, 98(1): 89-98 Wprowadzenie W określonych sytuacjach fizjologicznych, takich jak starzenie się komórek i tkanek, które charakteryzuje się stopniowym ogólnym osłabieniem aktywności enzymów cytoplazmatycznych, ekspozycja na tworzące się (nawet w nieznacznych fizjologicznych ilościach) reaktywne formy tlenu (RFT) może prowadzić do powstania rozległych uszkodzeń oksydacyjnych w obrębie procesowo istotnych struktur komórkowych. Starzenie się komórek, które w warunkach fizjologicznych postępuje stopniowo, w sytuacji oddziaływania zwiększonych ilości RFT, ulega przyspieszeniu na skutek intensyfikacji wielu patologicznych zmian zachodzących w strukturze białek, lipidów i kwasów nukleinowych. Zmiany te mogą podlegać częściowej naprawie przez systemy naprawcze samych komórek, jednakże jeśli są bardzo zaawansowane i dotyczą rozległych przedziałów subkomórkowych, wtedy komórka przestaje prawidłowo funkcjonować i ulega procesowi samodestrukcji, zwanemu apoptozą lub jest usuwana z organizmu przez wyspecjalizowane zespoły komórek, jak np. układ fagocytów jednojądrzastych czy komórki gleju drobnokomórkowego [1, 2]. Procesom wolnorodnikowym podlegają również erytrocyty wysoce wyspecjalizowane komórki, odpowiedzialne za transport tlenu z płuc do poszczególnych tkanek organizmu [3]. Podstawą komórkowej antyoksydacyjnej obrony erytrocytów jest układ enzymatyczny obejmujący enzymy o działaniu przeciwwolnorodnikowym, do których należy dysmutaza ponadtlenkowa (ZnCuSOD), katalaza (CAT) oraz enzymy glutationo-zależne, jak peroksydaza glutationowa (GPx), transferaza glutationowa (GST) czy reduktaza glutationowa (GR). Uzupełnieniem enzymatycznego układu antyoksydacyjnego są przeciwutleniacze drobnocząsteczkowe, neutralizujące bezpośrednio działanie wolnych rodników tlenowych [4]. Efektywny system obrony antyoksydacyjnej jest szczególnie ważny ze względu na główną funkcję erytrocytów, jaką jest transport cząstkowego tlenu. Zadanie to, które realizowane jest przez krwinki czerwone przez cały 4-miesięczny okres ich życia (ok. 120 dni) nierozerwalnie wiąże się z indukcją reaktywnych form tlenu [5]. Wiele hipotez wyjaśniających przebieg i przyczyny starzenia się organizmu, wiążą ten nieodwracalny proces ze zmianami zachodzącymi w obrębie komórek zdolnych do podziału (np. w fibroblastach), jak również w tych, których regeneracja jest silnie ograniczona (np. neuronów) i możliwa tylko w wybranych obszarach danego układu i tylko przy bardzo specyficznych uwarunkowaniach [6]. Istnieją również hipotezy tłumaczące zjawisko starzenia się, procesami degradacji substancji pozakomórkowej (np. kolagenu tkanki łącznej) [7]. Jednym z częściej przytaczanych poglądów wyjaśniających przyczyny obniżenia z wiekiem biologicznej zdolności organizmu do zastępowania zużytych lub uszkodzonych komórek nowymi i w pełni sprawnymi, jest teoria stopniowego wygaszania czynności życiowych komórek. Powyższe zjawisko następuje w wyniku utraty przez starzejący się organizm zdolności do przekazywania pełnej informacji dotyczącej metabolicznego, enzymatycznego i genetycznego funkcjonowania każdej z nowo powstałych komórek po podziale komórki macierzystej. W tego rodzaju komórkach, charakteryzujących się obniżoną zdolnością do regeneracji, następuje naturalne nagromadzenie uszkodzeń wewnątrzkomórkowych. W sytuacji, gdy przerastają one możliwości naprawcze organizmu, procesy rozpadu (katabolizmu) zyskują przewagę nad procesami syntezy (anabolizmu) [8, 9]. Starzejące się komórki charakteryzują się ograniczoną zdolnością do pobierania, przechowywania i przetwarzania metabolitów oraz składników odżywczych. W tej sytuacji pozbawione energii komórki ulegają częstym uszkodzeniom oraz nie są w stanie podtrzymywać aktywności białek (np. białek transportujących, tzw. pomp błonowych) i lipidów błonowych, niezbędnych do utrzymania właściwego kształtu komórek i wypełniania ich standardowych funkcji [10, 11]. Powyższe zjawiska i procesy mają szczególne znacznie w odniesieniu do krwinek czerwonych, dla których utrzymanie właściwego kształtu jest kluczowe, gdyż zapewnia erytrocytom korzystny stosunek powierzchni do objętości, a tym samym wysoką wydajność wymiany gazowej pomiędzy erytrocytami a otoczeniem przestrzeni pęcherzykowej [12, 13]. Na skutek zmian w budowie morfologicznej erytrocytów następuje zaburzenie funkcjonowania krwinek czerwonych, a w konsekwencji (szczególnie u starszych organizmów) zwiększone ich wychwytywanie i niszczenie w układzie siateczkowo-śródbłonkowym śledziony. Zjawiska te są szczególnie nasilone, gdy współtowarzyszą zaburzeniom natury dziedzicznej, określanym mianem sferocytozy, która z kolei często jest przyczyną nabytej niedokrwistości hemolitycznej. W konsekwencji nieprawidłowo funkcjonujące krwinki czerwone zwiększają podatność na dysfunkcje układu sercowo-naczyniowego oraz płuc, co może przyśpieszać fizjologiczne procesy starzenia, a tym samym śmierć organizmu [14, 15]. Kolejnym istotnym czynnikiem mającym wpływ na właściwości krwinek czerwonych i utrzymanie ich właściwego kształtu jest zdolność do przeciwdziałania wolnym rodnikom tlenowym, których produkcję uważa się za stały element metabolizmu tlenowego komórek. Jednakże w przypadku krwinek czerwonych, charakteryzujących się silnie zredukowanym metabolizmem tlenowym (wynikającym m.in. z braku mito-

Olędzki R, Harasym J. Zmiany aktywności dysmutazy ponadtlenkowej i katalazy w zróżnicowanych wiekowo krwinkach... 91 chondrium) powstawanie RFT jest przede wszystkim konsekwencją wynikającą z czasowego przebywania w środowisku bogatym w tlen i transportowania tego gazu do tkanek [12]. Jednym z częściej przytaczanych poglądów wyjaśniających wysoką toksyczność tlenu wobec erytrocytów jest tzw. teoria ponadtlenkowa, według której tlen odpowiedzialny jest za nadmierną produkcję anionorodników ponadtlenkowych [3, 16]. Wykazano, że źródłem anionorodnika ponadtlenkowego (O 2.) w krwinkach czerwonych jest głównie proces autooksydacji hemoglobiny do methemoglobiny, chociaż powstawanie RFT w erytrocytach wiąże się również z procesem uwalniania hemu ze zdenaturowanej hemoglobiny oraz uwalnianiem jonów żelaza II (Fe 2+ ) z pierścienia hemowego [17, 18]. Te fizjologiczne procesy są szczególnie widoczne u osób starszych, których krwinki czerwone znajdując się w bezpośrednim kontakcie z tlenem, dysponują jednocześnie osłabioną aktywnością antyoksydacyjną [19]. Wraz z wiekiem organizmu, jak i wiekiem samych komórek, a także pod wpływem różnorodnych czynników środowiskowych, żywotność erytrocytów ulega obniżeniu. Znajdujące się w krwiobiegu erytrocyty, w trakcie wypełniania swoich funkcji są stale narażone na atak ze strony RFT, które powodują uszkodzenia błony komórkowej i degradację hemoglobiny. W konsekwencji oksydowana hemoglobina ma słabe powinowactwo do tlenu, a błony komórkowe erytrocytów tracą swoją elastyczność, co powoduje, że uszkodzone wolnorodnikowo erytrocyty są ostatecznie usuwanie z krwiobiegu [5, 20]. Obniżający się w wyniku stresu oksydacyjnego komórkowy potencjał antyoksydacyjny powoduje, że struktury lipidowe i białkowo-lipidowe erytrocytów łatwo podlegają procesom peroksydacji rodnikowej. Proces peroksydacji lipidów uznaje się za podstawowy mechanizm powstawania niekorzystnych zmian zachodzących w strukturze błony komórkowej erytrocytów. Błona komórkowa erytrocytów, która zbudowana głównie z wielonienasyconych kwasów tłuszczowych lub reszt wielonienasyconych kwasów tłuszczowych wchodzących w skład fosfolipidów, traci elastyczność i zdolność do odkształcania. W następstwie tych uszkodzeń, erytrocyty poddawane dużym naciskom ulegają mechanicznym pęknięciom albo po uwolnieniu od zewnętrznych naprężeń nie odzyskują pierwotnego kształtu. Erytrocyty, które pozbawione są elastyczności nie mogą się swobodnie przeciskać przez naczynia włosowate, powodując w konsekwencji ich zaczopowanie [13, 21]. Fizjologiczna odkształcalność oraz ściśliwość erytrocytów odgrywa zasadniczą rolę w realizacji głównej funkcji tych komórek, jaką jest transport tlenu w krążeniu ustrojowym. Krwinki czerwone transportując krew do tkanek są poddawane dużym odkształceniom w trakcie wielokrotnie powtarzanych pasaży przez drobne naczynia krwionośne i włosowate naczynia okienkowane śledziony. Pomimo, że zdecydowana większość krwinek czerwonych, które utraciły opisane wyżej właściwości, jest usuwana w układzie siateczkowo-śródbłonkowym, to w przybliżeniu 10% krążących w ustroju erytrocytów ulega rozpadowi poza układem fagocytów jednojądrzastych. Intensywność tego zjawiska nasila się wyraźnie w niektórych stanach patologicznych (np. w niedokrwistości hemolitycznej), ale również towarzyszy procesowi starzenia się organizmu [5]. Zdolność do odkształcalności erytrocytów, która ulega zaburzeniu w różnych warunkach patofizjologicznych, np. w trakcie stresu oksydacyjnego, jest również ważnym czynnikiem wpływającym na lepkość krwi, a tym samym sprawność krążenia krwi w organizmie [22, 23]. Dlatego znajomość potencjału antyoksydacyjnego erytrocytów wynikającego z aktywności poszczególnych enzymów antyoksydacyjnych, może okazać się kluczowa w zrozumieniu zaburzeń transportu tlenu i CO 2 w organizmie starszych ludzi. Cel Ocena zmian aktywności dwóch enzymów antyoksydacyjnych, dysmutazy ponadtlenkowej (ZnCuSOD) oraz katalazy (CAT) w trakcie procesu starzenia się erytrocytów. Drugim podstawowym celem pracy było określenie poziomu peroksydacji lipidów krwinek czerwonych w trakcie starzenia się zarówno krwinek czerwonych, jak i całego organizmu. Materiały i metody W badaniu wzięło udział 100 zdrowych osób ochotników w wieku 20-96 lat (tab. I). Przed bezpośrednim zaangażowaniem do badań ze wszystkimi ochotnikami przeprowadzono standaryzowany wywiad lekarski dotyczący aktualnych dolegliwości, przebytych chorób oraz rozpoznania nawyków żywieniowych i określenia czasu ich trwania. Następnie przeprowadzono kompleksowe badania lekarskie ochotników, które miały na celu potwierdzić zadowalający stan zdrowia oraz wyeliminować obecność schorzeń przewlekłych, jak choroba wieńcowa, cukrzyca, nadciśnienie, nowotwory czy stany zapalne tkanek i narządów. Ponadto do badań nie kwalifikowano osób z zaawansowanymi chorobami cywilizacyjnymi (np. otyłość), nadużywających alkoholu, zażywających wyroby nikotynowe oraz spożywających suplementy diety o wyraźnym działaniu antyoksydacyjnym. Do badań nie kwalifikowano również osób spożywających jedynie pokarmy roślinne, które dostarczają ponadprzeciętnej ilości przeciwutleniaczy. Uczestnicy projektu badawczego przez 2-tygodniowy okres poprzedzający badania nie przyjmowali żadnych preparatów leczniczych i terapeutycznych. Osoby uczestniczące w badaniu były mieszkańcami woj.

92 Probl Hig Epidemiol 2017, 98(1): 89-98 Tabela I. Struktura wieku, stężenie hemoglobiny (Hb), wartość hematokrytu (Ht) oraz liczba retikulocytów we krwi obwodowej ochotników uczestniczących w badaniu Table I. Structure of age, concentration of hemoglobin (Hb), hematocrit (Ht) and number of reticulocytes in peripheral blood of volunteers involved in research Wiek (w latach) /Age (in years) I grupa /I group n=20 II grupa /II group n=20 III grupa /III gruop n=20 IV grupa/iv group n=20 V grupa /V group n=20 min-max 60-69 70-79 80-89 90-99 20-29 M±SD 65,2±2,48 74,8±1,8 85,6±1,6 93,5±2,29 23,6±2,42 Me 67,5 75,5 84,5 94,5 21,5 Hb (g/dl)* 14,03 14,01 13,58 13,30 15,56 Ht (%)* 41,2 40,2 38,4 37,8 45,3 retikulocyty /reticulocytes ( )* 17 19 22 27 5 * wyniki istotne statystycznie (p<0,02) w poszczególnych grupach osób starszych i grupie kontrolnej /statistically significant difference (p<0.02) between results obtained in different groups of elderly and control group kujawsko-pomorskiego, głównie miasta Bydgoszczy i jego najbliższych okolic. Wszystkie osoby wyraziły zgodę na udział w badaniach. Ochotników podzielono na cztery grupy, odpowiadające kolejnym dekadom życia. Zastosowany podział wynikał z wytycznych zaproponowanych przez demografów WHO [24]: grupa I 20 klinicznie zdrowych ochotników w wieku 60-69 lat (początek starości) grupa II 20 klinicznie zdrowych ochotników w wieku 70-79 lat (wiek podeszły) grupa III 20 klinicznie zdrowych ochotników w wieku 80-89 lat (wiek starczy) grupa IV 20 klinicznie zdrowych ochotników w wieku 90-99 lat (długowieczność). Grupę V (osoby młode) stanowiło 20 klinicznie zdrowych ochotników w wieku 20-29 lat (tab. I). Materiałem do badań był hemolizat erytrocytów uzyskanych z krwi pełnej, którą pobierano urządzeniem próżniowym jednorazowego użytku z żyły odłokciowej w ilości 9 cm 3 do heparynizowanych probówek polietylenowych. Krew była pobierana rano na czczo, po 8-godzinnym okresie nie przyjmowania pokarmów i płynów. Erytrocyty uzyskiwano oddzielając je od osocza poprzez odwirowanie przez 10 minut z prędkością 6000 obr/min. Po usunięciu supernatantu erytrocyty rozdzielano na frakcję młodych i starych krwinek czerwonych poprzez segregację wykorzystującą różnicę w ciężarze właściwym młodych i starych erytrocytów. Wprawienie zawiesiny erytrocytów w ruch wirowy, powodowało przesunięcie starszych i tym samym cięższych krwinek czerwonych do dolnej części (na stronę obwodową) probówki wirówkowej. W wyniku powyższego zjawiska, lżejsza frakcja młodych krwinek czerwonych została wypchnięta do górnej części probówki wirówkowej. Krwinki czerwone rozdzielano na frakcję młodych i starych erytrocytów przy sile wirowania 200 g przez 60 min w temp. 4 C. Uzyskaną w powyższy sposób, masę erytrocytarną osobno młodych oraz starych krwinek czerwonych przemywano 3-krotnie jałowym, fizjologicznym roztworem (0,9%) NaCl, poprzez standardowe dla tej czynności wirowanie (przez 10 min z prędkością 6000 obr/min). Sporządzony w powyższy sposób hemolizat erytrocytów, po rozmrożeniu był wykorzystywany do badań. We hemolizach młodych i starych erytrocytów uzyskanych z krwi ochotników z poszczególnych grup wiekowych, oznaczono aktywność enzymów antyoksydacyjnych: ZnCuSOD metodą Misra i Fridovich a [25] oraz CAT metodą Beersa i Sizera [26]. Ponadto oznaczano zawartość MDA [27]. Oznaczenie hematokrytu (HCT, Ht) wykonywano metodą mikrohematokrytową [28], natomiast zliczania retikulocytów dokonywano za pomocą metody fluorescencyjnej wg Kosenova i Mai [29]. Stężenie hemoglobiny (Hb, HGB), które było niezbędnym parametrem do obliczenia aktywności ZnCuSOD i CAT oznaczano standardową metodą wg Drabkina [30]. Obliczeń statystycznych dokonano z wykorzystaniem testu Manna-Whitneya i testu Studenta. Uzyskane wyniki uznano za znamienne statystycznie przy poziomie istotności p<0,02. Na badania uzyskano zgodę Komisji Bioetyki Collegium Medicum w Bydgoszczy nr 626/2004/KB. Wyniki Dane dotyczące wieku oraz podstawowe parametry hematologiczne ochotników zaangażowanych do badań (z podziałem na grupy wiekowe) przedstawiono w tabeli I. Aktywność dysmutazy ponadtlenkowej (ZnCuSOD) Stwierdzono istotne statystycznie obniżenie aktywności erytrocytarnej ZnCuSOD w każdej z badanych grup osób starszych w porównaniu z grupą osób młodych (grupą kontrolną). Obniżenie aktywności tego enzymu zaobserwowano zarówno w populacji młodych, jak i starych krwinek czerwonych pochodzących od badanych starszych ochotników (tab. II). Najwyższą średnią aktywność ZnCuSOD zaobserwowano w populacji młodych krwinek czerwonych w grupie osób młodych, a najniższą w starych erytrocytach u osób mających 90 i więcej lat. Średnia aktywności ZnCuSOD w starych erytrocytach względem

Olędzki R, Harasym J. Zmiany aktywności dysmutazy ponadtlenkowej i katalazy w zróżnicowanych wiekowo krwinkach... 93 młodych była statystycznie obniżona we wszystkich badanych grupach osób starszych i grupie młodych ochotników (tab. II). Aktywność katalazy (CAT) Wykazano, że aktywność CAT w młodych erytrocytach u osób starszych była znamiennie statystycznie obniżona (p<0,02) względem młodych krwinek czerwonych pozyskanych od osób młodych, tylko w przypadku osób w wieku podeszłym (grupa II) i w grupie osób długowiecznych (grupa IV). Poza grupą osób długowiecznych (grupa IV), nie wykazano natomiast istotnych statystycznie zmian u osób starszych w aktywności CAT w starych erytrocytach w porównaniu z aktywnością tego enzymu w starych krwinkach czerwonych pozyskanych od ochotników młodych (grupa kontrolna). Najwyższą aktywność CAT zaobserwowano w młodych erytrocytach w grupie ludzi młodych (grupa kontrolna), natomiast najniższa aktywność CAT występowała w starych erytrocytach w grupie osób długowiecznych (grupa IV). Aktywność CAT w starych krwinkach czerwonych w porównaniu z aktywnością CAT w młodych erytrocytach była statystycznie znamiennie obniżona (p<0,02) tylko w dwóch grupach ochotników: początku starości (grupa I) i wieku starczego (grupa III) (tab. II). Zawartość dialdehydu malonowego (MDA) Zaobserwowano znamienną statystycznie różnicę (p<0,02) w zawartości MDA w erytrocytach pomiędzy dwoma grupami najstarszych ochotników biorących udział w badaniu (grupa III i IV) a grupą osób młodych (grupa kontrola). U ochotników w okresie początku starości i wieku podeszłego nie stwierdzono zmian w zawartości MDA w porównaniu z grupą osób młodych. Najwyższą zawartość MDA zaobserwowano w starych erytrocytach w grupie osób długowiecznych (grupa IV), a najniższą w młodych erytrocytach w grupie ludzi młodych (grupa kontrolna). Zaobserwowano ponadto istotny statystycznie wzrost zawartości MDA w starych erytrocytach względem młodych erytrocytów we wszystkich badanych grupach ochotników (tab. II). Dyskusja Procesowi starzenia towarzyszy zwiększona produkcja reaktywnych form tlenu (RFT), które odpowiadają za powstawanie licznych uszkodzeń komórek i tkanek. Brak równowagi pomiędzy tworzeniem i eliminacją nadmiernych lub fizjologicznych ilości RFT oraz towarzyszące temu nasilenie procesów peroksydacji lipidów i utleniania białek postrzega się jako zjawiska odgrywające istotną rolę w obniżaniu aktywności metabolicznej enzymów komórkowych i żywotności komórek [31, 32]. Komórki młodych organizmów oraz nowopowstałe komórki wielu rodzajów tkanek budujących starsze organizmy zwierząt (w tym również człowieka) są uznawane za bardziej odporne na uszkodzenia oksydacyjne niż komórki starszych organizmów lub stare komórki w obrębie młodych organizmów [33, 34]. Porównując poziom obrony antyoksydacyjnej w hemolizatach młodych i starych krwinek czerwonych pozyskanych od starszych ochotników stwierdzono zmiany aktywności obu badanych enzymów antyoksydacyjnych ZnCuSOD i CAT. Stwierdzono również zmiany zawartości jednego z końcowych produktów peroksydacji lipidów dialdehydu malonowego (MDA). Przedstawione w pracy wyniki sugerują, że młode krwinki czerwone u osób starszych charakteryzują się obniżoną aktywnością enzymów antyoksydacyjnych. Sytuacja ta ma miejsce pomimo tego, że krwinki te w układzie krwionośnym badanych osób dopiero rozpoczynają pełnić swoje funkcje po okresie różnicowania z puli multipotencjalnych hematopoetycznych komórek macierzystych. Wyniki te korelują z wynikami wcześniejszych badań nad procesami starzenia, które Tabela II. Zmiany aktywności ZnCuSOD, CAT oraz zawartość MDA w młodych i starych krwinkach czerwonych w poszczególnych okresach starzenia i w okresie młodości Table II. Changes in activity of ZnCuSOD, CAT and MDA content in young and old red blood cells in different periods of aging and during youth Parametr /Parameter ZnCuSOD (U/mg Hb) M±SD CAT (BU/g Hb) M±SD MDA (µmol/g Hb) M±SD erytrocyty /erythrocytes młode /young stare /old młode /young stare /old młode /young stare /old początek starości /beginning of old age 60-69 lat /years 2740 ab ±189,0 2453 ab ±180,2 25,86±2,63 23,37 b ±2,69 0,232±0,025 0,273 b ±0,027 wiek podeszły /old age 70-79 lat/years 2742 ab ±298,6 2424 ab ±219,6 25,13±3,13 23,78±2,32 0,234±0,026 0,274 b ±0,022 wiek starczy /senile age 80-89 lat/years 2486 ab ±131,0 2253 ab ±104,0 26,20±2,89 24,09 b ±2,69 0,271 ab ±0,028 0,296 a ±0,023 długowieczność /longevity 90-99 lat /years 2321 ab ±111,8 2143 ab ±128,6 23,47 a ±2,31 21,74 a ±1,93 0,260 ab ±0,017 0,288 ab ±0,016 osoby młode (kontrola) /young people (control) 20-29 lat /years 3084±175,8 2741 b ±113,8 27,01±1,13 23,72 b ±1,34 0,215±0,028 0,255 b ±0,026 a p<0,02 pomiędzy uzyskanymi wynikami w poszczególnych grupach a grupą kontrolną /between results obtained in each group of elderly and control group b p<0,02 pomiędzy uzyskanymi wynikami między starymi a młodymi erytrocytami w poszczególnych grupach wiekowych i w grupie kontrolnej /between results obtained between old and young erythrocytes in each age group of elderly and control group

94 Probl Hig Epidemiol 2017, 98(1): 89-98 wskazują, że komórki potomne wielu rodzajów tkanek u starszych organizmów reprezentują obniżoną aktywność antyoksydacyjną w porównaniu do komórek tego samego typu i wieku w organizmach młodszych [33, 34]. Zaobserwowane w badaniach własnych obniżenie wyjściowej wartości enzymatycznego potencjału antyoksydacyjnego w najwcześniejszym etapie funkcjonowania erytrocytów (w młodych erytrocytach), może być zjawiskiem sygnalizującym zbliżające się lub już istniejące obniżenie żywotności linii erytroidalnej komórek macierzystych. Obniżona żywotność linii erytroidalnej komórek macierzystych i w konsekwencji powstawanie młodych krwinek czerwonych o obniżonej aktywności antyoksydacyjnej są pozornie rekompensowane przez organizm poprzez uwalnianie do krwiobiegu zwiększonej liczby niedojrzałych formy krwinek czerwonych retikulocytów. Liczba retykulocytów odzwierciedla funkcję erytropoetyczną szpiku. Może ona również stanowić potwierdzenie sytuacji, w której fizjologicznie przebiegający podział komórek macierzystych linii erytroidalnej u osób starszych, w efekcie którego powstają młode erytrocyty, nie jest wystarczający, aby zapewnić powstawanie krwinek czerwonych będących w stanie transportować tlen i jednocześnie skutecznie przeciwdziałać RFT. Wyniki badań własnych wykazały istnienie silnej zależności, zarówno pomiędzy wiekiem ochotników a aktywnością dysmutazy ponadtlenkowej (ZnCuSOD), jak również wyraźnej zależności pomiędzy aktywnością ZnCuSOD a wiekiem krwinek czerwonych. Zaobserwowano, że w porównaniu z osobami młodymi, aktywność ZnCuSOD ulega statystycznemu i proporcjonalnemu obniżeniu w każdej kolejnej dekadzie okresu starzenia się organizmu. Podobne wyniki uzyskał Andersen i wsp., który zaobserwował spadek aktywności ZnCuSOD w ludzkich erytrocytach związany ze starzeniem organizmu [35]. Natomiast Glass i wsp. stwierdzili związane ze starzeniem obniżenie ZnCuSOD w krwinkach czerwonych u szczurów [36]. Zaobserwowane w naszych badaniach oraz przedstawiane w badaniach innych autorów obniżenie aktywności ZnCuSOD można tłumaczyć zjawiskiem inaktywacji dysmutazy ponadtlenkowej poprzez produkt reakcji katalizowanej przez ten enzym nadtlenek wodoru (H 2 O 2 ) [37]. Stopień inaktywacji ZnCuSOD zależny jest od stężenia H 2 O 2, który jest usuwany poprzez działanie dwóch innych erytrocytarnych enzymów antyoksydacyjnych: peroksydazy glutationowej (GPx) oraz katalazy (CAT). Aktywność CAT, której działanie również było przez nas analizowane, była istotnie obniżona w erytrocytach pochodzących od ochotników w wieku podeszłym (70-79 lat) oraz osób długowiecznych (>90 lat). Częściowo podobne wyniki uzyskał Alejendro i wsp., który prowadził badania porównawcze dotyczące związku pomiędzy aktywnością enzymów antyoksydacyjnych (m.in. katalazy) w erytrocytach a stopniem zaawansowania procesu starzenia. W badaniach tych wykazano, że zaawansowanie procesu starzenia organizmu przekłada się na statystycznie istotnie niższą aktywność CAT w erytrocytach w porównaniu z osobami młodymi (grupa kontrolna) [38]. Najprawdopodobniej funkcja oraz aktywność ZnCuSOD i CAT są ze sobą ściśle powiązane. Zmniejszenie aktywności CAT może być skorelowane z wyraźnym obniżeniem aktywności ZnCuSOD, a zatem brakiem dostatecznego wysycenia enzymu (katalazy) substratem (H 2 O 2 ). W zacytowanych badaniach zaobserwowano również zjawisko odwrotne, gdy nasilona aktywność CAT była powiązana z efektem zwiększonej aktywności ZnCuSOD [35]. Również Chin i wsp. podają, że aktywność CAT ulega obniżeniu wraz z wiekiem u zdrowych osób [39]. Jednak Inal i wsp. przedstawili zupełnie odmienne obserwacje, według których aktywność CAT wzrasta w erytrocytach w procesie starzenia u zdrowych starszych osób [40]. Te, nie w pełni korespondujące ze sobą doniesienia mogą sugerować, że obserwowane zmiany aktywności enzymów antyoksydacyjnych zachodzące z wiekiem mogą być spowodowane odmiennością metodologii badań, oddziaływaniem różnych czynników środowiskowych oraz zmiennością osobniczą badanych ludzi i zwierząt. Być może istnieje jednak inne możliwe wytłumaczenie uzyskanych przez nas obserwacji. Być może, że w okresie starzenia organizmu istnieją okresy (70-79 oraz +90 lat) mniejszej aktywności antyoksydacyjnej krwinek oraz okresy o wyższej aktywności przeciwutleniającej erytrocytów (60-69 oraz 80-89 lat). Obniżona aktywność antyoksydacyjna osób w wieku podeszłym (70-79 lat) oraz osób długowiecznych (w wieku powyżej 90 lat), może być wynikiem ogólnego spadku aktywności fizycznej u tych grup osób starszych. Być może osoby tworzące te dwie grupy badanych ochotników prowadziły bardziej siedzący tryb życia. U osób prowadzących taki siedzący tryb życia (charakteryzujący się znacznym ograniczeniem lub nawet zaprzestaniem regularnej aktywności ruchowej) obserwuje się znacznie szybsze tempo spadku maksymalnego poboru tlenu (VO 2max ) niż u osób starszych, które zachowują wysoką aktywność fizyczną [41]. Tym samym w krwinkach czerwonych zmniejsza się ilość RFT, będących substratami w reakcji katalizowanej przez ZnCuSOD i CAT [16]. Osoby w wieku 70-79 lat (w przeciwieństwie do osób w wieku 80-89 lat) prawdopodobnie wpadają w pułapkę wieku emerytalnego, ponieważ przeważnie pozbawione już aktywności zawodowej, nie mają jeszcze utrwalonych przyzwyczajeń związanych z wykonywaniem nowych aktywności ruchowych dostosowanych do ich wieku (które są dostępne i zalecane osobom w tych okresach życia). Z kolei osoby o dekadę starsze, w wieku 80-89 lat, stanowią tę

Olędzki R, Harasym J. Zmiany aktywności dysmutazy ponadtlenkowej i katalazy w zróżnicowanych wiekowo krwinkach... 95 grupę ludzi, która poprzez uczestniczenie w zajęciach propagujących aktywny wypoczynek i pomagających wzmacniać ogólną kondycję fizyczną w sposób regularny i metodyczny dba o sprawność ruchową. To sugeruje, że aktywność ruchowa w starszym wieku może być wręcz niezbędna dla wydajnego procesu utlenowania krwinek czerwonych i tym samym utrzymania aktywności enzymów antyoksydacyjnych na wysokim poziomie. W sytuacji pojawienia się rozmaitych niedogodności metabolicznych i fizjologicznych, wynikających z upływu kolejnych lat życia, szeroko pojęta aktywność może stać się sposobem niwelowania negatywnych skutków procesu starzenia, związanych z obniżoną skutecznością obrony antyoksydacyjnej i sprawnością fizjologiczną krwinek czerwonych [43]. Prawdopodobnie spadek wydolności fizycznej towarzyszący procesowi starzenia organizmu przyczynia się w starszym wieku do pogorszeniem stopnia utlenowania krwinek czerwonych, a tym samym ograniczenia reakcji utleniania z udziałem tlenu związanego z hemoglobiną (Hb), głównie w efekcie reakcji autooksydacji hemoglobiny. Oba opisane czynniki mogą być zatem przyczyną zaobserwowanych zmian aktywności enzymów antyoksydacyjnych w erytrocytach u osób w wieku 70-79 lat oraz u osób powyżej 90 lat, które mogą następować pod wpływem zmniejszającego się stężenia substratów dla SOD i CAT. Zmiany te, w istotnym stopniu modyfikują aktywność katalityczną zarówno dysmutazy ponadtlenkowej, jak i katalazy. W wyniku tych zmian, na skutek obniżenia aktywności układu antyoksydacyjnego, dochodzi do zmniejszenia skuteczności wyłapywania fizjologicznych ilości wolnych rodników tlenowych (RFT) i neutralizacji czynników, które mogą uszkadzać struktury lipidowe błony komórkowej oraz ograniczać komórkowe (krwinkowe) procesy naprawcze. Powoduje to stopniowy spadek odporności mechanicznej błony komórkowej krwinek czerwonych u osób w starszym wieku [44]. Zgodnie z przedstawionymi wynikami, należy stwierdzić, że aktywność ZnCuSOD w starych erytrocytach w każdej przebadanej grupie ochotników jest istotnie obniżona względem młodych krwinek czerwonych. Uzyskane przez nas wyniki są w dużym stopniu zgodne z obserwacjami innych badaczy. Asha i wsp. odnotowali obniżenie aktywności ZnCuSOD w starych erytrocytach szczurów względem młodych erytrocytów w sytuacji, gdy ten rodzaj komórek był poddany stresowi oksydacyjnemu wywołanym dichlorowodorkiem 2,2-azo-bis-2-amidynopropanu [45]. Wyniki naszych badań wskazują, że najwyższa aktywność cytoplazmatycznej ZnCuSOD utrzymuje się w młodych krwinkach czerwonych w grupie osób młodych (grupa kontrolna). Analizując otrzymane wyniki, należy również zwrócić uwagę, że zaobserwowany spadek aktywności ZnCuSOD w erytrocytach osób starszych w stosunku do erytrocytów osób młodych może być również związany ze spadkiem stężenia Hb osób starszych, co może sprzyjać obniżeniu aktywności enzymatycznego układu antyoksydacyjnego. Cząsteczki Hb na skutek procesu autooksydacji są źródłem anionorodnika ponadtlenkowego (O 2 - ), będącego substratem dla ZnCuSOD [46]. Uzyskane przez nas wyniki aktywności ZnCuSOD, mogą zatem wskazywać na udział obniżonego enzymatycznego statusu antyoksydacyjnego w przebiegu starzenia się krwinek czerwonych, jak również w procesie starzenia całego układu czerwonokrwinkowego. Obniżenie stężenia Hb może prowadzić do obniżonego generowania O 2 -, o czym świadczy zmniejszenie aktywności dysmutazy ponadtlenkowej oraz nasilenie procesów peroksydacyjnych w obrębie lipidowych struktur krwinki czerwonej (zwiększona zawartość MDA). Wyraźny spadek aktywności ZnCuSOD w starych krwinkach czerwonych względem młodych erytrocytów, jak również spadek aktywności ZnCuSOD w obu populacjach erytrocytów u osób starszych względem osób młodych, może stanowić odzwierciedlenie ogólnego obniżenia aktywności enzymatycznej, towarzyszącego procesowi starzenia się organizmu. Wyniki wielu autorów wskazują na obniżoną aktywność nie tylko ZnCuSOD, ale również pozostałych enzymów antyoksydacyjnych (np. CAT), w wielu innych typach komórek starzejących się organizmów zarówno ludzi, jak i zwierząt [47, 48]. Ponieważ ZnCuSOD jest podatna na uszkodzenia i oksydacyjną inaktywację, można sformułować stwierdzenie, że aktywność tego enzymu w ludzkich erytrocytach jest przydatnym markerem stopnia zaawansowania procesu starzenia krwinek czerwonych. W przedstawionych przez nas badaniach zmniejszenie aktywności ZnCuSOD w starszych erytrocytach względem młodych krwinek było obserwowane już u osób młodych. W związku z tym, wydaje się wysoce prawdopodobne, że system enzymatycznej obrony antyoksydacyjnej podlega stopniowemu osłabieniu wskutek starzenia się nie tylko samego organizmu, ale również w przebiegu starzenia samych krwinek czerwonych, które następuje w podobnym tempie u ludzi należących do różnych grup wiekowych. Mechanizmy, które warunkują zachowanie najistotniejszych funkcji krwinek czerwonych w okresie starzenia się organizmu nie są do końca poznane. Jeden z potencjalnych mechanizmów odpowiedzialnych za wspomniane procesy może być związany z kontrolą stężenia reaktywnych form tlenu w obrębie poszczególnych przedziałów komórkowych. Stres oksydacyjny jest związany z przyśpieszonym starzeniem się komórek na poziomie molekularnym, o czym świadczą obserwacje na zwierzętach, w przypadku których delecja genu dysmutazy ponadtlenkowej typu I (CuZnSOD, SOD-1) powodowała skrócenie długości życia erytrocytów i samych zwierząt [49].

96 Probl Hig Epidemiol 2017, 98(1): 89-98 Wykazana w naszych badaniach obniżona w dwóch grupach starszych ochotników aktywność katalazy, znajduje swoje odzwierciedlenie we wzroście zawartości MDA, co świadczy o niekorzystnych zmianach zachodzących w obrębie struktury błon komórkowych w erytrocytach w trakcie procesu ich starzenia. Uzyskane wyniki wskazują, że erytrocyty osób starszych charakteryzują się wyższą zawartością MDA w porównaniu do erytrocytów młodych ochotników (z grupy kontrolnej). Zawartość MDA w starych krwinkach czerwonych była najwyższa u osób starszych (powyżej 80 r.ż.). Badania wykazały również, że stare erytrocyty względem młodych krwinek czerwonych u wszystkich przebadanych osób (w każdej grupie) charakteryzowały się znacznie wyższą zawartością MDA. Wyniki te sugerują, że starzeniu się organizmu, jak również starzeniu się krwinek czerwonych, towarzyszą nasilone procesy peroksydacji lipidów (wzrost zawartości MDA we wszystkich grupach wiekowych). Wyniki te pozostają w zgodności z wcześniejszymi doniesieniami, które wskazują że, zdolności antyoksydacyjne organizmu ulegają osłabieniu z wiekiem, natomiast nasileniu podlegają procesy utleniania nienasyconych kwasów tłuszczowych, wchodzących w skład fosfolipidów [40]. Szczególnie interesującą obserwacją jest niższa zawartość MDA w grupie najstarszych ochotników ( 90 lat) względem osób w wieku 80-89 lat. Erytrocyty tych ochotników wydają się charakteryzować mniejszą intensywnością peroksydacji lipidów w stosunku do osób o dekadę młodszych. Obserwacja ta może sugerować, że pomimo ogólnego spadku aktywności enzymów przeciwutleniających osób długowiecznych, właśnie ta grupa ochotników charakteryzuje się mniejszą wrażliwością na procesy peroksydacji lipidów. Być może niska zawartość MDA u osób długowiecznych w porównaniu z osobami reprezentującymi wiek starczy (późną starość), jest efektem istnienia odmiennych wzorców procesu starzenia molekularnego erytrocytów w różnych okresach starzenia się organizmu. Powyższe zagadnienie wymagałoby podjęcia w przyszłości szerokich i wnikliwych badań z zakresu molekularnych mechanizmów leżących u podstaw procesów starzenia się komórek zwierzęcych. W przedstawionych badaniach wykazano, że zwiększenie zawartości MDA w ludzkich erytrocytach jest silnie skorelowane, z obniżeniem aktywności takich enzymów antyoksydacyjnych, jak dysmutaza ponadtlenkowa i katalaza. Zachwianie równowagi pomiędzy produkcją a neutralizacją RFT, przy udziale endogennych układów enzymatycznych, może prowadzić do nasilenia stresu oksydacyjnego w erytrocytach i uszkodzenia ich błon komórkowych (nasilenie procesu peroksydacji lipidów), co w konsekwencji ogranicza ich elastyczność i zdolność do zachowania właściwego dla krwinek czerwonych dwuwklęsłego kształtu [5, 44]. Obecne i prowadzone we wcześniejszych latach badania wskazują, że na proces starzenia się ludzkiego organizmu wpływają zarówno czynniki genetyczne, jak również współdziałające z nimi czynniki środowiskowe, jak i te związane ze stylem życia, dietą czy aktywnością fizyczną. Badania nad wpływem spożywania niektórych rodzajów żywności na szybkość starzenia komórkowego i starzenia się całego organizmu dostarczają interesujących przesłanek, które sugerują, że odpowiedni skład pożywienia może się przyczyniać do modyfikacji aktywności oraz ilości białek i enzymów antyoksydacyjnych [50, 51]. Badania na zwierzętach sugerują, że stosowanie diety bogatej w przeciwutleniacze może wzmacniać system antyoksydacyjny organizmu oraz pomagać w zmniejszeniu uszkodzeń oksydacyjnych. W badaniach nad aktywnością enzymów przeciwutleniających w mysich erytrocytach Aliahmat i wsp. wykazał, że suplementowanie diety niektórymi ekstraktami roślinnymi (z liści pieprzu żuwnego Piper betle) oraz mieszaniną tokotrienoli (α-tokoferolu, α-tokotrienolu, β-tokotrienolu, γ-tokotrienolu i δ-tokotrienolu obecnych w oliwie z oliwek), poprawia funkcjonowanie endogennych przeciwutleniaczy [52]. Wyniki eksperymentów laboratoryjnych wykazały również, że długotrwała suplementacja mieszaniną tokoferoli powodowała zmniejszenie stężenia MDA w starzejących się erytrocytach ludzi i zwierząt [53]. Przedstawione w pracy wyniki własne nasuwają wniosek, że mechanizmy endogennej obronny przed RFT i związana z nią stabilizacja równowagi oksydacyjno-antyoksydacyjnej, powinny być wspierane u osób starszych, poprzez spożywanie żywności bogatej w przeciwutleniacze drobnocząsteczkowe, których główne zadanie polega na bezpośredniej neutralizacji RFT [54]. Tym samym drobnocząsteczkowe przeciwutleniacze egzogenne mogą przyczyniać się do skutecznego obniżenia stopnia aktywności i szkodliwości RFT, które w konsekwencji tego występując w zmniejszonych ilościach lub cechując się mniejszą reaktywnością chemiczną są łatwiej neutralizowane przez endogenne układy antyoksydacyjne komórek (np. erytrocytów) [55]. Uzyskane przez nas wyniki trudno jest w większym zakresie porównywać z danymi literaturowymi, gdyż aktualnych doniesień dotyczących zmian aktywności enzymów antyoksydacyjnych w różniących się wiekiem komórkach krwi jest stosunkowo niewiele. Trudność ta tkwi przede wszystkim w braku prowadzonych na szerszą skalę badań z wykorzystaniem ludzkich erytrocytów różniących się stopniem dojrzałości komórkowej. Przedstawione przez nas dane stanowią sugestię, iż badania nad procesem starzenia się krwinek czerwonych powinny być prowadzone w szerszym zakresie, który obejmowałby większą ilość zarówno enzymatycznych, jak i nieenzymatycznych

Olędzki R, Harasym J. Zmiany aktywności dysmutazy ponadtlenkowej i katalazy w zróżnicowanych wiekowo krwinkach... 97 markerów procesu degeneracji ludzkich erytrocytów. Dzięki temu mogłyby powstać silniejsze podstawy naukowe do opracowywania w przyszłości skuteczniejszych terapii i metod przeciwdziałania osłabieniu fizjologicznych oraz biomechanicznych funkcji krwinek czerwonych. Podsumowanie wyników badań i wnioski Przeprowadzone badania wskazują na występowanie u osób starszych istotnych różnic w zakresie średnich aktywności analizowanych enzymów antyoksydacyjnych w krwinkach czerwonych różniących się znacznie wiekiem (stopniem dojrzałości komórkowej erytrocytów). Wyniki te mogą świadczyć pośrednio o zróżnicowanej zdolności antyoksydacyjnej erytrocytów w poszczególnych badanych grupach starszych ochotników, co częściowo potwierdza analiza aktywności katalazy (CAT). W pracy wykazano przede wszystkim wyraźny związek między aktywnością enzymów antyoksydacyjnych a wiekiem krwinek czerwonych oraz w mniejszym stopniu między aktywnością enzymów antyoksydacyjnych a wiekiem badanych osób. Należy również zauważyć, że starzeniu się krwinek czerwonych towarzyszą niekorzystne zmiany w aktywności dysmutazy ponadtlenkowej. Konsekwencją nasilającego się wraz z wiekiem erytrocytów stresu oksydacyjnego i procesów peroksydacyjnych mogą być niekorzystne zmiany w aktywności enzymów glikolitycznych oraz upośledzenie funkcjonowania lub uszkodzenie struktur lipidowych błon krwinek czerwonych [56]. W normalnych, fizjologicznych warunkach, aktywacja enzymów przeciwutleniających powinna stanowić mechanizm zapewniający obronę przed wzrostem ilości reaktywnych form tlenu, które powstają wskutek stałego kontaktu krwinki czerwonej z cząsteczkami transportowanego tlenu. Jak pokazują przedstawione wyniki badań bariera antyoksydacyjna młodych krwinek jest wysoce skuteczna tylko u dorosłych, młodych organizmów, co znajduje swoje odzwierciedlenie w aktywności enzymów antyoksydacyjnych. Przedstawione badania sugerują, że stres oksydacyjny, nawet o niewielkim fizjologicznym natężeniu, może być elementem upośledzającym aktywność enzymatyczną dojrzałych erytrocytów, szczególnie u osób starszych. Z tego względu dietę osób starszych należy wzbogacać w produkty zawierające duże ilości naturalnych substancji antyoksydacyjnych (tokoferoli, karotenoidów, flawonoidów, i in.). Antyoksydanty zawarte w warzywach i owocach mogą wspomagać działanie endogennych systemów przeciwutleniających, a tym samym opóźniać wolnorodnikowe procesy starzenia się krwinek czerwonych i całego organizmu [57]. Piśmiennictwo / References 1. Matés JM, Sánchez-Jiménez FM. Role of reactive oxygen species in apoptosis: implications for cancer therapy. Int J Biochem Cell Biol 2000, 32(2): 157-170. 2. Zeisel SH. Antioxidants Suppress Apoptosis. J Nutr 2004, 134(11): 3179S-3180S. 3. Jensen FB. Red blood cell ph, the Bohr effect, and other oxygenation-linked phenomena in blood O2 and CO2 transport. Acta Physiol Scand 2004, 182(3): 215-227. 4. Matés JM. Effects of antioxidant enzymes in the molecular control reactive oxygen species toxicology. Toxicology 2000, 153(1-3): 83-104. 5. Dąbrowski Z. Fizjologia krwi. Wybrane zagadnienia. Część 2. PWN, Warszawa 2000. 6. Denu RA, Hematti P. Effects of Oxidative Stress on Mesenchymal Stem Cell Biology. Oxid Med Cell Longev 2016, 2016: 2989076. 7. Dorszewska J. Molekularne podstawy apoptozy i martwicy. [w:] Apoptoza w chorobach ośrodkowego układu nerwowego. Kozubski W, Dorszewska J (red). Czelej, Lublin 2008: 11-27. 8. Campisi J, Sedivy J. How does proliferative homeostasis change with age? What causes it and how does it contribute to aging? J Gerontol A Biol Sci Med Sci 2009, 64A(2): 164 166. 9. Collado M, Blasco MA, Serrano M. Cellular senescence in cancer and aging. Cell 2007, 130(2): 223-233. 10. Sharpless NE, Schatten G. Stem cell aging. J Gerontol A Biol Sci Med Sci 2009, 64A(2): 202-204. 11. Starodubtseva MN. Mechanical properties of cells and ageing. Ageing Res Rev 2011, 10(1): 16-25. 12. Bossi D, Giardina B. Red cell physiology. Mol Aspects Med 1996, 17(2): 117-128. 13. Percy AK, Miller ME. Reduced deformability of erythrocyte membranes from patients with Duchenne muscular dystrophy. Nature 1975, 258(5531): 147-148. 14. Maslova MN, Kislyakova LP, Kazennov AM, et al. Changes of gas exchange parameters and of functional-biochemical properties of erythrocytes in dynamics of experimental anemia in rats. Zh Evol Biokhim Fiziol 2009, 45(5): 498-504. 15. Babior BM, Stossel TP (eds). Red blood cell diseases: Red cell production, red cell indices, and the reticulocyte count. [in:] Hematology. A Pathophysiological Approach. Babior BM, Stossel TP (eds). Churchill Livingstone, New York 1984: 12-13. 16. Bartosz G. Druga twarz tlenu. Wolne rodniki w przyrodzie. PWN, Warszawa 2013. 17. Zapora E, Jarocka I. Hemoglobina źródłem reaktywnych form tlenu. Postepy Hig Med Dosw 2013, 67: 214-220. 18. Nagababu E, Rifkind JM. Heme degradation during autoxidation of oxyhemoglobin. Biochem Biophys Res Commun 2000, 273(3): 839-845. 19. Andersen HR, Nielsen JB, Nielsen F, Grandjean P. Antioxidative enzyme activities in human erythrocytes. Clin Chem 1997, 43(4): 562-568. 20. Trotta RJ, Sullivan SG, Stern A. Lipid peroxidation and haemoglobin degradation in red blood cells exposed to t-butyl hydroperoxide. Effects of the hexose monophosphate shunt as mediated by glutathione and ascorbate. Biochem J 1982, 204(2): 405-415.

98 Probl Hig Epidemiol 2017, 98(1): 89-98 21. Wang X, Wu Z, Song G, et al. Effects of oxidative damage of membrane protein thiol groups on erythrocyte membrane viscoelasticities. Clin Hemorheol Microcirc 1999, 21(2): 137-146 22. Nwose EU, Jelinek HF, Richards RS, Kerr PG. Erythrocyte oxidative stress in clinical management of diabetes and its cardiovascular complications. Br J Biomed Sci 2007, 64(1): 35-43. 23. Richards RS, Nwose EU. Blood viscosity at different stages of diabetes pathogenesis. Br J Biomed Sci 2010, 67(2): 67-70. 24. Szarota Z. Gerontologia społeczna i oświatowa. Zarys problematyki. AP, Kraków 2004. 25. Misra HP, Fridovich I. The role of superoxide anion in the autoxidation of epinephrine and simple assay for superoxide dismutase. J Biol Chem 1972, 247(10): 3170-3175. 26. Beers Jr RF, Sizer IW. A spectrophotometric method for measuring the breakdown of hydrogen peroxide by catalase. J Biol Chem 1952, 195(1): 133-140. 27. Ohkawa H, Ohishi N, Yagi K. Assay for lipid peroxides in animal tissues by thiobarbituric acid reaction. Anal Biochem 1979, 95(2): 351-358. 28. Pawelski S. Diagnostyka laboratoryjna w hematologii. PZWL, Warszawa 1983. 29. van Kampen E, Zijlstra WG. Standardization of hemoglobinometry II. The hemiglobincyanide method. Clin Chim Acta 1961, 6: 538-544. 30. Arashiki N, Kimata N, Manno S, et al. Membrane peroxidation and methemoglobin formation are both necessary for band 3 clustering: mechanistic insights into human erythrocyte senescence. Biochemistry 2013, 52(34): 5760-5769. 31. Gamba P, Testa G, Gargiulo S, et al. Oxidized cholesterol as the driving force behind the development of Alzheimers disease. Front Aging Neurosci 2015, 7: 119 32. Buffenstein R, Edrey YH, Yang T, Mele J. The oxidative stress theory of aging: embattled or invincible? Insights from nontraditional model organisms. Age 2008, 30(2-3): 99-109. 33. Conti V, Corbi G, Simeon V, et al. Aging-related changes in oxidative stress response of human endothelial cells. Aging Clin Exp Res 2015, 27(4): 547-553. 34. Andersen HR, Jeune B, Nybo H, et al. Low activity of superoxide dismutase and high activity of glutathione reductase in erythrocytes from centenarians. Age Ageing 1998, 27(5): 643-648. 35. Glass GA, Gershon D. Enzymatic changes in rat erythrocytes with increasing cell and donor age: loss superoxide dismutase activity associated with increases in catalytically defective forms. Biochem Biophys Res Commun 1981, 103(4): 1245 1253. 36. Salo DC, Lin SW, Pacifici RE, Davies KJ. Superoxide dismutase is preferentially degraded by a proteolytic stem from red blood cells following oxidative modification by hydrogen peroxide. Free Radic Biol Med 1988, 5(5-6): 335-339. 37. Bolzán AD, Bianchi MS, Bianchi NO. Superoxide dismutase, catalase and glutathione peroxidase activities in human blood: influence of sex, age, and cigarette smoking. Clin Biochem 1997, 30(6): 449-454. 38. Chin SF, Ibahim J, Makpol S, et al. Tocotrienol rich fraction supplementation improved lipid profile and oxidative status in healthy older adults: a randomized controlled study. Nutr Metab 2011, 8(1): 42. 39. Inal ME, Kanbak G, Sunal E. Antioxidant enzyme activities and malondialdehyde levels related to aging. Clin Chim Acta 2001, 305(1-2): 75-80. 40. Górski J (red). Fizjologia wysiłku i treningu fizycznego. PZWL, Warszawa 2011. 41. Gonzalo-Calvo D, Fernández-García B, de Luxán-Delgado B, et al. A Chronic training increases blood oxidative damage but promotes health in elderly men. Age (Dordr) 2013, 35(2): 407-417. 42. Westerterp KR, Meijer EP. Physical activity and oxidative stress in the elderly. Gerontechnology 2002, 2(2): 189-197. 43. Iolascon A, Perrotta S, Stewart GW. Red blood cell membrane defects. Rev Clin Exp Hematol 2003, 7(1): 22-56. 44. Asha Devi S, Shiva Shankar Reddy CS, Subramanyam MV. Oxidative stress and intracellular ph in the young and old erythrocytes of rat. Biogerontology 2009, 10(6): 659-669. 45. Johnson RM, Goyette Jr G, Ravindranath Y, Ho YS. Hemoglobin autoxidation and regulation of endogenous H2O2 levels in erythrocytes. Free Radic Biol Med 2005, 39(110): 1407-1417. 46. Weydert CJ, Cullen JJ. Measurement of superoxide dismutase, catalase and glutathione peroxidase in cultured cells and tissue. Nat Protoc 2010, 5(1): 51-66. 47. Alper G, Sözmen EY, Kanit L, et al. Age-related alterations in superoxide dismutase and catalase activities in rat brain. Turk J Med Sci 1998, 28: 491-494. 48. Iuchi Y, Okada F, Takamiya R, et al. Rescue of anemia and autoimmune responses in SOD1-deficient mice by transgenic expression of human SOD1 in erythrocytes. Biochem J 2009, 422(2): 313-320. 49. Friel JK, Widness JA, Jiang T, et al. Antioxidant status and oxidant stress may be associated with vitamin E intakes in very low birth weight infants during the first month of life. Nutr Res 2002, 22(1-2): 55-64. 50. Power-Grant O, McCormack WG, Ramia De Cap M, et al. Evaluation of the antioxidant capacity of a milk protein matrix in vitro and in vivo in women aged 50-70 years. Int J Food Sci Nutr 2016, 67(3): 325-334. 51. Aliahmat NS, Noor MRM, Yusof WJW, et al. Antioxidant enzyme activity and malondialdehyde levels can be modulated by Piper betle, tocotrienol rich fraction and Chlorella vulgaris in aging C57BL/6 mice. Clinics 2012, 67(12): 1447-1454. 52. Liu M, Wallin R, Wallmon A, Saldeen T. Mixed tocopherols have a stronger inhibitory effect on lipid peroxidation than alpha-tocopherol alone. J Cardiovasc Pharmacol 2002, 39(5): 714-721. 53. Jędrzejczak-Pospiech K, Kowalski M, Bielecka-Kowalska A i wsp. Wpływ suplementacji luteiną na wybrane elementy obrony antyoksydacyjnej erytrocytów u ludzi zdrowych doniesienie wstępne. Probl Hig Epidemiol 2013, 94(3): 522-526. 54. Graffouillère L, Deschasaux M, Mariotti F, et al. Prospective association between the Dietary Inflammatory Index and mortality: modulation by antioxidant supplementation in the SU.VI.MAX randomized control trial. Am J Clin Nutr 2016, 103(3): 878. 55. Jansen G, Hepkema BG, van der Vegt SG, Staal GE. Glycolytic activity in human red cell populations separated by a combination of density and counterflow centrifugation. Evidence for an improved separation of red cells according to age. Scand J Haematol 1986, 37(3): 189-195. 56. Kulczyński B, Gramza-Michałowska A. Potencjał prozdrowotny owoców i kwiatów głogu. Probl Hig Epidemiol 2016, 97(1): 24-28.