Czynniki chorobotwórcze w biologicznym zwalczaniu nicieni szkodników roœlin

PRACE PRZEGL DOWE Czynniki chorobotwórcze w biologicznym zwalczaniu nicieni szkodników roœlin Aleksandra Obrêpalska-Stêplowska, Danuta Sosnowska Instytut Ochrony Roœlin, Poznañ Microorganisms in biological control of plant-parasitic nematodes Summary Adres do korespondencji Aleksandra Obrêpalska-Stêplowska, Miêdzyzak³adowa Pracownia Biologii Molekularnej, Instytut Ochrony Roœlin, ul. W³adys³awa Wêgorka 20, 60-318 Poznañ; e-mail: ao.steplowska@ior.poznan.pl Nematodes are unsegmented roundworms that numerously and successfully adapted to all regions and environments on earth. The last ones were usually classified into feeding types: free-living, predaceous, and parasitic including plant-parasitic. They are of great significance in terms of damage they cause. Plant-parasitic nematodes have been reported to be responsible for the losses amounting to over $100 billion throughout the world. Because of the big difficulties in their eradication some of them are considered as quarantine species. The plant-parasitic nematodes are controlled using chemical methods mainly chemical nematicides. However, because of many drawbacks including health and environmental concerns, other control methods are considered. One of them is biological control and application of antagonistic microorganisms to decrease densities of nematodes populations. Microbial antagonists parasitizing various developmental stages of their hosts may affect nematodes by secretion of antibiotics, toxins and other secondary metabolites. The most important virulence factors are extracellular enzymes that participate in destroying the nematodes cuticle or the egg-shell or in further phases of infection. This publication presents the examples of microorganisms investigated in terms of biological control, those that are already available commercially as well as some mechanisms involved in nematode-microbes interactions. Key words: plant-parasitic nematodes, microorganisms, antagonistic interactions. 2 (81) 115 130 2008

Aleksandra Obrêpalska-Stêplowska, Danuta Sosnowska 1. Wstêp Nicienie (Nematoda) z gromady obleñców stanowi¹ jedn¹ z najliczniejszych grup zwierz¹t wielokomórkowych yj¹cych w glebie. S¹ zdolne do aktywnej migracji w ryzosferze, niektóre równie na naziemnych czêœciach i wewn¹trz roœliny. Jednak- e najwiêksze znaczenie gospodarcze maj¹ nicienie paso ytuj¹ce na korzeniach. Nicienie paso ytuj¹ce na roœlinach powoduj¹ bardzo du e szkody w uprawach siêgaj¹ce nawet do 125 miliardów dolarów rocznie na ca³ym œwiecie (1), przez co znajduj¹ siê na drugim miejscu pod wzglêdem wielkoœci strat po grzybach, a przed bakteriami i wirusami. Szczególnie szkodliwe s¹ guzaki korzeniowe (Meloidogyne spp.) mog¹ce erowaæ na ponad 3000 gatunków roœlin i powodowaæ straty plonu dochodz¹ce do 21% (2). Wiêkszoœæ z tych gatunków powoduje mechaniczne uszkodzenia korzeni i galasy prowadz¹ce czêsto do ogólnego niedorozwoju roœliny. Bardzo szkodliwe dla roœlin s¹ wydzielane przez nicienie enzymy hydrolityczne, którymi trawi¹ czêœciowo pokarm i rozpuszczaj¹ œciany komórek roœlinnych, co u³atwia im przemieszczanie siê w tkance. Zniszczeniu ulegaj¹ komórki roœlin i przez to obumieraj¹ ca³e tkanki, a nawet organy roœlin. Poœrednia szkodliwoœæ nicieni wynika z tego, e s¹ wektorami fitopatogennych wirusów, grzybów i bakterii. Wektorami wirusów roœlin s¹ nicienie d³ugacze (Longideridae), czyli ektopaso yty wêdrowne atakuj¹ce korzenie wy³¹cznie zewn¹trz. A 16 gatunków nale ¹cych do tej rodziny nicieni przenosi wirusy roœlinne, np. L. attenuatus jest wektorem wirusa czarnej plamistoœci pomidora (TBRV) (2). Jednak g³ównie te gatunki s¹ wektorami wirusów w sadach i na plantacjach truskawek. Gatunek nicienia Xipinema index by³ w latach piêædziesi¹tych ubieg³ego wieku cytowany jako pierwszy gatunek nicienia bêd¹cy wektorem nepowirusa na winoroœlach (ang. grapevine fanleaf nepovirus) (2). Bardzo du e starty w plonach roœlin uprawnych powoduj¹ m¹twiki, wœród nich m¹twik burakowy (Heterodera schachtii) oraz znajduj¹ce siê na liœcie organizmów kwarantannowych m¹twiki ziemniaczane (Globodera spp.). Ograniczanie populacji nicieni jest bardzo trudne ze wzglêdu na œrodowisko glebowe, w którym yj¹, a które chroni je przed ró nymi zabiegami. Do ich ograniczania stosuje siê chemiczne œrodki ochrony roœlin nematocydy. Jednak ich czêste stosowanie zanieczyszcza œrodowisko glebowe. Dlatego znaczenia nabieraj¹ metody alternatywne, jak p³odozmian, uprawa roœlin obojêtnych lub wrogich, wczesny wysiew i uprawa roœlin odpornych. Od wielu lat poszukuje siê chorobotwórczych dla nicieni mikroorganizmów, które mog¹ uzupe³niæ wymienione metody. Wiadomo, e w warunkach naturalnych ogromn¹ rolê w ograniczaniu populacji nicieni szkodników roœlin odgrywaj¹ grzyby i bakterie nicieniobójcze (3-5). Spoœród du ej liczby gatunków chorobotwórczych dla nicieni w praktyce zastosowanie w formie biopreparatów znalaz³o tylko kilka. S¹ to g³ównie grzyby paso ytnicze wzglêdem jaj i samic nicieni, a tak e wytwarzane przez nie toksyny oraz bakterie. Przyczyn takiej sytuacji jest wiele. Miêdzy innymi ich ró na skutecznoœæ, uzale nienie od warunków œrodowiska i ró norodnoœæ wœród szczepów jednego gatunku grzyba. 116 PRACE PRZEGL DOWE

Czynniki chorobotwórcze w biologicznym zwalczaniu nicieni szkodników roœlin Publikacja ta pozwoli przybli yæ znaczenie metody biologicznej w ograniczaniu populacji fitofagicznych nicieni oraz wyjaœniæ procesy zachodz¹ce pomiêdzy patogenami, nicieniami i roœlinami, a tak e mechanizmy ich dzia³ania. Poznanie podstaw biochemicznych i multitroficznych interakcji antagonistycznych nicieñ-mikroorganizm, bêdzie mia³o w przysz³oœci du e znaczenie dla produkcji biopreparatów nicieniobójczych. 2. Biologiczne zwalczanie i mechanizmy dzia³ania gatunków antagonistycznych Metoda biologiczna polega na wykorzystaniu naturalnych zjawisk zachodz¹cych w œrodowisku pomiêdzy organizmami ywymi, g³ównie paso ytnictwa i drapie nictwa, do ograniczenia liczebnoœci danego szkodnika lub zmniejszenia jego szkodliwoœci. W metodzie tej wykorzystuje siê równie zjawisko antagonizmu wystêpuj¹ce pomiêdzy organizmami oraz wspó³zawodnictwo. Interakcja antagonistów i nicieni mo e mieæ charakter bezpoœredni lub poœredni. Mechanizm bezpoœredni dotyczy wspomnianego hamowania rozwoju nicieni poprzez ich wykluczenie na drodze wspó³zawodnictwa, produkcjê substancji toksycznych lub ograniczaj¹cych ich wystêpowanie czy przez bezpoœrednie ograniczenie nicieni na drodze paso ytnictwa. Z oddzia³ywaniem poœrednim mamy do czynienia, gdy obecnoœæ mikroorganizmów antagonistycznych powoduje wzrost odpornoœci roœliny, na której paso ytuje dany gatunek nicienia lub zmiany w mikroœrodowisku nicienia w taki sposób, e zawartoœæ sk³adników mineralnych, jak równie innych nieantagonistycznych mikroorganizmów siê zmienia, powoduj¹c zmniejszenie liczebnoœci tego nicienia. W naturze wiele spoœród wymienionych mechanizmów jest czêsto wykorzystywanych przez ten sam antagonistyczny gatunek (6). 3. Mikroorganizmy antagonistyczne w stosunku do nicieni Do antagonistów nicieni nale ¹ grzyby endofityczne, grzyby nicieniobójcze (w tym grzyby drapie ne, endopaso yty, paso yty jaj i cyst oraz grzyby produkuj¹ce toksyny), i bakterie (Actinomycetes, bakterie ryzosferowe, bakterie endofityczne, rizobia, bakterie z rodzaju Pasteuria). 3.1. Grzyby endofityczne Grzyby te wystêpuj¹ wewn¹trz tkanek roœlinnych. Do tej pory poznano niewiele gatunków nale ¹cych do tej grupy. Nale ¹ do nich m.in. Fusarium oxysporum, Melanconium betulinum, Phomopsis phaseoli (7,8). Obecnoœæ tych organizmów wp³ywa BIOTECHNOLOGIA 2 (81) 115-130 2008 117

Aleksandra Obrêpalska-Stêplowska, Danuta Sosnowska stymuluj¹co na wzrost roœlin i hamuje choroby (9). Ich obecnoœæ zwiêksza odpornoœæ roœlin poprzez wzrost ich tolerancji, pobierania i przyswajania sk³adników mineralnych i hamowanie inwazji nicieni (10,11). 3.2. Grzyby nicieniobójcze Grzyby te maj¹ zdolnoœæ do paso ytowania lub parali owania nicieni (12,13). W zale noœci od sposobu infekowania, grzyby nicieniobójcze podzielono na nastêpuj¹ce grupy: grzyby drapie ne, posiadaj¹ one struktury chwytne lub stanowi¹ce pu³apki, takie jak adhezyjne (przyczepne) guzki, sieci, odga³êzienia lub pierœcienie zaciskaj¹ce (14,15). Ich oddzia³ywania z gospodarzem nie s¹ gatunkowo specyficzne. Grzyby te mog¹ równie produkowaæ toksyny parali uj¹ce ofiary (12). Mog¹ równie yæ saprofitycznie w glebie. Do tej grupy nale ¹ m.in. grzyby z rodzaju Arthrobotrys (15); endopaso yty, czyli organizmy yj¹ce wewn¹trz cia³a ofiary infekuj¹ nicienie za pomoc¹ spor. Wiele z nich jest paso ytami bezwzglêdnymi yj¹cymi wewn¹trz nicienia i produkuj¹cymi spory na zewn¹trz jego cia³a. Maj¹ wiêksz¹ specyficznoœæ w stosunku do gospodarza ni poprzednia grupa (16). Endopaso yty w zale noœci od stadium rozwojowego nicienia, na którym paso ytuj¹, dziel¹ siê na cztery podgrupy: a) Paso yty stadiów larwalnych nicieni np. Hirsutella rhossiliensis. Ich spory s¹ zwykle adhezyjne i przyczepiaj¹ siê do kutikuli, a nastêpnie kie³kuj¹ do wnêtrza cia³a nicienia asymiluj¹c jego zawartoœæ przed zarodnikowaniem (16). b) Paso yty osiad³ych samic: mog¹ byæ paso ytami obligatoryjnymi, np. grzyb Nematophthora gynophilia patogen Heterodera avenae lub fakultatywnymi, np. grzyb Pochonia chlamydosporia równie paso ytuj¹cy na Heterodera (4,5). S¹ równie fakultatywnymi saprofitami glebowymi. c) Paso yty jaj, np. P. chlamydosporia i Paecilomyces lilacinus. Stadium infekcyjnym P. chlamydosporia jest chlamydospora, która w odpowiednich warunkach, po dostaniu siê na powierzchniê jaja nicienia, zaczyna wytwarzaæ enzymy rozpuszczaj¹ce os³onkê jajow¹ i za pomoc¹ specjalnej strzêpki infekcyjnej zwanej appressorium (przycistka, zgrubia³ego fragmentu grzybni, którym grzyb przytwierdza siê do pod- ³o a w pocz¹tkowej fazie infekcji) wnika do jego wnêtrza. Zawartoœæ jaja jest wch³aniana i po pewnym czasie zamiast larwy wype³nia je grzybnia (17). Grzyb atakuje tylko niedojrza³e jaja nicieni. Podobny sposób paso ytowania posiada P. lilacinus, z tym e jego stadium infekcyjnym s¹ konidia elipsoidalnego kszta³tu. U wiêkszoœci tych grzybów stwierdzono aktywnoœæ chitynolityczn¹. Chityna stanowi wiêksz¹ czêœæ os³onki jaja, natomiast nie wchodzi w sk³ad kutikuli larwalnej (rys. 1) (18). Gatunki tych grzybów s¹ paso ytami jaj nicieni i pora aj¹ zarówno m¹twiki jak i guzaki. Szczególnie skutecznie infekuj¹ jaja guzaków, które doros³e samice sk³adaj¹ do galaretowatych woreczków z³o onych przez samicê do gleby lub do wnêtrza tkanki 118 PRACE PRZEGL DOWE

Czynniki chorobotwórcze w biologicznym zwalczaniu nicieni szkodników roœlin korzenia lub te na zewn¹trz. To wilgotne galaretowate pod³o e z³ó jajowych nicienia mo e byæ po ywk¹ dla grzybów paso ytniczych, a ogromna liczba jaj w z³o u jajowym (do 400) jest dostêpna i dogodna dla rozprzestrzeniania siê grzybni. W przypadku nicieni tworz¹cych cysty droga infekcji przez te grzyby jest inna. Jaja nicienia znajduj¹ siê wewn¹trz cysty w glebie i patogen musi najpierw przedostaæ siê przez jej naturalne otwory, aby je zainfekowaæ. Grzyby te mog¹ równie rozwijaæ siê na powierzchni cysty jako saprofity. d) Paso yty jaj, samic i larw. Wiele gatunków grzybów, które g³ównie paso ytuje na danym stadium rozwojowym (tylko jaja lub tylko samice) mo e okazjonalnie atakowaæ inne stadia u tego nicienia (np. samice). Nie s¹ one jednak w równym stopniu efektywne w paso ytowaniu na wszystkich stadiach w warunkach naturalnych. 3.3. Bakterie Actinomycetes, szczególne znaczenie w aspekcie biologicznego zwalczania maj¹ przedstawiciele rodzaju Streptomyces, np. Streptomyces avermitilis produkuje makrocykliczne laktony (awermektyny), które posiadaj¹ aktywnoœæ nicieniobójcz¹ i s¹ u ywane w preparatach do zwalczania nicieni (19). Bakterie ryzosfery, wystêpuj¹ obficie w ryzosferze i mog¹ j¹ istotnie modyfikowaæ, wp³ywaj¹c w ten sposób na oddzia³ywanie nicieni z ich gospodarzami roœlinnymi (20). Niektóre z nich, np. Agrobacterium radiobacter, Bacillus spp., czy Pseudomonas spp. s¹ antagonistami bakterii i grzybów wywo³uj¹cych choroby roœlin i s¹ okreœlane jako tzw. bakterie ryzosfery stymuluj¹ce wzrost roœlin (PGPR, ang. plant growth promoting rhizobacteria) (21,22). Hamuj¹ one te rozwój guzaków korzeniowych (Meloidogyne spp.) poprzez ograniczenie ich rozmna ania, jak i rozwoju ich larw (20,22-24). Bakterie endofityczne, wystêpuj¹ w ró nych tkankach wielu roœlin wy szych. Nale ¹ do nich m.in. Kocaria varians i Microbacterium esteroromaticum, bêd¹ce antagonistami nicieni z rodzaju Pratylenchus, hamuj¹cymi ich rozmna anie (25). Rizobia, bakterie glebowe wchodz¹ce w symbiotyczne interakcje z roœlinami motylkowatymi. Maj¹ du e znaczenie dla œrodowiska, gdy s¹ odpowiedzialne za wi¹zanie azotu atmosferycznego. Chroni¹ uprawy przed wieloma patogenami grzybowymi, a tak e przed guzakami korzeniowymi, zmniejszaj¹c prze ywalnoœæ ich larw w glebie (26). Bakterie z rodzaju Pasteuria, nale ¹ do najczêœciej stosowanych w praktyce do ograniczania populacji nicieni-szkodników roœlin (zw³aszcza gatunek Pasteuria penetrans) (27). Te Gram-dodatnie bakterie tworz¹ce endospory s¹ obligatoryjnymi paso ytami nicieni, rozwijaj¹cymi siê preferencyjnie na ich organach rozrodczych, powoduj¹c hamowanie rozmna ania nicieni (28). Natura interakcji Pasteuria-nicieñ jest wysoko specyficzna gatunkowo, a nawet populacyjnie. Zale y równie od stadium rozwojowego ywiciela (29). Pasteuria paso ytuje wy³¹cznie na stadium m³odocianym J2 (30). Dotychczas opisano trzy gatunki paso ytuj¹ce na nicieniach: BIOTECHNOLOGIA 2 (81) 115-130 2008 119

Aleksandra Obrêpalska-Stêplowska, Danuta Sosnowska Pasteuria penetrans na Meloidogyne spp., P. thornei na Pratylenchus spp., i P. nishizawae na nicieniach tworz¹cych cysty nale ¹cych do rodzajów Heterodera i Globodera spp. (31). 4. Podstawy biochemiczne antagonizmu nicieñ mikroorganizm Mikroorganizmy antagonistyczne w stosunku do nicieni paso ytuj¹cych na roœlinach wykorzystuj¹ mechanizmy biochemiczne negatywnie wp³ywaj¹ce na fizjologiê ich gospodarzy. Nale ¹ do nich: produkcja toksycznych metabolitów, produkcja metabolitów stymuluj¹cych wykluwanie, zmieniaj¹cych fizjologiê nicienia czy zmniejszaj¹cych paso ytnicze w³aœciwoœci gospodarza w infekowaniu roœlin (19). Metabolity te mo na podzieliæ na dwie grupy: inhibitory i stymulatory. Inhibitory, nale ¹ do nich toksyny, antybiotyki i metabolity wtórne produkowane przez antagonistów. Toksyczne zwi¹zki s¹ syntetyzowane przez wiêkszoœæ bakterii: np. Clostridium butyricum produkuje mieszaninê kwasów: mrówkowego, octowego, propionowego i mas³owego, które s¹ toksyczne dla nicienia Tylenchorhynchus martini (32). Z kolei Desulfovibrio desulfuricans mo e uwalniaæ siarkowodór, co jest wykorzystywane w zalewanych polach ry owych do biologicznego zwalczania nicieni (33). Streptomyces avermitilis (Actinomycetes) produkuje makrocykliczne laktony (awermektyny) o szerokim zakresie dzia³ania nicieniobójczego (34). Wiele grzybów równie produkuje antybiotyki lub substancje o dzia³aniu nicieniobójczym. Metabolity te mog¹ zmieniaæ strukturê os³onki jaja, hamowaæ rozwój embrionalny i powodowaæ zaburzenia fizjologiczne (35). Niektóre z inhibitorów produkowanych przez grzyby zosta³y przedstawione w tabeli 1. Enzymy i metabolity wtórne produkowane przez grzyby nicieniobójcze Tabela 1 Grzyby Substancja czynna Dzia³anie i gospodarz Omphalotus olearius omfalotyna A nicieniobójcze, guzaki korzeniowe endofity kostrzewy trzcinowatej Festuca arundinacea alkaloidy lolinowe, pirolopirazina, kwasy organiczne redukuj¹ ywotnoœæ nicieni roœlinnych, Pratylenchus sp. Fusarium oxysporum metabolity wtórne redukuj¹ ywotnoœæ M. incognita Pleurotus ostreatus kwas trans-2-dekenodikarboksylowy nicieniobójcze, Panagrellus sp., M. arenaria Paecilomyces lilacinus, Trichoderma longibrachiatum kwas octowy nicieniobójcze, guzaki korzeniowe Arthrobotrys conoides, A. chlamydosporia kwas linolowy nicieniobójcze, Bursaphelenchus sp., Panagrellus sp. Pochonia chlamydosporia proteazy os³onka jajowa; M. incognita Tabela opracowana na podstawie informacji zawartych w (35). 120 PRACE PRZEGL DOWE

Czynniki chorobotwórcze w biologicznym zwalczaniu nicieni szkodników roœlin Stymulatory, substancje, które mog¹ indukowaæ przedwczesne wykluwanie siê larw z jaj, co upoœledza aktywnoœæ nicienia w procesie infekcji gospodarzy. Mog¹ one równie mieæ wp³yw na przepuszczalnoœæ os³onki jajowej, indukowaæ ruch larw w jaju, powodowaæ sekrecjê enzymów, które mog¹ rozpuszczaæ os³onkê jajow¹ przez zemulsyfikowanie jej warstwy lipidowej (18). 5. Interakcje nicieñ antagonista Proces infekcji nicieni przez antagonistyczne mikroorganizmy jest s³abo poznany. Uwa a siê, e wiêkszoœæ mechanizmów wykorzystywanych w tym procesie przez bakterie i grzyby jest podobna. Stwierdzono nawet, e aden z poznanych mechanizmów infekcji nie jest wykorzystywany wy³¹cznie przez bakterie lub wy³¹cznie przez grzyby (6). Jednak e istniej¹ doœæ znaczne ró nice na etapie rozpoznania i interakcji z gospodarzem. W du ej mierze zale ¹ one od struktury, któr¹ pos³uguje siê dany mikroorganizm w celu zainfekowania nicienia: mog¹ to byæ adhezyjne spory, które kie³kuj¹c na powierzchni cia³a nicienia wnikaj¹ do jego wnêtrza za pomoc¹ specjalnego wyrostka zwanego appressorium (przycistka, zgrubia³ego fragmentu grzybni) (36). Bardzo du e znaczenie ma równie stadium rozwojowe nicienia, które ulega infekcji, gdy od niego zale y jak¹ pierwsz¹ barierê bêdzie mia³ do pokonania mikroorganizm os³onkê jajow¹ czy kutikulê. Od sk³adu chemicznego tej bariery zale y, w jaki sposób i za pomoc¹ jakich enzymów bêdzie ona pokonana. W przypadku jaj, ich os³onka w du ej mierze zbudowana jest z chityny. Tak np., grzyb P. chlamydosporia dziêki odpowiednim enzymom chitynolitycznym mo e rozpuœciæ warstwê chityno- Rys. 1. Struktura i warstwy A) os³onki jajowej oraz B) przyk³adowej kutikuli osobnika doros³ego wg www.wormatlas.org, zmodyfikowane. BIOTECHNOLOGIA 2 (81) 115-130 2008 121

Aleksandra Obrêpalska-Stêplowska, Danuta Sosnowska w¹ jaja i wnikn¹æ do jego wnêtrza (37). Z kolei wszystkie pozosta³e stadia jej nie posiadaj¹, awtomiejsce pojawiaj¹ siê w³ókna kolagenowe (38). Struktura kolagenu, jak równie jej sk³ad zale y tak e od stadium rozwojowego. Wiêkszoœæ kolagenów u stadiów larwalnych (J) jest glikozylowana, w przeciwieñstwie do stadiów doros³ych (39). Struktura kutikuli jest równie ró na u ró nych gatunków nicieni. Przyk³adowy schemat przedstawiaj¹cy warstwy w os³once jaja oraz w kutikuli przedstawiono na rysunku 1. Najlepiej poznanym przyk³adem pierwszego etapu interakcji antagonistycznych nicieñ-mikroorganizm jest proces rozpoznania w infekcji nicieni z rodzaju Meloidogyne przez bakteriê Pasteuria, ale równie on nie jest dobrze wyjaœniony. Powierzchnia spor bakteryjnych pokryta jest adhezynami, których natura nie jest poznana (40). Bior¹ one udzia³ w interakcjach z receptorem na powierzchni nicieni. Powierzchnia spory jest bardzo heterogenna. W wyniku przeprowadzonych badañ z zastosowaniem przeciwcia³ monoklonalnych wskazuje siê na udzia³ w procesie interakcji szeregu epitopów, których dystrybucja na powierzchni spory ró ni siê nawet pomiêdzy populacjami Pasteuria (41). Adhezyny ró ni¹ siê zarówno konformacj¹, jak i specyficznoœci¹ gatunkow¹ (41). Na podstawie badañ fizjochemicznych wskazuje siê, e w wi¹zaniu spory do kutikuli nicienia odgrywaj¹ rolê oddzia³ywania hydrofobowe (42). W jednej z hipotez mówi siê o udziale fibronektyny w rozpoznaniu spora bakteryjna kutikula nicienia (43). Fibronektyna jest zewn¹trzkomórkow¹ glikoprotein¹ obecn¹ w formie rozpuszczalnej (osocze) lub nierozpuszczalnej (macierze zewn¹trzkomórkowe) u wielu zwierz¹t (44). Odgrywa wa n¹ rolê w patogenezie wielu bakterii (45). Fibronektyna posiada w strukturze trzy modu³y: Fn1, Fn2 i Fn3, które razem tworz¹ domeny zawieraj¹ce miejsca wi¹zania ró nych cz¹steczek, w tym domenê wi¹zania elatyny (zdenaturowany kolagen) (GBD, ang. gelatin binding domain) czy heparyny (HBD, ang. heparine binding domain) (46). Potraktowanie endospor Pasteuria fragmentami bia³ka zawieraj¹cymi HBD lub GBD redukowa³o liczbê spor zwi¹zanych do kutikuli Meloidogyne (43). Wykazano, e Ceanorhabditis elegans oraz Meloidogyne incognita posiadaj¹ heterodimery podobne do modu³ów Fn. Znaleziono równie wiele polipeptydów w zewn¹trzkomórkowej macierzy nicieni rozpoznawanych przez przeciwcia³a poliklonalne dla ludzkiej fibronektyny (47). Prawdopodobny jest te udzia³ glikoprotein na powierzchni spory w procesie rozpoznania. Wydaje siê, e s¹ to O-glikoproteiny (41), a nie jak uwa ano wczeœniej N-glikoproteiny (40). 6. Czynniki wirulencji w interakcjach nicieñ antagonista W badaniach nad oddzia³ywaniami mikroorganizmy-nicienie coraz wiêksz¹ uwagê poœwiêca siê podstawom biochemicznym tych interakcji. Daje to mo liwoœæ bardziej dog³êbnego zrozumienia zachodz¹cych procesów, a poznanie natury wirulencji u omawianych mikroorganizmów jest podstaw¹ do opracowywania nowych tech- 122 PRACE PRZEGL DOWE

Czynniki chorobotwórcze w biologicznym zwalczaniu nicieni szkodników roœlin nologii ochrony roœlin przy wykorzystaniu nicieniobójczych substancji produkowanych przez bakterie i grzyby. Za g³ówne czynniki wirulencji w procesie infekcji uwa ane s¹ enzymy zewn¹trzkomórkowe, w tym proteazy, chitynazy i kolagenazy odpowiadaj¹ce chemicznym sk³adnikom kutikuli i os³onki jaja nicieni. Enzymy te s¹ zaanga owane w proces infekcji i prawdopodobnie bior¹ udzia³ w wielu jego etapach, takich jak penetracja (po³¹czenie uszkodzenia mechanicznego i aktywnoœci hydrolitycznej enzymów), trawienie wewnêtrznych tkanek gospodarza, proces uwalniania toksyn (48). Enzymy wielu mikroorganizmów zaanga owane w infekcjê nicieni paso ytuj¹cych na roœlinach by³y izolowane, koduj¹ce je geny sekwencjonowane, porównywane i charakteryzowane (41,49-51). 6.1. Proteazy Proteazy nale ¹ do najszerzej analizowanych czynników wirulencji w procesie infekcji nicieni przez mikroorganizmy. Wyizolowane z wielu grzybów i bakterii s¹ g³ównie proteazami serynowymi (37). Maj¹ wysoki stopieñ podobieñstwa do proteazy K nale ¹cej do rodziny proteaz serynowych subtylizynopodobnych izolowanych z grzybów i bakterii Gram-ujemnych. Proteazy te maj¹ konserwatywn¹ triadê aminokwasow¹: kwas asparaginowy-histydyna-seryna oraz konserwatywne domeny wi¹- ¹ce substrat posiadaj¹ce serynê. Masa cz¹steczkowa takich proteaz izolowanych z grzybów paso ytuj¹cych na jajach oraz endopaso ytów wynosi 32-33 kda, natomiast u grzybów drapie nych 35-39 kda (52,53). Proteazy te wp³ywaj¹ równie na liczbê organów pu³apkowych (u odpowiedniej grupy grzybów), mog¹ stymulowaæ ich tworzenie, a tak e trawiæ tkanki nicieni zapewniaj¹c po ywkê dla rozwoju struktur infekcyjnych grzyba (54). Poznane proteazy maj¹ relatywnie du ¹ specyficznoœæ substratow¹ oraz wysoki poziom homologii na N-koñcu sekwencji, zw³aszcza u grzybów nicieniobójczych (rys. 2). Do najlepiej scharakteryzowanych nale ¹: Rys. 2. Porównianie N-koñca sekwencji aminokwasowej wybranych proteaz serynowych (wg 48, zmodyfikowane). BIOTECHNOLOGIA 2 (81) 115-130 2008 123

Aleksandra Obrêpalska-Stêplowska, Danuta Sosnowska Proteaza PII, wyizolowana z grzyba Arthrobotrys oligospora, ma masê cz¹steczkow¹ ok. 35 kda i optimum aktywnoœci pomiêdzy ph 7a9.Podobnie jak proteaza Aoz1 (równie z A. oligospora), MIx z Monacrosporium microscaphoides oraz Pr1C z Clonostacys rosea unieruchamia wolno yj¹ce nicienie i hydrolizuje bia³ka ich kutikuli (52). Wykazuje wysok¹ aktywnoœæ hydrolityczn¹ w stosunku do takich substratów jak: albuminy surowicy, elatyna, zdenaturowana kazeina i kolagen, a nawet ca³e preparaty kutikuli nicieni. W stosunku do natywnego kolagenu wykazuje natomiast ograniczon¹ aktywnoœæ (55). W doœwiadczeniach prowadzonych przez Ahman i wsp. (54) przygotowano kilka mutantów PII, w tym mutanty z delecj¹ genu PII oraz z jego nadekspresj¹. W badaniach wykazano, e delecja genu PII mia³a tylko nieznaczny wp³yw na patogenicznoœæ grzyba, natomiast nadekspresja znacz¹co zwiêksza³a zdolnoœæ zmutowanych grzybów do zabijania nicieni (54). Proteaza VCP1, wyizolowana z grzyba Pochonia chlamydosporia jest alkaliczn¹ proteaz¹ serynow¹ funkcjonalnie i serologicznie podobn¹ do proteazy PR1 z Metarhizium anisopliae (najczêœciej stosowany grzyb owadobójczy, który syntetyzuje tê proteazê, a jego transformanty z wieloma kopiami PR1 maj¹ znacznie podwy szon¹ wirulencjê (56). Proteaza ta usuwa zewnêtrzn¹ witelinow¹ warstwê z jaj nicieni eksponuj¹c warstwê chitynow¹. Proteaza VCP1 wystêpuje w dwóch izoformach wyizolowanych z dwóch grup nicieni: tworz¹cych cysty oraz guzaków korzeniowych (49). Izoformy te ró ni¹ siê pomiêdzy sob¹ dwoma aminokwasami w pozycjach 65 (Glu lub Gln) oraz 99 (Gly lub Ala) (54). Ró nice te mog¹ byæ odpowiedzialne za odmienne w³aœciwoœci enzymu, przyczyniaj¹c siê do ró nych preferencji w infekowaniu gospodarza. Substytucja Glu-Gln mo e zmieniæ ³adunek enzymu zachowuj¹c jego strukturê, natomiast polimorfizm Gly/Ala wystêpuje w rejonie wi¹ ¹cym substrat. Ró nica w wielkoœci reszty aminokwasowej mo e w tym przypadku znacz¹co wp³yn¹æ na aktywnoœæ enzymu. VCP1 w przeciwieñstwie do proteaz uzyskanych z M. anisopliae oraz A. oligospora nie posiada potencjalnych miejsc N-glikozylacji (49). Proteaza HnspI, jest neutraln¹ zewn¹trzkomórkow¹ proteaz¹ serynow¹, o masie cz¹steczkowej ok. 32 kda. Zosta³a wyizolowana z izolatu OWVT1 grzyba Hirsutella rhossiliensis, paso yta m¹twika sojowego. Wykazuje stabiln¹ aktywnoœæ w przedziale ph pomiêdzy6a8.nale y do chymotrypsynowych/subtylizynowych proteaz serynowych (50). Proteazy BLG4 i NPE-4, s¹ jednymi z nielicznych proteaz bakteryjnych scharakteryzowanych do tej pory. Zosta³y wyizolowane z Brevibacillus laterosporus (48,51). Za wiêkszoœæ aktywnoœci nicieniobójczych tej bakterii odpowiada zewn¹trzkomórkowa alkaliczna proteaza BLG4, niszcz¹ca kutikulê gospodarzy B. laterosporus, którymi mog¹ byæ: H. glycines, Trichostrongylus colubriformis, Bursaphelenchus xylophilus isaprofityczny nicieñ Panagrellus redivivus. Szczepy pozbawione tej proteazy wykazywa³y tylko 43% swoich zdolnoœci nicieniobójczych (57). Za pozosta³¹ aktywnoœæ odpowiada proteaza NPE-4. Jednak e sama oczyszczona proteaza NPE-4 wykazywa³a ma³¹ aktywnoœæ nicieniobójcz¹ in vitro i nie by³a w stanie indukowaæ degradacji nienaruszonej kutikuli gospodarza. Natomiast znacz¹co zwiêksza³a patogenicznoœæ 124 PRACE PRZEGL DOWE

Czynniki chorobotwórcze w biologicznym zwalczaniu nicieni szkodników roœlin dzikiego szczepu B. laterosporus posiadaj¹cego proteazê BLG4. Nasunê³o to wniosek, e te dwie bakteryjne proteazy zewn¹trzkomórkowe mog¹ odgrywaæ inn¹ rolê na ró nych etapach infekcji lub wspóln¹ rolê w penetracji kutikuli nicienia przez B. laterosporus (51). 6.2. Chitynazy Chitynazy hydrolizuj¹ chitynê i uczestnicz¹ w procesie penetracji nicieni. S¹ enzymami indukowanymi i pe³ni¹ wa n¹ rolê stymuluj¹c¹ w procesie wzrostu strzêpek grzyba (58). Prawdopodobnie uczestnicz¹ te w degradacji os³onek jaj nicieni (59). Odnotowano, e proporcja zainfekowanych jaj nicieni wzrasta³a wraz ze zwiêkszeniem aktywnoœci chitynazowej (59). Jednak e ta grupa enzymów istotnych dla biologicznego zwalczania nicieni, jest równie bardzo s³abo poznana. Jedynym przyk³adem s¹ chitynazy CHI43, o masie cz¹steczkowej 43 kda, oczyszczone i scharakteryzowane w 2002 r. (60). CHI43 wyizolowane z P. chlamydosporia i P. suchlasporia wykazuj¹ podobne optimum aktywnoœci w stosunku do koloidalnego roztworu chityny w ph 5,2-5,7. Na podstawie analizy wp³ywu CHI43 na os³onki jaj nicieni G. pallida razem z protez¹ P32, wykazano, e jej degradacja nastêpowa³a jedynie, wówczas gdy zosta³y u yte oba enzymy (60). 6.3. Kolagenazy Kolagenazy s¹ najs³abiej zbadan¹ grup¹ enzymów uczestnicz¹cych w trawieniu pow³ok cia³a nicieni (61). S¹ definiowane jako enzymy katalizuj¹ce hydrolizê w³ókien kolagenu i elatyny. Potwierdzono udzia³ bakteryjnych i grzybowych kolagenaz w badaniach nad infekcj¹ C. elegans bakteriami i grzybami. Stwierdzono, e oczyszczona kolagenaza z Arthrobotrys amerospora mo e degradowaæ bia³ka kutikuli nicieni, pe³ni¹c istotn¹ rolê na etapie jej penetracji (62). 7. Biopreparaty i cechy mikroorganizmów wykorzystywanych do biologicznego zwalczania nicieni Ograniczanie populacji nicieni szkodników roœlin odbywa siê g³ównie przez zastosowanie chemicznych œrodków ochrony roœlin. W œwiecie jednak stosuje siê œrodki biologiczne oparte na ró nych gatunkach grzybów paso ytniczych, drapie - nych i ich metabolitach (63). Mechanizm dzia³ania organizmów wykorzystywanych w formie biopreparatów zosta³ opisany w tej publikacji. W Polsce nie zarejestrowano do tej pory adnego z wymienionych w tabeli 2 œrodków, co jest uzale nione od ich producenta. Przed przygotowaniem bioprepa- BIOTECHNOLOGIA 2 (81) 115-130 2008 125

Aleksandra Obrêpalska-Stêplowska, Danuta Sosnowska ratów do zwalczania nicieni, nale y wczeœniej przeprowadziæ szereg testów na wybranych mikroorganizmach, które mog¹ byæ kandydatami do wykorzystania w praktyce. Wymaganymi cechami antagonistów rozpatrywanych do tego celu s¹: specyficznoœæ gatunkowa tak, aby tylko docelowy gatunek ulega³ infekcji; synchronizacja ich rozwoju z gospodarzem; zdolnoœæ prze ycia okresów, gdy potencjalny gospodarz wystêpuje w ma³ych iloœciach; zdolnoœæ znalezienia potencjalnego gospodarza infekcji w glebie i szybkie tempo namna ania, warunkuj¹ce skutecznoœæ dzia- ³ania. Tabela 2 Œrodki nicieniobójcze przygotowane na bazie mikroorganizmów antagonistycznych, produkowanych komercyjnie Nazwa handlowa œrodka Gatunek wchodz¹cy w sk³ad biopreparatu Gospodarz Abamectin Streptomyces avermitilis (Actinomycetes) Meloidogyne incognita Biocon Paecilomyces lilacinus Meloidogyne sp. Bionem Bacillus firmus Meloidogyne sp. i inne nicienie, w tym Heterodera avenae Deny Burkholderia cepacia M. incognita DiTera Myrothecium sp. Globodera rostochiensis, G. pallida, H. glycines, H. schachtii, M. incognita, Radophalus sp. Miexianning Paecillomyces lilacinus Meloidogyne sp. paso ytuj¹ce na tytoniu Nemont nieokreœlony grzyb drapie ny M. javanica Royal 350 Arthrobotrys robusta niszczyk pieczarkowiec (Ditylenchus myceliophagous) Paecil Paecilomyces lilacinus Meloidogyne sp. Xianchongbike Pochonia chlamydosporia Meloidogyne sp. Klami C P. chlamydosporia Meloidogyne sp. na warzywach Opracowano wg 10, zmodyfikowane. Asortyment tych œrodków jest jednak niewielki w porównaniu ze œrodkami stosowanymi do ograniczania populacji innych agrofagów (owady, choroby, chwasty). Najprawdopodobniej jest to zwi¹zane z samym szkodnikiem jakim jest nicieñ, którego cykl rozwojowy jest tak skomplikowany, e odpowiednie zastosowanie œrodka biologicznego jest bardzo trudne, eby uzyskaæ po ¹dany efekt. Wiele z grzybów paso ytniczych jest wysoce wyspecjalizowana i infekuje tylko jaja nicieni (np. P. chlamydosporia). Stadium infekcyjnym nicieni s¹ larwy. W praktyce trudno jest utrafiæ na moment masowego sk³adania jaj przez samice nicieni i tym samym trudno jest ograniczyæ w³aœnie to stadium rozwojowe szkodnika. Dlatego po zastosowaniu biopreparatu zawieraj¹cego np. chlamidospory grzyba P. chlamydosporia trudno uzyskaæ wysok¹ skutecznoœæ i to najczêœciej zniechêca rolników do ich stosowania. Grzyby s¹ bardzo uzale nione od warunków abiotycznych, jak temperatura i wilgot- 126 PRACE PRZEGL DOWE

Czynniki chorobotwórcze w biologicznym zwalczaniu nicieni szkodników roœlin noœæ. Dla wiêkszoœci optymalna temperatura dla ich rozwoju przekracza 25 C (64) i dlatego w krajach z klimatem ciep³ym (RPA, Tajlandia, Kuba) s¹ one najczêœciej rekomendowane do ograniczania nicieni (64). W Niemczech zarejestrowano biopreparat zawieraj¹cy zarodniki grzyba P. lilacinus do zwalczania guzaków korzeniowych (Meloidogyne spp.) oraz m¹twików Globodera spp. Grzyb ten mo e rozwijaæ siê w temperaturze 15 C, dlatego jest rekomendowany do zastosowania w warunkach polowych (64). W Anglii wieloletnie badania zakoñczono opracowaniem technologii masowej produkcji biopreparatu zawieraj¹cego chlamydospory grzyba P. chlamydosporia, jednak jest on zarejestrowany do stosowania na Kubie w ograniczaniu guzaków korzeniowych (65). W Polsce badano krajowe szczepy grzybów nicieniobójczych: P. lilacinus i P. chlamydosporia. Stosowano je w szklarniach do ograniczania populacji guzaka arachidowego (Meloidogyne arenaria) oraz okreœlono warunki ich praktycznego stosowania (66,67). W warunkach polowych w uprawie buraka cukrowego wykazano znaczenie grzybów paso ytniczych w ograniczaniu populacji m¹twika burakowego (Heterodera schachtii). Ich skutecznoœæ by³a wiêksza na polach nawo onych organicznie (s³oma i gorczyca) (68). Jednak do tej pory w Polsce nie zarejestrowano biopreparatu do zwalczania nicieni paso ytów roœlin. 8. Uwagi koñcowe Badacze koncentruj¹ siê na poszukiwaniach najskuteczniejszych szczepów wybranych gatunków mikroorganizmów do wykorzystania w biologicznym zwalczaniu nicieni. Szczepy te ró ni¹ siê znacznie wirulencj¹, produkcj¹ zarodników i iloœci¹ potencjalnych gospodarzy, specyficznoœci¹ gatunkow¹, charakterem infekcji, a tak- e efektami ubocznymi. Wa ne jest, aby znaleÿæ takie szczepy, które bêd¹ mia³y jak najwiêksz¹ iloœæ gospodarzy, a jednoczeœnie nie by³yby niebezpieczne dla innych niedocelowych organizmów, w tym równie dla ludzi, a tak e organizmów po ytecznych takich jak roœliny uprawne, pszczo³y, jedwabniki i inne. Istotny jest te aspekt ekonomiczny czyli koszty produkcji, badañ oraz zastosowania w stosunku do strat powodowanych przez nicienie szkodniki roœlin. Zastosowanie mikroorganizmów poza szeregiem zalet ma równie pewne wady. Nale ¹ do nich m. in. niewystarczaj¹ca wiedza o nich samych, jak i wszystkich organizmach, które mog³yby infekowaæ. Istnieje te ryzyko ich niekontrolowanego rozprzestrzenienia w œrodowisku oraz skutki poœrednie wywo³ywane przez te organizmy, które s¹ trudne zarówno do przewidzenia, jak i do wykrycia. Istotn¹ przeszkod¹ w wykorzystaniu mikroorganizmów jako potencjalnych biologicznych nematocydów s¹ problemy zwi¹zane z ich rejestracj¹. Preparaty takie musz¹ przejœæ przez d³ugotrwa³e i drogie testy toksycznoœci i skutecznoœci. Do wspomnianych ograniczeñ dochodz¹ równie mechanizm dzia³ania nematocydów biologicznych w porównaniu z chemicznymi (jest on powolny, a nie natych- BIOTECHNOLOGIA 2 (81) 115-130 2008 127

Aleksandra Obrêpalska-Stêplowska, Danuta Sosnowska miastowy), ich nierówne i czasem nieprzewidywalne dzia³anie w warunkach polowych, ró na skutecznoœæ oraz problemy z formulacj¹ (zw³aszcza w przypadku paso ytów/patogenów obligatoryjnych, których cykl yciowy jest œciœle zwi¹zany z ywym gospodarzem, np. Pasteuria). Przysz³oœæ ochrony roœlin jest zwi¹zana z produkcj¹ zdrowej ywnoœci w ramach rolnictwa integrowanego i ekologicznego. Przejœcie na ochronê biologiczn¹ bêdzie mo liwe tylko, wtedy gdy proponowane nowe sposoby ochrony upraw zapewni¹ wysokie plony i wysok¹ skutecznoœæ zwalczania nicieniowych szkodników roœlin. Znajomoœæ wp³ywu mikroorganizmów na populacjê szkodnika jest pierwszym etapem poszukiwania takich szczepów, których wysoka wirulentnoœæ zapewni znaczn¹ redukcjê liczebnoœci szkodnika i doprowadzi do produkcji biopreparatu. W³aœnie takich nowych mo liwoœci ochrony upraw polowych i szklarniowych trzeba ju dzisiaj szukaæ, tym bardziej, e celem zasadniczym jest zmniejszenie ska- enia œrodowiska glebowego. Literatura 1. Chitwood D. J., (2003), Pest. Manag. Sci., 59, 748-753. 2. Shurtleff M. C., Averre C. W., (2000), Diagnosing plant diseases caused by nematodes, APS Press, The American Phytopathological Society, St. Paul, Minesota, USA. 3. Crump D. H., (1989), Aspects Appl. Biol., 22, 135-140. 4. Kerry B. R., (1981), Plant Dis., 65, 390-393. 5. Sosnowska D., Banaszak H., (1998), Progr. in Plant Protect/Postêpy w Ochronie Roœlin, 38, 455-458. 6. Hajek A. E., (2004), Natural Enemies, Cambridge University Press, Cambridge, UK, 105-126. 7. Hallman J., Sikora R. A., (1996), Eur. J. Plant Pathol., 102, 155-162. 8. Schwartz M., Kopcke B., Weber R. W. S., Sterner O., Anke H., (2004), 65, 239-2245. 9. Hyakamachi M., Kubota M., (2004), Fungal Biotechnology in Agricultural, Food and Environmental Applications, Eds. Atora D. K., Bridge P. D., Bhatnagar D., 104-110, Marcel Dekker Inc., New York, USA. 10. Dong L. Q., Zhang K. Q., (2006), Plant Soil., 288, 31-45. 11. Waceke J. W., Waudo S. W., Sikora R., (2001), Int. J. Pest. Manag., 47, 135-140. 12. Tunlid A., Jansson S., (1991), Appl. Environ. Microbiol., 57, 2868-2872. 13. Sorbo G., Marziano F., D Errico F. P., (2003), J. Plant Pathol., 85, 219-221. 14. Jarowaja N., (1964), Gazeta Cukrownicza, 72, 288-292. 15. Jarowaja N., (1970), Acta Mycologica, 2, 337-406. 16. Jansson H. B., Lopez-Llorca L. V., (2001), Trichomycetes and Other Fungal Groups, Eds. Misra J. K., Horn B. W., 144-173, Science Publishers Inc., Enfield, NH, USA. 17. Barron G. L. (1977), The nematode-destroying fungi, Canadian Biological Publications, Ontario, Canada, 140. 18. Jatala P., (1986), Ann. Rev. Phytopathol., 24, 454-489. 19. Samac D. A., Kindel L. L., (2001), Plant Soil., 235, 35-44. 20. Neipp P. W., Becker J. O., (1999), J. Nematol., 31, 54-61. 21. Jonathan E. I., Barker K. R., Abdel-Alim F. F., Vrain T. C., Dickson D. W., (2000), Nematropica, 30, 231-240. 22. Chen J., Abawi G. S., Zuckerman B. M., (2000), J. Nematol., 32, 70-77. 23. Jagdafe G. B., Grewal P. S., (2002), Pest. Manag. Sci., 58, 451-458. 24. Talavera M., Itou K., Mizukubo T., (2002), Appl. Entomol. Zool., 37, 61-67. 25. Sturz A. V., Kimpinski J., (2004), Plant Soil., 262, 241-249. 128 PRACE PRZEGL DOWE

Czynniki chorobotwórcze w biologicznym zwalczaniu nicieni szkodników roœlin 26. Siddiqui I. A., Shaukat S. S., (2002), Biol. Fertil. Soils., 36, 260-268. 27. Stirling G. R., (1991), Biological Control of Plant-Parasitic Nematods: Progress, Problems and Prospects, CAB International, Wallingford. 28. Sturhan D., Winkelheide R., Sayre R. M., Wergin W. P., (1994), Fund. Appl. Nematol., 17, 29-42. 29. Sayre, R. M. (1993), Pasteuria, Metchnikoff 1888, in: Bacillus subtilis and Other Gram Positive Bacteria: Biochemistry, Physiology, and Molecular Genetics, Eds. Sonenshein A. L., Hoch J. A., Losick R., 101 111, American Society for Microbiology Washington, DC, USA. 30. Bird D. M., Opperman C. H., Davies K. G., (2003), Int. J. Parasitol., 33, 1269-1276. 31. Chen Z. X., Dickson D. W., (1998), J. Nematol., 30, 313-340. 32. Browning M., Dawson C., Alm S. R., Gorres J. H., Amador J. A., (2004), Applied. Soil. Ecol., 27, 47-54. 33. Santegoeds C. M., Ferdelman T. G., Muyzer G., de Beer D., (1998), Appl. Environ. Microbiol., 64, 3731-3739. 34. Burg R. W., Miller B. M., Baker E. E., Birnbaum J., Currie S. A., Hartman R., Kong Y.-L., Monaghan R. L., Olson G., Putter I., Tunac J. B., Wallick H., Stapley E. O., Oiwa R., Omura S., (1979), Antimicrob. Agents Chemother., 15, 361-367. 35. Meyer S. L. F., Huettel R. N., Liu X. Z., Humber R. A., Juba J., Nitao J. K., (2004), Nematology, 6, 23-32. 36. Barron G. L., (1977), The nematode-destroying fungi, Canadian Biological Publications, Ontario, Canada, 140. 37. Bird A. F., (1968), J. Parasitol., 54, 475-489. 38. Godoy G., Rodriguez-Kabana R., Morgan-Jones G., (1982), J. Nematol., 14, 441-442. 39. Reddigari S. R., Jansma P. L., Premachandran D., Hussey R. S., (1986), J. Nemat., 18, 294-302. 40. Persidis A., Lay J. G., Manousis T., Bishop A. H., Ellar D. J., (1991), J. Cell Sci., 100, 613-622. 41. Davies K. G., Redden M., (1997), J. Appl. Microbiol., 83, 227-235. 42. Afolabi P., Davies K. G., O Shea P. S., (1995), J. Appl. Bacteriol., 79, 244-249. 43. Mohan S., Fould S., Davies K. G., (2001), Parasitology, 123, 271-276. 44. Akiyama S. K., Yamada K. M., (1995), Fibronectin and fibronectin fragments, in: Extracellular Matrix: a Pracitical Approach, Eds. Haralson M. A, Hassel J. R., 175-185, IRL Press at Oxford University Press, Oxford. 45. Patti J. M., Allen B. L., McGavin M. J., Hook M., (1994), Annu. Rev. Microbiol., 48, 585-617. 46. Potts J. R., Campbell I. D., (1996), Current Opinion Cell Biol., 6, 313-320. 47. Davies K. G., Afolabi P., O Shea P. S., (1996), Parasitology, 112, 553-559. 48. Huang X., Zhao N., Zhang K., (2004), Res. Microbiol., 155, 811-816. 49. Morton C. O., Hirsch P. R., Peberdy J. P., Kerry B. R., (2003), Mycol. Res., 107, 38-46. 50. Wang B., Wu W., Liu X., (2007), Mycopathologia, 163, 169-176. 51. Tian B. Y, Yan J., Lian L. H., Chunyan W., Li N., Zhang K.Q., (2007), Appl. Microbiol. Biotechnol., 74, 372-380. 52. Zhao M. L., Mo M. H., Zhang K. Q., (2004), Mycologia, 96,16-22. 53. Zhao M. L., Huang J. S., Mo M. H., Zhang K. Q., (2005), Fungal Divers 2005, 19, 217-234. 54. Ahman J., Johansson T., Olsson M., Punt P. J., van den Hondel C. A., Tunlid A., (2002), Appl. Environ. Microbiol., 68, 3408-3415. 55. Ahman J., Ek B., Rask L., Tunlid A., (1996), Microbiology, 142,1605-1616. 56. St Leger R. J., Joshi L., Bidochka M. J., Roberts D. W., (1996), PNAS, USA, 93, 6349-6354. 57. Tian B. Y., Li N., Lian L. H., Liu J. W., Yang J. K., Zhang K. Q., (2006), Arch. Microbiol., 186, 297-305. 58. Takaya N., Yamazaki N., Horiuchi H., Ohta A., Takagi M., (1998), Microbiology, 144, 2647-2654 59. Dackman C., Chet I, Nordbringhertz B., (1989), FEMBS Microbiol. Ecol., 62, 201-208. 60. Tikhonov V. E., Lopez-Llorca L. V., Salinas J., Hansson H.-B., (2002), Fungal. Gen. Biol., 35, 67-78. 61. McLennan J. D., Mandl I., Howes L., (1953), J. Clin. Invest., 32, 1317-1322. 62. Galper S., Cohn E., Spiegel Y., Chet I., (1991), J. Nematol., 23, 269-274. 63. Sosnowska D., (2005), Postêpy Nauk Rolniczych 5, 17-27. 64. Sosnowska D., (2003), Mo liwoœci zastosowania Pochonia chlamydosporia (Goddard) Zare et Gams oraz Paecilomyces lilacinus (Thom) Samson w biologicznym zwalczaniu m¹twika burakowego (Heterodera schachtii Schmidt) i guzaków korzeniowych (Meloidogyne spp.). Rozprawy Naukowe, Instytut Ochrony Roœlin, 9, 95. BIOTECHNOLOGIA 2 (81) 115-130 2008 129

Aleksandra Obrêpalska-Stêplowska, Danuta Sosnowska 65. Bourne J. M., Kerry B. R., (2000), Int. J. Nematol., 10, 9-18. 66. Sosnowska D., Mauchline T. H., Bourne J. M., Kerry B. R., (2001), J. Plant Protect. Res., 41, 77-84. 67. Sosnowska D., Kerry B. R., (2002), Bull. Pol. Acad. Sci., Biological Sciences, 50, 17-24. 68. Sosnowska D., Banaszak H., (2000), J. Plant Protect. Res., 40, 71-77. 130 PRACE PRZEGL DOWE