PASTOREX TOXO 72724 100 WYKRYWANIE PRZECIWCIAŁ TOXOPLASMA GONDII W SUROWICY LUDZKIEJ POPRZEZ AGLUTYNACJĘ CZĄSTEK LATEKSU 881157-2014/06 1- ZASTOSOWANIE Toxoplasma gondii jest pierwotniakiem zdolnym do zakażenia wielu gatunków ssaków i ptaków. Takie zakażenia występują bardzo często u ludzi i zwierząt, a najczęściej rozwijają się bez widocznych objawów klinicznych. Częstość występowania tego zakażenia w populacji, wykrywana w wyniku obecności swoistych przeciwciał w surowicy, jest różna w poszczególnych regionach i u osób w różnym wieku. W przypadku zakażenia pierwotnego u kobiet w ciąży, może spowodować poważne choroby płodu (wady wrodzone), a nawet poronienie. Odporność matki (niezależnie od wieku), wykazywana obecnością przeciwciał IgG na początku ciąży, chroni płód przed zakażeniem przez tego pasożyta. Druga populacja wrażliwa na to zakażenie obejmuje pacjentów o upośledzonej odporności, wśród których są chorzy na AIDS. Według niektórych badań, od 30 do 40% chorych na AIDS może wykazywać toksoplazmozę mózgu, w zależności od występowania tego przewlekłego zakażenia w badanej populacji. W większości przypadków zakażenia te wywołane są przez zakażenia nieaktywnym zbiorowiskiem pasożytów (cystami) istniejącymi u pacjentów przed zakażeniem wirusem HIV. PASTOREX TOXO jest kartowym testem aglutynacji lateksowej do oznaczania przeciwciał w kierunku T. gondii w surowicy. 2- PODSTAWY TESTU Cząstki lateksu są pokryte wiązaniem kowalencyjnym z rozpuszczalnymi antygenami z membrany i cytoplazmy T. gondii (szczep RH). Test ten pozwala na jednoczesne wykrywanie przeciwciał IgG i/lub IgM, w kierunku T. gondii. Odczyt testu jest bardzo łatwy z powodu zastosowania zawieszonych czerwonych cząstek lateksu w zielonym barwieniu kontrastowym. W przypadku ujemnego wyniku testu, otrzymywany jest jednolity brązowy obraz. W przypadku dodatniego wyniku testu, dwubarwny obraz wykazuje zielone tło zawierające kilka czerwonych agregatów. 3- SKŁAD ZESTAWU Etykieta Odczynniki Liczba sztuk/ilość Latex Negative control serum Positive control serum Diluent Lateks: czerwone cząstki lateksu powleczone antygenami w kierunku T. gondii w zielonym barwieniu kontrastowym. Środek konserwujący: 0,1% ProClin 300 Ujemna surowica kontrolna: Ludzka surowica niereaktywna na przeciwciała w kierunku T. gondii oraz niereaktywna na przeciwciała anty-hiv1 i anty-hiv2 oraz przeciwciała antygenu HBs i przeciwciała anty-hcv. Środek konserwujący: 0.1% proclin 300 Dodatnia surowica kontrolna: Ludzka surowica dająca wynik dodatni dla przeciwciał w kierunku T. gondii niereaktywna w kierunku przeciwciał anty-hiv1 i anty-hiv2, antygen HBs oraz przeciwciał anty-hcv. Środek konserwujący: 0.1% proclin 300 Rozcieńczalnik: Roztwór NaCl Środek konserwujący: 0.1% proclin 300 Jednorazowe karty aglutynacji z 8 polami reakcyjnymi każda Jednorazowe plastikowe pałeczki 1 fiolka zakraplacz 1,6 ml 1 fiolka zakraplacz 0,4 ml 1 fiolka zakraplacz 0,4 ml 1 fiolka zakraplacz 1,8 ml 15 4- PRZECHOWYWANIE Wszystkie odczynniki są stabilne do daty ważności podanej na etykiecie, jeśli przechowywane są w temperaturze od + 2 do - 8 C i w przypadku braku skażenia mikrobiologicznego (nawet po otwarciu). Butelki odczynnika lateksowego przechowywać pionowo. ODCZYNNIKÓW LATEKSOWYCH NIE NALEŻY ZAMRAŻAĆ. 1
5- WYMAGANE MATERIAŁY, KTÓRE NIE WCHODZĄ W SKŁAD ZESTAWU podchloryn sodu (wybielacz) rękawiczki jednorazowe. automatyczne lub półautomatyczne pipety do dozowania objętości 15 µl. pojemnik na odpady stanowiące zagrożenie biologiczne mieszadło mechaniczne 6- ŚRODKI OSTROŻNOŚCI PODCZAS UŻYWANIA Jakość wyników zależy od przestrzegania dobrych praktyk laboratoryjnych: nie używać odczynników po upływie terminu ważności; wszystkie odczynniki i próbki należy używać w temperaturze pokojowej (18-30 C); nie mieszać ani nie łączyć odczynników z zestawów o różnych numerach partii w ramach tej samej manipulacji; nie dotykać palcami pól reakcyjnych kart aglutynacji; zmieniać pipety lub końcówki pobierania próbek dla każdej badanej próbki; przed użyciem potrząsnąć fiolką lateksu; wytrzeć końcówkę zakraplacza buteleczki odczynnika w celu uzyskania prawidłowych kropli; w celu wypuszczenia kropli, buteleczkę z odczynnikiem utrzymywać w pozycji pionowej zmieniać pałeczkę dla każdej reakcji; wyrzucić cały jednorazowy materiał używany do nadającego się do sterylizacji w autoklawie pojemnika na odpady lub do kąpieli odkażającej. INSTRUKCJE BHP Zawsze należy przestrzegać aktualnych technik i środków ostrożności w zakresie ochrony przed zagrożeniami mikrobiologicznymi. Wszystkie pobrane próbki muszą być traktowane jako potencjalnie zakaźne. Stosować jednorazowe rękawice do obsługi odczynników i próbek oraz dokładnie umyć ręce po ich użyciu. Nie pipetować ustami. Materiały pochodzenia ludzkiego stosowane do przygotowania odczynników zostały przetestowane i stwierdzono, że są niereaktywne względem antygenu powierzchniowego wirusowego zapalenia wątroby typu B (HBs Ag), przeciwciał przeciwko wirusowi zapalenia wątroby typu C (HCV) i przeciwciał przeciwko ludzkim wirusom niedoboru odporności (HIV- 1 i HIV-2). Ponieważ żadna ze znanych metod analitycznych nie daje całkowitej pewności, że czynniki zakaźne są nieobecne, z odczynnikami i próbkami pobranymi od pacjentów należy postępować tak, jakby były zdolne do przenoszenia chorób zakaźnych. Unikać rozpryskiwania próbek lub roztworów. Zalane obszary należy oczyścić wybielaczem rozcieńczonym do 5%. Jeśli cieczą zanieczyszczającą jest kwas, zalane obszary należy uprzednio zobojętnić roztworem wodorowęglanu sodu, przemyć wybielaczem, po czym wytrzeć do sucha. Materiał użyty do czyszczenia musi zostać wyrzucony do pojemnika na odpady stanowiące zagrożenie biologiczne. Próbki i odczynniki pochodzenia ludzkiego, jak również skażone materiały i produkty należy utylizować po odkażeniu: - przez namaczanie w wybielaczu w końcowym stężeniu 5% podchlorynu sodu przez 30 minut; - lub przez obróbkę w autoklawie w temperaturze + 121 C przez 2 godziny. OSTROŻNIE: nie umieszczać w autoklawie roztworów zawierających podchloryn sodowy. Należy zawsze pamiętać o konieczności neutralizacji lub poddaniu obróbce w autoklawie próbek, odczynników i roztworów do płukania przed wylaniem ich do zlewu. Chemikalia należy przenosić i utylizować zgodnie z zasadami dobrych praktyk laboratoryjnych. Unikać kontaktu odczynników ze skórą lub błonami śluzowymi (ryzyko toksyczności, podrażnienia lub poparzenia). Zalecenia dotyczące zagrożeń i środków ostrożności związanych z substancjami chemicznymi znajdującymi się w tym zestawie testowym można znaleźć na piktogramach zamieszczonych na etykietach oraz w informacjach zamieszczonych na końcu niniejszej instrukcji obsługi. Karta charakterystyki substancji jest na stronie www.bio-rad.com. 7- PRÓBKI 1. Zalecanym rodzajem próbki jest surowica. 2. Stosować się do następujących zaleceń dotyczących postępowania, przetwarzania i przechowywania próbek surowicy: Zebrać wszystkie próbki surowicy stosując rutynowe środki ostrożności. - Przed odwirowaniem odczekać do pełnego uformowania się skrzepu wszystkich próbek. - Zawsze utrzymywać szczelnie zamknięte probówki. - Po wirowaniu oddzielić surowicę i przechowywać w szczelnie zamkniętej probówce. - Próbki można przechowywać w temperaturze od +2 do -8 C, jeśli w ciągu 7 dni zostanie wykonane badanie przesiewowe. - Jeśli oznaczanie nie zostanie zakończone w ciągu 7 dni lub do wysyłki próbek zamrozić w temperaturze -20 C lub niższej. - Próbki wolno rozmrażać tylko trzy razy. - Wcześniej zamrożone próbki należy dokładnie wymieszać po rozmrożeniu przed badaniem. - Surowice nie mogą być zanieczyszczone. Muszą być transportowane i przechowywane w szczelnie zamkniętych probówkach. 2
3. Próbki zawierające 90 g/l albuminy, 100 mg/l bilirubiny, próbki lipemiczne o zawartości równoważnika trioleiny ( trójglicerydu) wynoszącej 36 g/l oraz hemolizowane próbki zawierające do 10 g/l hemoglobiny nie mają wpływu na wyniki testu. 4. Nie podgrzewać próbek. 8- PROCEDURA OZNACZANIA Ściśle przestrzegać zalecanego protokołu. Użyć ujemnych i dodatnich surowic kontrolnych dla każdego testu, w celu zweryfikowania jakości testu. Stosować dobre praktyki laboratoryjne. Przed użyciem wstrząsnąć lateks w celu uzyskania jednorodnej brązowej zawiesiny. 1. Nałożyć na różne pola karty - kropla dodatniej surowicy kontrolnej; - kropla ujemnej surowicy kontrolnej; - 15 µl surowicy do zbadania. 2. Na każde pole nałożyć kroplę rozcieńczalnika obok pierwszej kropli, bez styku między nimi. 3. Na każde pole nałożyć kroplę zawiesiny lateksowej obok dwu pierwszych kropli, bez styku między nimi. 4. Mieszadełkiem wymieszać trzy krople każdego kółka. 5. Umieścić kartę na mieszadle mechanicznym i obracać przez maksymalnie 5 minut, aż pojawi się potencjalna aglutynacja. Odczyt należy wykonać w ciągu od 5 do 7 minut. Ostrożnie: nie dokonywać odczytu po upływie 7 minut. 9- INTERPRETACJA WYNIKÓW Reakcja ujemna: zawiesina pozostaje brązowa i jednorodna. Bez wystąpienia koloru zielonego. Porównać z ujemną surowicą kontrolną. W przypadku kobiet w ciąży, reakcja musi być potwierdzona poprzez zastosowanie innej techniki. Reakcja dodatnia: powstaje zielone tło (mniej lub bardziej wyraźnie oznaczone) z czerwonymi agregatami. Surowica zawiera przeciwciała w kierunku T. gondii. Miano klasy przeciwciał musi być określone poprzez zastosowanie innej techniki: PLATELIA TOXO IgG PLATELIA TOXO IgM PLATELIA TOXO IgA 10- KONTROLA JAKOŚCI TESTU Po wstrząśnięciu, zawiesina lateksowa powinna być idealnie jednorodna. Immunoreaktywność lateksu można kontrolować dodatnimi i ujemnymi próbami kontrolnymi. Przy dodatniej próbie kontrolnej powinno dojść do aglutynacji; natomiast przy ujemnej próbie kontrolnej nie powinno dojść do aglutynacji. Nie używać zawiesiny lateksowej, jeśli nie reaguje z dodatnimi próbami kontrolnymi. Jeśli reaguje z ujemnymi próbami kontrolnymi (reakcje te mogą być spowodowane złymi warunkami przechowywania i zanieczyszczenia lateksu). 11- KONTROLA JAKOŚCI WYTWÓRCY Wszystkie produkowane odczynniki wytwarzane są zgodnie z naszym Systemem Jakości, począwszy od etapu odbioru surowców aż do etapu wprowadzenia gotowego produktu na rynek. Każda partia jest poddawana kontroli jakości i wprowadzana na rynek jedynie po spełnieniu określonych z góry kryteriów dopuszczenia. Firma Bio-Rad przechowuje dokumentację produkcyjną i kontrolną każdej wyprodukowanej partii. 12- EFEKTYWNOŚĆ Test Pastorex Toxo oceniano w 3 różnych ośrodkach, na ogólnej liczbie 732 próbek, świeżych lub mrożonych, wśród których były 202 surowice od dawców krwi oraz 530 próbek od pacjentów hospitalizowanych i kobiet w ciąży. Wyniki uzyskane z testu Pastorex Toxo porównano z wynikami uzyskanymi z testu Platelia Toxo IgG TMB i Platelia Toxo IgM TMB (ośrodek 1) lub rutynową metodą stosowaną w laboratorium (ośrodek 2 i 3). Wyniki przedstawiają się następująco: Zgodność Specyficzność Czułość Ośrodek 1 Ośrodek 2 i 3 Razem 98,5% 92,9% 96,0% [96,8-99,5] [96,8-99,5] [94,4-97,3] (404/410) (299/322) (703/732) 100% [98,5-100] (201/201) 97,6% [94,5-99,2] (203/208) 100% [98,1-100] (158/158) 89,8% [84,0-94,1] (141/157) 100% [99,2-100] (359/359) 94,3% [91,3-96,4] (344/365) 3
Wątpliwe wyniki nie zostały uwzględnione w obliczeniach. Wśród 21 surowic dających wynik ujemny w teście Pastorex Toxo i wynik dodatni uzyskany z metody referencyjnej, żaden nie dał wyniku dodatniego dla surowicy IgM. 95% spośród tych surowic było zgodnych ze słabo pozytywnymi wynikami dla surowicy IgG. Odczyny krzyżowe: 101 próbek dających wynik dodatni dla różnych markerów serologicznych lub bakteryjnych (odry, świnki, różyczki i półpaśca (VZV), HSV 1 i 2, wirusa cytomegalii (CMV), wirusa Epsteina-Barra (EBV), wirusa HIV, zapalenia wątroby typu A (HAV), zapalenia wątroby typu B (HBV), zapalenia wątroby typu C (HCV) oraz próbki dające wynik dodatni dla czynników reumatoidalnych, autoprzeciwciał skierowanych przeciwko składnikom jądra komórkowego (ANA), ludzkich przeciwciał przeciwko immunoglobulinie mysiej (HAMA) i próbki pobrane od pacjentów chorych na szpiczaka, przetestowano w teście Pastorex Toxo oraz Platelia Toxo IgG TMB i Platelia Toxo IgM TMB. Wszystkie próbki, które dały wynik ujemny w testach referencyjnych, dały wynik ujemny w teście Pastorex Toxo. Powtarzalność: Jedną próbkę ujemną i 2 próbki dodatnie przetestowano 12 razy w tym samym dniu. Próbki te zbadano również w dwóch powtórzeniach w ciągu 10 dni, maksymalnie dwa razy dziennie, na 2 manipulatorach. Test Pastorex Toxo wykazuje dobrą powtarzalność wewnątrztestową i międzytestową. 13- OGRANICZENIA STOSOWANIA 1. Niektóre silnie dodatnie surowice wyjątkowo mogą powodować pojawienie się zjawiska strefy. 2. Diagnozę niedawnego zakażenia pasożytniczego można postawić wyłącznie na podstawie kombinacji danych klinicznych i serologicznych. 3. Wynik pojedynczej próbki surowicy nie stanowi wystarczającego dowodu dla zdiagnozowania niedawnego zakażenia. 4. Znaczny wzrost miana przeciwciał IgG anty-t. gondii IgG w dwóch próbkach surowicy uzyskanych w minimalnym odstępie trzech tygodni, badanych w tym samym przebiegu, nie umożliwia rozpoznania ostatniego zakażenia pasożytniczego, lecz stanowi dowód niedawnej serokonwersji. 5. Niezbędne jest wykrycie przeciwciał IgM w kierunku T. gondii w ramach nadzoru serologicznego kobiet w ciąży, ponieważ pojawienie się przeciwciał IgG anty-t. gondii może nastąpić nieco później niż wykrycie przeciwciał IgM anty- T. gondii (zestaw Platelia TOXO IgM). 14- MATERIAŁY ŹRÓDŁOWE 1. DAFFOS, FORESTIER F., CAPELLA-PAVLOVSKY M., THULLIEZ P., AUFRANT C., VALENTI D. and COX L. : Prenatal management of 746 pregnancies at risk for congenital toxoplasmosis. New Eng. J. Med. 1988; 318, 271-275 2. JENUM P.A., STRAY-PEDERSEN B., MELBY K.K., KAPPERUD G., WHITELAW A., ESKILD A. and ENG J. : Incidence of Toxoplasma gondii infection in 35 940 pregnant women in Norway and pregnancy outcome for infected women. J. Clin. Microbiol. 1998; 36, 2900-2906. 3. SHARMA S.D., MULLENAX J., ARAUJO F.G., ERLICH H.A. and REMINGTON J.S. : Western Blot analysis of the antigens of Toxoplasma gondii recognized by human IgM and IgG antibodies. J. Immunol. 1983; 131: 977-983 4. WONG S.Y. and REMINGTON J.S. : Biology of Toxoplasma gondii. AIDS 1993; 7, 299-316. 5. DEROUIN F., LEPORT C., PUEYO S., MORLAT P., LETRILLART B., CHENE G., ECOBICHON J.L., LUFT B., AUBERTIN J., HAFNER R., VILDE J.L., SALAMON R. and ANRS 005/ACTG 154 Trial Group Predictive value of Toxoplasma gondii antibody titres on the occurrence of toxoplasmic encephalitis in HIV-infected patients.aids 1996; 10, 1521-1527 6. LECOLIER B., PUCHEU B. : Sérodiagnostic de la toxoplasmose : performances et intérêt d'un test au latex. Feuillets de Biologie. 1993; n 195, 69-71. 7. MAZUMDER P., CHUANG H.Y.K, WENTZ M.W. and WIEDBRAUK : Latex Agglutination Test for Detection of Antibidies to Toxoplasma gondii. J. Clin. Microbiol. 1988; 26, 2444-2446. 8. DUONG TH, MARTZ M, RONDI ML, RICHARD-LENOBLE D, KOMBILA M. : Toxoplasmosis in Gabon. Results of a seroepidemiological investigation. Bull Soc Pathol Exot. 1992;85(5):368-73. 4
5
6
7
Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincare 92430 Marnes-la-Coquette Francja Tel.: +33 (0) 1 47 95 60 00 2014/06 Faks: +33 (0) 1 47 41 91 33 881157 www.bio-rad.com 8