diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics 2010 Volume 46 Number 1 41-52 Kontrola jakości Quality control Ogólnopolski Sprawdzian Wiarygodności Badań Mikrobiologicznych - POLMICRO 2009 Polish National External Quality Assessment Scheme in Microbiological Diagnostics POLMICRO 2009 Elżbieta Stefaniuk 1,2, Ewa Młodzińska 1, Beata Chmylak 1, Patrycja Ronkiewicz 1, Waleria Hryniewicz 1,2 1 Centralny Ośrodek Badań Jakości w Diagnostyce Mikrobiologicznej, Warszawa 2 Narodowy Instytut Leków, Warszawa Streszczenie Praca niniejsza stanowi przedstawienie i omówienie wyników XVI edycji Ogólnopolskiego Sprawdzianu Wiarygodności Badań Mikrobiologicznych - POLMICRO 2009. W roku 2009 Centralny Ośrodek Badań Jakości w Diagnostyce Mikrobiologicznej (CO- BJDM) zorganizował dwa typy sprawdzianów: jeden przeznaczony dla laboratoriów świadczących diagnostykę w szerokim zakresie oraz drugi - oddzielny sprawdzian przeznaczony dla pracowni schorzeń jelitowych stacji sanitarno-epidemiologicznych. W ramach sprawdzianu COBJDM przygotował i rozesłał do laboratoriów następujące izolaty bakteryjne: Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus gallinarum, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Haemophilus influenzae, Neisseria gonorrhoeae, Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Shigella flexneri, Salmonella enterica ser. Typhimurium, Salmonella enterica ser. Enteritidis, Salmonella enterica ser. Hadar. Izolaty charakteryzowały się różnymi fenotypami wrażliwości na leki oraz różnymi mechanizmami oporności. Zadaniem laboratoriów była identyfikacja badanych izolatów do poziomu gatunku oraz określenie lekowrażliwości na wszystkie wymienione w ankiecie antybiotyki i chemioterapeutyki oraz podanie informacji o wykrytych mechanizmach oporności. Summary The objective of this study was to analyse and discuss the results of 16th edition of Polish National External Quality Assessment Scheme in Microbiological Diagnostics - POLMICRO 2009. In 2009 two different types of proficiency programme were organised. The first one was aimed at laboratories providing a broad spectrum of microbiological diagnostics. The second was prepared for enteric diseases laboratories in sanitary inspection. In 2008 edition the following strains were distributed by the Centre of Quality Control in Microbiology (CQCM): Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus gallinarum, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Haemophilus influenzae, Neisseria gonorrhoeae, Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Shigella flexneri, Salmonella enterica ser. Typhimurium, Salmonella enterica ser. Enteritidis, Salmonella enterica ser. Hadar.The distributed isolates present different susceptibility patterns and different mechanisms of resistance. The task of the laboratory was to identify to the species level every strain and to determine their susceptibility to all antibiotics listed in the questionnaire. The laboratories were also obliged to interpret and comment detected resistance mechanisms. Słowa kluczowe: zewnątrzlaboratoryjny sprawdzian wiarygodności, identyfikacja, lekowrażliwość, mechanizmy oporności Key words: external quality assessment scheme, identification, susceptibility to antimicrobial agents, resistance s mechanisms Wstęp Ogólnopolski Sprawdzian Wiarygodności Badań w Mikrobiologii nazywany programem POLMICRO po raz pierwszy został zorganizowany w roku 1994 przez Komisję Standaryzacji i Kontroli Jakości Badań Laboratoryjnych i Mikrobiologicznych przy Departamencie Polityki Zdrowotnej Ministerstwa Zdrowia i Opieki Społecznej przy współpracy z Krajowym Zespołem Konsultanta Medycznego ds. Mikro- 41
Ogólnopolski Sprawdzian Wiarygodności Badań Mikrobiologicznych - POLMICRO 2009 biologii. Od roku 1997 organizację badań międzylaboratoryjnych przejął, powołany przez Ministra Zdrowia i Opieki Społecznej, Centralny Ośrodek Badań Jakości w Diagnostyce Mikrobiologicznej. Celem programu jest ocena kompetencji laboratoriów mikrobiologicznych w obszarze oznaczania lekowrażliwości i wykrywania mechanizmów oporności na leki drobnoustrojów wywołujących zakażenia. Zadaniem kontroli zewnątrzlaboratoryjnych organizowanych na całym świecie jest poprawa poziomu diagnostyki oraz standaryzacja stosowanych metod diagnostycznych. Sprawdziany międzylaboratoryjne mają zasięg lokalny (krajowe), kontynentalny, jak również ogólnoświatowy. Program POLMICRO ma zasięg ogólnopolski, a w kolejnych edycjach programu poruszane są aktualne problemy z zakresu klinicznej diagnostyki mikrobiologicznej. W roku 2009, w XVI edycji ogólnopolskiego Sprawdzianu Wiarygodności Badań Mikrobiologicznych POLMICRO, udział wzięło 537 laboratoriów mikrobiologicznych, o siedem laboratoriów więcej niż w roku poprzednim. Zdecydowaną większość stanowiły laboratoria medyczne, szpitalne i pozaszpitalne, publiczne i niepubliczne, ale również kontroli poddawały się laboratoria inspekcji sanitarnej i inspekcji weterynaryjnej. Podobnie jak w latach poprzednich, Centralny Ośrodek Badań Jakości w Diagnostyce Mikrobiologicznej, zorganizował dwa rodzaje sprawdzianów: sprawdzian POL- MICRO 2009 przeznaczony dla laboratoriów klinicznych i innych świadczących szeroką diagnostykę mikrobiologiczną oraz sprawdzian POLMICRO 2009/SSE przeznaczony dla pracowni/laboratoriów schorzeń jelitowych. Sprawdzian PO- LMICRO 2009 (ogólny) obejmował trzy tury porównań międzylaboratoryjnych, a sprawdzian POLMICRO 2009/SSE dwie tury kontroli. Tematem niniejszego opracowania jest omówienie specyfiki i rezultatów XVI edycji POLMICRO 2009, z uwzględnieniem dwóch typów zorganizowanych sprawdzianów. Materiał i metody Laboratoria przystępujące do sprawdzianu XVI edycji POLMI- CRO 2009, w ramach każdej tury sprawdzianu, otrzymywały ustalony komputerowo zestaw izolatów zakodowanych wielkimi literami (Tabela I). Do szczepów dołączona była szczegółowa instrukcja postępowania z badanymi szczepami drobnoustrojów, a także informacja dotycząca zasad udzielania odpowiedzi, wnoszenia i rozpatrywania reklamacji. Zadaniem laboratoriów była identyfikacja badanych izolatów do poziomu gatunku oraz określenie lekowrażliwości na wymienione w ankiecie antybiotyki i chemioterapeutyki oraz podanie informacji o wykrytych mechanizmach oporności. Uzyskane wyniki należało przesłać drogą elektroniczną do Centralnego Ośrodka, poprzez wypełnienie ankiety dostęp- Tabela I. Izolaty bakteryjne będące przedmiotem oceny w poszczególnych turach sprawdzianu z rozbiciem na dwa typy programu POLMICRO 2009 (XVI edycja). Tura sprawdzianu 2009 Gatunek drobnoustrojów Nr kolekcji POLMICRO I tura ogólna II tura ogólna III tura ogólna I tura SSE II tura SSE Enterococcus gallinarum Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus faecium Enterococcus casseliflavus Streptococcus pneumoniae Streptococcus pneumoniae Streptococcus pyogenes Streptococcus pyogenes Streptococcus pyogenes Streptococcus agalactiae Streptococcus agalactiae Haemophilus influenzae Haemophilus influenzae Neisseria gonorrhoeae Listeria monocytogenes Escherichia coli ATCC 25922 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Salmonella Enteritidis Salmonella enterica ser. Hadar Escherichia coli Shigella flexneri Escherichia coli ATCC 25922 Salmonella enterica ser. Typhimurium PM-39 PM-28 PM-19 PM-42 PM-146 PM-16 PM-147 PM-148 PM-149 PM-150 PM-44 PM-151 PM-152 PM-63 PM-153 PM-154 PM-22 PM-23 PM-90 PM-129 PM-31 PM-75 PM-22 PM-134 42
E. Stefaniuk i inni nej dla każdego laboratorium, na stronie internetowej Ośrodka www.polmikro.edu.pl. Wyniki lekowrażliwości podlegały ocenie tylko w przypadku prawidłowej identyfikacji badanego szczepu do poziomu gatunku. Ocena popełnianych błędów w oznaczaniu lekowrażliwości oparta była na wcześniej ustalonych kryteriach, które zostaną omówione poniżej. Zastosowana kwalifikacja błędów oparta jest na zaleceniach Centers for Disease Control and Prevention (CDC) w Atlancie. Błędy oznaczania lekowrażliwości dzielimy na trzy kategorie: małe błędy, duże błędy i bardzo duże błędy. Małe błędy polegają na zaliczeniu szczepu średniowrażliwego jako wrażliwy lub oporny, do tego rodzaju błędów zalicza się też uznanie szczepu wrażliwego lub opornego za średniowrażliwy. Błędy duże polegają na podaniu, że szczep wrażliwy jest oporny. Bardzo duży błąd (VME - very major error) oznacza określenie szczepu opornego jako wrażliwy na dany antybiotyk/chemioterapeutyk; w wyniku takiego błędu popełnionego w rutynowej pracy laboratorium, lek może zostać włączony do terapii. Należy bardzo poważnie potraktować pojawienie się bardzo dużego błędu, laboratorium powinno przeprowadzić weryfikację kontroli jakości wykonywanych rutynowo oznaczeń lekowrażliwości. Wystąpienie VME jest najpoważniejszym błędem i laboratorium za taki błąd przyznawana jest ocena negatywna w sprawdzianie. Ankieta zawierała również pytania odnośnie zastosowanych metod diagnostycznych do badania próbek testowych. Wyniki i omówienie SPRAWDZIAN POLMICRO 2009 (edycja ogólna) I tura W I turze POLMICRO 2009 (edycja ogólna) przygotowano pięć zestawów kontrolnych, zawierających po dwa izolaty bakteryjne. Próbki rozesłano do 470 laboratoriów mikrobiologicznych, a do sprawdzianu przystąpiło 458 uczestników. Cztery laboratoria z uwagi na przesłanie odpowiedzi po wyznaczonym terminie nie zostały ocenione; wyniki te zostały jednak dołączone do ogólnych zestawień rezultatów I tury. Negatywny wynik końcowy niniejszej edycji przyznano 78 laboratoriom, co stanowi 17% ogółu laboratoriów przystępujących do sprawdzianu. Znaczne trudności przysporzyła laboratoriom identyfikacja enterokoków do poziomu gatunku. Poprawna identyfikacja do poziomu gatunku, szczególnie w przypadku ciężkich zakażeń enterokokowych (zapalenie wsierdzia, posocznica), stanowi ważną wskazówkę terapeutyczną. Identyfikacja E. casseliflavus i E. gallinarum, które są naturalnie oporne na wankomycynę (obecność genu vanc), pozwala z góry uniknąć stosowania wankomycyny w terapii zakażeń wywołanych przez te gatunki. Ważne jest rozróżnienie gatunków E. faecalis i E. faecium ze względu na ich znaczenie kliniczno-epidemiologiczne i gatunkowo-specyficzne mechanizmy oporności na leki (naturalna oporność E. faecalis na chinupristinę/dalfopristinę). Rodzaj Enterococcus to ziarenkowce Gram-dodatnie, katalazo-ujemne, w preparacie mikroskopowym układają się pojedynczo, parami lub w krótkie łańcuszki. Procedura identyfikacji rodzaju powinna obejmować: 1. morfologię kolonii na podłożu Columbia agar z 5% krwią baranią, 2. barwienie metodą Grama i obserwację mikroskopową komórek, 3. test na obecność katalazy ujemny, 4. zdolność rozkładu eskuliny w obecności 40% soli żółciowych - dodatni, 5. test na rozkładanie pyrrolidonylo-β-naftylamidu (PYR) dodatni i L-leucyno- β-naftyloamidu (LAP). Zdolność hydrolizy PYR posiada ponad 96% enterokoków i wszystkie rozkładają LAP. Wyjątek stanowią gatunki o niewielkim znaczeniu klinicznym: E. cecorum, E. columbae i E. saccharolyticus, które nie posiadają zdolności hydrolizowania PYR, 6. zdolność wzrostu w bulionie o ph 9,6 oraz w bulionie z dodatkiem 6,5% NaCl dodatni, 7. zdolność wzrostu w zakresie temperatur 10-45 C, 8. określenie przynależności do grupy serologicznej D wg Lancefield (antygen D występuje u około 80% szczepów enterokoków). Identyfikacja enterokoków do poziomu gatunki wykorzystuje głównie ich cechy biochemiczne - fermentacja cukrów i alkoholi (rafinoza, sacharoza, mannitol, sorbitol), hydroliza argininy, wykorzystanie pirogronianu z wytworzeniem acetoiny (reakcja VP). Do poziomu gatunku izolaty enterokoków są identyfikowane przy użyciu testów komercyjnych. Komercyjne systemy identyfikacyjne w większości poprawnie identyfikują enterokoki, należy jednak pamiętać, że w niektórych przypadkach konieczne jest zastosowanie testów dodatkowych takich jak: badanie zdolności do redukcji tellurynu potasu podczas wzrostu na podłożu agarowym z wyciągiem mózgowosercowym zawierającym 0,04% telluryn potasu dodatni E.faecalis, (E. faecalis rośnie w postaci czarnych koloni w wyniku inkrustacji komórek bakteryjnych perłowo-czarnymi kryształami zredukowanego do metalicznego telluru tellurynu potasu) test na zdolność do ruchu dodatni E. casseliflavus i E.gallinarum wytwarzanie żółtego barwnika dodatni E. casseliflavus (wg Facklama i Collinsa). Największe rozbieżności dotyczyły szczepu Enterococcus gallinarum PM-39 i Enterococcus casseliflavus PM-146. Szczep E. gallinarum PM-39 otrzymały 182 laboratoria; tylko 134 (73,6%) z nich podały poprawną identyfikację do gatunku. Trzydzieści jeden laboratoriów (17%) określiło szczep jako Enterococcus faecium, dziewięć laboratoriów (5%) oznaczyło szczep jako Enterococcus faecalis i siedem (3,8%) jako E. casseliflavus. Szczep Enterococcus casseliflavus PM-146 otrzymało 187 uczestników programu, poprawną identyfikację uzyskało 164 (87,7%) laboratoriów. Czternaście laboratoriów (7,5%) oznaczyło szczep jako E. faecium, sześć (3,2%) jako E. gal- 43
Ogólnopolski Sprawdzian Wiarygodności Badań Mikrobiologicznych - POLMICRO 2009 linarum, a trzy laboratoria określiły szczep jako E. faecalis. Identyfikacja pozostałych szczepów nie sprawiła laboratoriom większych trudności, E. faecalis PM-28 poprawnie zidentyfikowało 97,2% (tj. 178 spośród 183 laboratoriów); E. faecalis PM-19 97,7% (n=175/179) oraz szczep E. faecium PM-42 97,8% (n=181/185) laboratoriów. Laboratoriom, które popełniły błąd w identyfikacji gatunku E.casseliflavus, oznaczając jako E. gallinarum i odwrotnie, o ile nie wystąpiły dodatkowe błędy w testach lekowrażliwości, identyfikację taką uznano za poprawną. Z klinicznego punktu widzenia dla enterokoków istotne jest oznaczanie jedynie oporności wysokiego stopnia na aminoglikozydy HLAR (ang. high-level aminoglycoside resistance), ze względu na naturalną niską oporność tego rodzaju na tę grupę leków. Oporność wysokiego stopnia na aminoglikozydy dla szczepu E. faecalis PM-28 (n=185) szczep oporny na gentamicynę (krążek 120 µg) strefa 6mm i MIC 1024µg/ml, prawidłowo określiło 85,9% (159) laboratoriów. Szczep E. faecalis PM-19 (n=179) jest oporny na streptomycynę (krążek 300 µg) strefa 6mm i MIC 1024µg/ml, oporności wysokiego stopnia dla tego szczepu nie wykryło 6 laboratoriów (3,4%). Najwięcej bardzo dużych błędów (VME - very major error) odnotowano w oznaczeniu wrażliwości na wankomycynę - aż 44 takie błędy, w tym 23 VME dla E. gallinarum PM-39 i 12 dla E. casseliflavus PM-146, 5 dla E. faecium PM-42 i 4 w oznaczeniu E. faecalis PM-28. Bardzo duży błąd oznacza określenie szczepu opornego jako wrażliwy na dany antybiotyk/chemioterapeutyk, w wyniku takiego błędu w rutynowej pracy laboratorium lek może zostać włączony do terapii. Przyczyną tych błędów była nieprawidłowa identyfikacja do gatunku E. casseliflavus i E. gallinarum, które są naturalnie oporne na wankomycynę fenotyp VanC. Spośród nabytych i rozprzestrzeniających się horyzontalnie fenotypów najlepiej scharakteryzowane i najbardziej powszechne są VanA i VanB. Fenotyp VanA zdefiniowany jest poprzez indukowalną oporność na wysoki poziom wankomycyny i teikoplaniny. Fenotyp VanB cechuje indukowalna oporność wobec wankomycyny na różnym poziomie i wrażliwość na teikoplaninę. Oporność VanA i VanB jest przekazywana między drobnoustrojami za pomocą ruchomych elementów genetycznych takich jak plazmidy i transpozony. Fenotyp VanC jest związany z konstytutywnym, niskim stopniem oporności na wankomycynę i wrażliwością na teikoplaninę. Fenotyp VanD przypomina VanB i charakteryzuje się konstytutywną opornością na wankomycynę i niską opornością na teikoplaninę. Szczepy o fenotypie VanE wykazują niski stopień oporności na wankomycynę i wrażliwość na teikoplaninę. Szczep E. faecalis, zaklasyfikowany jako VanG, wykazuje wrażliwość na glikopeptydy podobną do enterokoków o fenotypie VanE, ale zespół genów warunkujących tę oporność (vang) posiada odmienną organizację niż pozostałe znane loci dla van. II tura W edycji tej przygotowano zestawy kontrolne zawierające po pięć izolatów bakteryjnych, a z uwagi na fakt, że przygotowano drobnoustroje wymagające, próbki rozesłano pocztą kurierską. Szczepy wysłano do 472 laboratoriów mikrobiologicznych, odpowiedź otrzymano od 440 uczestników. Negatywny wynik końcowy niniejszej edycji przyznano 124 laboratoriom, co stanowi 28,2 % ogółu laboratoriów przystępujących do sprawdzianu. Najwięcej nieprawidłowych wyników identyfikacji do gatunku pojawiło w odniesieniu do szczepów - Neisseria gonorrhoeae PM-153 i Listeria monocytogenes PM-154. Szczep N. gonorrhoeae PM-153 otrzymało 288 laboratoriów, zaś poprawnie zidentyfikowało tylko 236 (81,9%). Siedmiu laboratoriom nie udało się ożywić szczepu. Dwanaście laboratoriów (4,2%) zidentyfikowało szczep jako N. meningitidis, sześć zidentyfikowało szczep tylko do rodzaju, pięć laboratoriów określiło szczep jako L. monocytogenes, trzy laboratoria oznaczyły szczep jako Staphylococcus hominis, po dwa laboratoria oznaczyły szczep jako N. sicca i N. cinerea. Pozostałe czternaście laboratoriów błędnie identyfikowało szczep jako N. mucosa, N. elongata, M. catarrrhalis, Haemophilus spp., H. influenzae, H. parainfluenzae, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecium, Enterococcus durans, Micrococcus luteus, Aerococcus urinae, Streptococcus z gr. F i beztlenowe ziarniaki (G-). N. gonorrhoeae dwoinka rzeżączki, gonokok gramujemny ziarenkowiec o dużych wymaganiach odżywczych, wrażliwy na niskie temperatury, najlepiej rośnie w atmosferze 5% CO 2 w temperaturze 35 37o C. Po 24-48 godzinach wyrasta w postaci drobnych szarobiałych kolonii, opalizujących, błyszczących i wypukłych. Cechą rodzaju jest wytwarzanie oksydazy i katalazy (wyjątek - N. elongata jest katalazoujemna). Identyfikację gatunków z rodzaju Neisseria przeprowadza się w oparciu o zdolność rozkładu cukrów: glukozy, laktozy maltozy. Gonokok rozkłada tylko glukozę, meningokok rozkłada glukozę i maltozę. N. cinerea nie rozkłada cukrów. N. sicca i N. mucosa rosną na zwykłych podłożach w postaci żółtawych kolonii rozkładają glukozę, maltozę, fruktozę. Moraxella catarrhalis (dawniej N. catarrhalis, Branchamella catarrhalis) nie rozkłada cukrów, ale wytwarza DNazę. Listeria monocytogenes gramdodatnia pałeczka, rośnie na zwykłych podłożach, posiew na podłoże agarowe z krwią baranią pozwala zaobserwować β-hemolizę pod usuniętą kolonią. Wykrycie hemolizy jest istotne do rozróżnienia L. monocytogenes od innych niepatogennych gatunków Listeria - L. innocua. Szeroką strefę hemolizy typu β można zaobserwować wokół kolonii L. ivanovii. Pałeczki Listeria można hodować w warunkach tlenowych lub bez obecności tlenu, w atmosferze 5% CO 2 ; wytwarzają katalazę, rosną w szerokim zakresie temperatur (1-45 o C), co jest wykorzystywane w diagnostyce listeriozy. Pałeczki te są ruchliwe w temperaturze pokojowej (20-25 o C). Szczep L. monocytogenes PM-154 otrzymały 152 laboratoria, poprawną identyfikację do gatunku uzyskało 134 (88,2%) uczestników sprawdzianu. Dziesięć laboratoriów podało identyfikację do rodzaju, trzy laboratoria oznaczyły szczep 44
E. Stefaniuk i inni jako N. gonorrhoeae, a dwa jako N. meningitidis, pojedyncze laboratoria określiły szczep jako Listeria innocua, N. sicca i jedno jako Enterococcus faecalis. Kolejnym szczepem, który sprawił laboratoriom trudności to Haemophilus influenzae PM-152. Szczep otrzymało 286 uczestników programu, poprawną identyfikację uzyskało 279 (97,6%) laboratoriów. Dwóm laboratoriom nie udało się ożywić szczepu. Trzy laboratoria (1%) oznaczyły szczep jako H. parainfluenzae, jedno jako Haemophilus spp, a jedno jako Streptococcus agalactiae. Identyfikacja pozostałych szczepów nie sprawiła laboratoriom większych trudności. Streptococcus pneumoniae PM- 16 poprawnie zidentyfikowało 99% (tj. 294 spośród 297 laboratoriów); 99,3% poprawnych identyfikacji uzyskano dla pozostałych przesłanych w ramach sprawdzianu szczepów: S. pneumoniae PM-147 (n=146/147), S. pyogenes PM-149 (n=151/152), S. pyogenes PM-150 (n=142/143), S. agalactiae PM-151 (n=151/152), S. agalactiae PM-44 (n=284/286), H. influenzae PM-63 (n=153/154). Najwięcej bardzo dużych błędów odnotowano w oznaczeniu wrażliwości szczepu H. influenzae PM-63 na amoksycylinę z kwasem klawulanowym - 24 takie błędy, na ampicylinę 18 błędów i 6 błędów w oznaczeniu wrażliwości na tetracyklinę. Czternaście laboratoriów określiło niepoprawnie szczep PM- 63 jako β laktamazo dodatni. H. influenzae jest typowym komensalem górnych dróg oddechowych ludzi, zakażenia wywoływane przez te pałeczki to głównie zakażenia dróg oddechowych, zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych i zapalenie nagłośni. Zakażenia inwazyjne powodują głównie szczepy otoczkowe serotyp Hib, za zakażenia nieinwazyjne odpowiedzialne są w większości szczepy bezotoczkowe. W terapii stosuje się penicyliny z inhibitorami β laktamaz. Oznaczenie wrażliwości H. influenzae na leki jest istotne z powodów epidemiologicznych. Antybiogram rozszerzony należy stosować w oznaczeniach lekowrażliwości izolatów pochodzących z płynu mózgowordzeniowego i krwi. W oznaczeniu lekowrażliwości H. influenzae PM-152 laboratoria popełniły: 17 VME dla tetracykliny i 8 dla ampicyliny. Natomiast dla amoksycyliny z kwasem klawulanowym aż 36 dużych błędów (ME - major error). Siedemnaście laboratoriów nie wykryło wytwarzania β laktamazy. W związku z dużą liczbą VME dla tetracykliny w obydwu szczepach H. influenzae PM-63 i PM-152, laboratoriom, które nie popełniły innych znaczących błędów postanowiono w ocenie końcowej nie uwzględniać tego błędu. Tetracykliny są lekami pierwszego rzutu w zakażeniach rzadziej spotykanych (np. zakażenia Borrelia, Mycoplasma, Chlamydophila); nie powinny być stosowane w terapii empirycznej i nie ma wskazań do ich stosowania w rutynowym leczeniu powszechnie spotykanych zakażeń. W przypadku ciężkich zakażeń, gdy nie ma innej opcji terapeutycznej tetracykliny mogą mieć zastosowanie. Oporność na ampicylinę u H. influenzae jest najczęściej związana z produkcją β laktamazy, niezbędne jest oznaczenie wytwarzania β laktamaz u szczepów niewrażliwych na ampicylinę. Szczepy β laktamazo ujemne oporne na ampicylinę występują coraz częściej, są to szczepy BLNAR (ang. β-lactamase-negative, ampicillin-resistant) powinny być traktowane, pomimo ich wrażliwości in vitro, jako klinicznie oporne na ampicylinę, amoksycylinę, amoksycylinę z kw. klawulanowym, ampicylinę z sulbaktamem, cefuroksym, cefaklor, cefprozil, cefetamet i piperacylinę z tazobaktamem. Wrażliwość na oksacylinę Streptococcus pneumoniae oznacza wrażliwość na penicylinę, aminopenicyliny, cefalosporyny i karbapenemy. Na podstawie wielkości strefy zahamowania wzrostu wokół krążka z oksacyliną nie można podać interpretacji średniowrażliwy lub oporny na penicylinę, wtedy należy oznaczyć MIC penicyliny, a dla szczepów z zakażeń inwazyjnych lub szczepów z obniżoną wrażliwością na penicylinę należy koniecznie oznaczać MIC penicyliny, cefotaksymu lub ceftriaksonu. W przypadku izolatów z płynu mózgowo-rdzeniowego należy dodatkowo oznaczyć MIC meropenemu, wankomycyny, rifampicyny i chloramfenikolu. W oznaczeniu lekowrażliwości szczepu S. pneumoniae PM-16 o obniżonej wrażliwości na penicylinę MIC 4 µg/ml, czternaście laboratoriów (4,7%) nie określiło wartości MIC dla penicyliny, a siedemnaście laboratoriów (5,7%) popełniło bardzo duży błąd dla cefotaksymu i piętnaście (5%) dla ceftriaksonu podając, że szczep jest wrażliwy. Sześć laboratoriów określiło szczep jako wrażliwy na trimetoprim/sulfametoksazol popełniając VME. Dla szczepu S. pneumoniae PM-147 odnotowano tylko dwa bardzo duże błędy w oznaczeniu wrażliwości na trimetoprim/sulfametoksazol. Pojawienie się znacznej liczby dużych i małych błędów dla penicyliny w oznaczeniach obydwu szczepów S. pneumoniae PM-16 i PM-147 prawdopodobnie zostało spowodowane różnicą w interpretacji klinicznej wyników oznaczania MIC. Przesłane do laboratoriów próbki miały być z założenia traktowane jak uzyskane z posiewu krwi, a więc zakażenie inwazyjne. Zakażenia szczepami pneumokoków mogą przebiegać z zajęciem układu nerwowego lub nie i w przypadku zakażenia bez zajęcia ośrodkowego układu nerwowego możliwe jest zastosowanie w leczeniu wyższych dawek penicyliny. W zależności od materiału, z jakiego izolat pochodzi i rodzaju zakażenia, obowiązują różne wartości graniczne. Interpretacja wartości MIC dla penicyliny wg CLSI (2009): penicylina (doustna penicylina V) MIC 0,06 µg/ml wrażliwy, MIC 0,12 1 µg/ml średniowrażliwy, MIC 2 µg/ml oporny; penicylina parenteralna dla izolatów z innych materiałów niż płyn mózgowo-rdzeniowy, w zakażeniach bez zajęcia ośrodkowego układu nerwowego MIC 2 µg/ml wrażliwy, MIC 4 µg/ml średniowrażliwy, MIC 8 µg/ml oporny; penicylina parenteralna dla izolatów z płynu mózgowordzeniowego MIC 0,06 µg/ml wrażliwy, MIC 0,12 µg/ ml oporny. W oznaczeniu wrażliwości na tetracyklinę szczepu S. agalactiae PM-44 odnotowano siedem dużych błędów i 24 małe błędy, natomiast dla klindamycyny pięć, erytromycyny i ceftriaksonu po cztery duże błędy. Wśród pozostałych gatun- 45
Ogólnopolski Sprawdzian Wiarygodności Badań Mikrobiologicznych - POLMICRO 2009 ków rozesłanych w ramach sprawdzianu pojawiła się niewielka liczba błędów w oznaczeniu lekowrażliwości i tak, bardzo duży błąd dla tetracykliny dla szczepu S. agalactiae PM-151 popełniło pięć laboratoriów i dwa laboratoria dla szczepu S. pyogenes PM-150. Pojawienie się dużej ilości błędów dla tetracykliny w różnych szczepach przesłanych w ramach II tury POLMICRO 2009 powinno było skłonić laboratoria do weryfikacji procedur kontroli wewnętrznej oznaczenia lekowrażliwości. Zamieszczony poniżej wykres przedstawia liczbę wszystkich błędów w oznaczeniu lekowrażliwości dla poszczególnych szczepów. III tura W tej turze sprawdzianu przygotowano zestawy kontrolne zawierające po jednym izolacie bakteryjnym. Szczepy wysłano do 460 laboratoriów mikrobiologicznych, odpowiedź otrzymano od 450 uczestników. Laboratoria otrzymały szczepy wzorcowe z amerykańskiej kolekcji kultur typowych ATCC: Escherichia coli ATCC 25922 PM-22, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 PM-23. Szczep E. coli ATCC 25922 służy do kontroli jakości testów lekowrażliwości Gram-ujemnych drobnoustrojów niewymagających, zarówno metody dyfuzyjno-krążkowej, jak i oznaczaniu najmniejszych stężeń hamujących MIC. Służy także do kontroli jakości oznaczenia ESBL jako kontrola negatywna. Szczep P. aeruginosa ATCC 27853 służy do kontroli jakości testów lekowrażliwości w metodach dyfuzyjno-krążkowej i rozcienczeniowej dla Gram-ujemnych pałeczek niefermentujących. Zawiera indukowalną β-laktamazę AmpC. Służy także do kontroli jakości prawidłowej zawartości jonów Ca 2+ i Mg 2+ w podłożu Mueller Hinton (MHA). Założeniem omawianej edycji było sprawdzenie jak laboratoria biorące udział w sprawdzianie POLMICRO kontrolują rutynowo jakość wykonywanych w laboratorium oznaczeń. Identyfikacja nie sprawiła laboratoriom żadnych trudności. Z uwagi na wrażliwość na antybiotyki i chemioterapeutyki szczepów przesłanych do laboratoriów w ocenie nie była brana pod uwagę interpretacja. Postanowiono sprawdzić, jak uzyskiwane przez laboratoria wielkości stref i wartości MIC mieszczą się w zakresach referencyjnych (M100-S19, CLSI, 2009). Wyniki uzyskane przez laboratoria metodą dyfuzyjno-krążkową znajdują się w tabeli II, natomiast wyniki metod rozcienczeniowych w tabeli III. W wynikach uzyskanych metodą dyfuzyjno-krążkową dla większości antybiotyków odsetek prawidłowych wartości sięga od 67% do 98% dla obydwu szczepów, natomiast znaczne różnice między szczepami zaobserwowano w wynikach uzyskiwanych metodami rozcieńczeniowymi. Procent wartości mieszczących się w zakresach referencyjnych dla P. aeruginosa wynosi od 51% do 81%, a dla E. coli od 3,9% do 71,4%. Sytuacja ta była tym bardziej zadziwiająca, że rozbieżności dotyczyły szczepów wzorcowych. Czy wyniki dla szczepów wzorcowych posiadanych w laboratorium były również niesatysfakcjonujące? Tak mała liczba prawidłowych wyników oznaczeń wartości MIC mogła wynikać z: a) braku właściwej kontroli jakości testów lekowrażliwości, b) braku umiejętności odczytu wartości MIC metodą pasków Wykres 1. Liczba laboratoriów, które popełniły błędy w interpretacji lekowrażliwości poszczególnych izolatów II tura POLMICRO 2009. me (ang. minor error), mały błąd ME (ang. major error), duży błąd VME (ang. very major error), bardzo duży błąd 46
E. Stefaniuk i inni Tabela II. Wyniki uzyskane przez laboratoria metodą dyfuzyjno-krążkową (III tura edycji ogólnej POLMICRO 2009). Antybiotyk Escherichia coli ATCC 25922 (n=226) Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 (n=224) Z (mm) l w % Z (mm) l w % Ampicylina 16-22 190 179 94,2% - 39 - - Tobramycyna 18-26 181 170 93,9% 19-25 194 185 95,4% Amikacyna 19-26 191 181 94,8% 18-26 201 191 95,0% Piperacylina/tazobactam 24-30 186 178 95,7% 25-33 199 192 96,5% Cefepim 31-37 192 155 80,7% 24-30 196 178 90,8% Gentamicyna 19-26 191 168 88,0% 16-21 201 180 89,6% Imipenem 26-32 191 173 90,6% 20-28 201 197 98,0% Amoksycylina/klawulanian 18-24 199 191 96,0% - 51 - - Trimetoprim/sulfametoksazol 23-29 191 185 96,9% - 39 - - Meropenem 28-34 191 159 83,2% 27-33 194 130 67,0% Tikarcylina 24-30 175 155 88,6% 21-27 183 163 89,1% Piperacylina 24-30 188 181 96,3% 25-33 198 186 93,9% Cefuroksym 20-26 197 191 97,0% - 39 - - Ciprofloksacyna 30-40 190 177 93,2% 25-33 199 190 95,5% Cefotaksym 29-35 197 184 93,4% 18-22 183 151 82,5% Ceftazydym 25-32 196 188 95,9% 22-29 201 191 95,0% Tabela III. Wyniki uzyskane przez laboratoria metodą rozcienczeniową (III tura edycji ogólnej POLMICRO 2009). Antybiotyk Escherichia coli ATCC 25922 (n=226) Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 (n=224) z (µg/ml) l w % z (µg/ml) l w % Ampicylina 2-8 77 55 71,4% - - - Tobramycyna 0,25-1 63 33 52,4% 0,25-1 47 24 51,1% Amikacyna 0,5-4 76 46 60,5% 1-4 55 31 56,4% Piperacylina/tazobactam 1-4 82 43 52,4% 1-8 62 43 69,4% Cefepim 0,015-0,12 76 3 3,9% 1-8 65 51 78,5% Gentamicyna 0,25-1 77 45 58,4% 0,5-2 59 36 61,0% Imipenem 0,06-0,25 83 16 19,3% 1-4 80 65 81,3% Amoksycylina/kwas klawulanowy 2-8 69 47 68,1% - - - - Trimetoprim/sulfametoksazol 0,5 69 26 37,7% - - - - Meropenem 0,008-0,06 77 12 15,6% 0,25-1 77 51 66,2% Tikarcylina 4-16 40 17 42,5% 8-32 35 21 60,0% Piperacylina 1-4 57 30 52,6% 1-8 45 31 68,9% Cefuroksym 2-8 61 38 62,3% - - - - Ciprofloksacyna 0,004-0,015 83 6 7,2% 0,25-1 62 39 62,9% Cefotaksym 0,03-0,12 79 5 6,3% 8-32 57 41 71,9% Ceftazydym 0,06-0,5 81 12 14,8% 1-4 66 46 69,7% n liczba laboratoriów, które otrzymały dany szczep z zakres (mm) lub (µg/ml) l liczba laboratoriów, które podały strefę zahamowania wzrostu lub wartość MIC w liczba laboratoriów, których oznaczenie mieściło się w zakresie referencyjnym % wyniki prawidłowe gradientowych (E-test, MICE). Wykresy 2-7 zamieszczone poniżej przedstawiają rozrzuty wielkości stref zahamowania wzrostu i rozkłady wartości MIC wybranych antybiotyków. Kolorem czerwonym zostały zaznaczone słupki z wartościami spoza zakresu referencyjnego. Kolor niebieski oznacza wartość mieszcząca się w zakresie. Zadaniem uczestników było też podanie informacji, jakie szczepy wzorcowe zostały zastosowane w kontroli jakości; laboratoria miały możliwość wyboru dwóch szczepów wzor- 47
Ogólnopolski Sprawdzian Wiarygodności Badań Mikrobiologicznych - POLMICRO 2009 Wykres 2 E. coli ATCC 25922 /cefepim/ strefa. Wykres 3 E. coli ATCC 25922 /cefepim/ MIC. Wykres 4 P.aeruginosa ATCC 27853 /meropenem/ strefa. Wykres 5 P.aeruginosa ATCC 27853 /meropenem/mic. Wykres 6 E. coli ATCC 25922 /ciprofloksacyna/mic. Wykres 7 E. coli ATCC 25922 /cefotaksym/ MIC. Wykresy 2-7. Rozrzuty wielkości stref zahamowania wzrostu (mm) i rozkłady wartości MIC (µg/ml) wybranych antybiotyków dla szczepów wzorcowych (wartości podawane przez laboratoria) III tura POLMICRO 2009 (edycja ogólna). cowych z listy dostępnej w ankiecie lub możliwość zapisania innych niż wymienione. W tabeli IV zamieszczone są deklarowane przez laboratoria szczepy wzorcowe. Zgodnie z rekomendacjami laboratorium powinno w kontroli jakości dla Enterobacteriaceae stosować szczepy wzorcowe E. coli ATCC 25922 i E. coli ATCC 35218. Dla szczepów z rodzajów Pseudomonas i Acinetobacter także szczep P. aeruginosa ATCC 27853. Podsumowując, łącznie 68% (306) laboratoriów spośród 450 wszystkich uczestniczących w omawianym sprawdzia- 48
E. Stefaniuk i inni Tabela IV. Szczepy wzorcowe zastosowane przez laboratoria w kontroli jakości - III tura POLMICRO 2009 (edycja ogólna). E. coli ATCC 25922 (n=226) P. aeruginosa ATCC 27853 (n=224) I-szy szczep wzorcowy: E. coli ATCC 25922-220 laboratoriów (97,4%), E. coli ATCC 35218 3 laboratoria (1,3%), Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 jedno laboratorium (0,5%), Dwa laboratoria (0,9%) nie zastosowały szczepu wzorcowego. II szczep wzorcowy: E. coli ATCC 35218 143 laboratoria (63,3%), K. pneumoniae ATCC 700603 31 laboratoriów (13,7%), P. aeruginosa ATCC 27853 12 laboratoriów (5,3%), Staphylococcus aureus ATCC 25923 7 laboratoriów (3,1%), E. coli ATCC 25922-6 laboratoriów (2,7%) S. aureus ATCC 29213 i K. pneumoniae MIKROBANK 10.021 po 1 laboratorium (0,5%). Dwadzieścia pięć laboratoriów (11%) nie zastosowało drugiego szczepu wzorcowego. I-szy szczep wzorcowy: P. aeruginosa ATCC 27853 132 laboratoria (58,9%), E. coli ATCC 25922 86 laboratoriów (38,4%), P. aeruginosa MIKROBANK 13.001 2 laboratoria (0,9%), E. coli ATCC 35218 1 laboratorium (0,45%). Trzy laboratoria (1,3%) nie zastosowały szczepu wzorcowego. II szczep wzorcowy: E. coli ATCC 25922-74 laboratoria (33%), P. aeruginosa ATCC 27853 60 laboratoriów (26,8%), E. coli ATCC 35218 52 laboratoria (23,2%), K. pneumoniae ATCC 700603 6 laboratoriów (2,7%), P. aeruginosa MIKROBANK 13.001 2 laboratoria (0,9%) S. aureus ATCC 25923 i Enterobacter cloaceae MIKROBANK 10.011 po 1 laboratorium Dwadzieścia siedem laboratoriów (12,1%) nie zastosowało drugiego szczepu wzorcowego. nie zadeklarowało stosowanie szczepu E. coli ATCC 25922 i 28,9% (130) szczepu P. aeruginosa ATCC 27853 jako pierwszy szczep wzorcowy w kontroli jakości. Tylko 199 laboratoriów (44,2%) na 450 zadeklarowało stosowanie szczepu E. coli ATCC 35218, wynika z tego, że ponad połowa laboratoriów nie kontroluje połączeń antybiotyków β-laktamowych z inhibitorami β-laktamaz. Szczep E. coli ATCC 35218 służy do kontroli jakości krążków z antybiotykami β-laktamowych w połączeniu z inhibitorami β-laktamaz kwas klawulanowy, sulbaktam, tazobaktam. Każde laboratorium powinno mieć taki szczep w swojej kolekcji do prowadzenia pełnej kontroli jakości oznaczeń wykonywanych rutynowo. Uczestnicy zastosowali w kontroli jakości oznaczeń szereg innych szczepów wzorcowych takich jak: K. pneumoniae ATCC 700603, K. pneumoniae MIKROBANK 10.021, Enterobacter cloaceae MIKROBANK 10.011, P. aeruginosa MIKROBANK 13.001. Szczepy te laboratorium powinno stosować do kontroli jakości wykrywania mechanizmów oporności. Pierwsze trzy szczepy służą do kontroli jakości oznaczania ESBL (kontrola pozytywna), natomiast czwarty szczep służy do kontroli jakości oznaczania MBL (kontrola pozytywna). Z uzyskanych w sprawdzianie danych wynika, że blisko 97% laboratoriów deklaruje przeprowadzanie kontroli jakości przy użyciu jednego szczepu wzorcowego, a tylko około 3% laboratoriów nie stosuje, bądź używa nieodpowiednie szczepy wzorcowe do kontroli jakości oznaczeń. Około 45% laboratoriów przeprowadza kontrolę jakości przy użyciu dwóch odpowiednich szczepów referencyjnych. Liczby te nie są zadowalające, wyniki III tury POLMICRO 2009 odzwierciedlają słabe strony i brak nadzoru nad kontrolą jakości wykonywanych przez laboratoria oznaczeń i zdają się tłumaczyć przyczyny występujących niepowodzeń laboratoriów w kolejnych turach sprawdzianu. Jako kryterium pozytywnej oceny niniejszej tury sprawdzianu przyjęto prawidłową identyfikację badanych szczepów. Natomiast rozbieżności w wielkości stref i wartościach MIC potraktowano edukacyjnie z nadzieją, że każde laboratorium wnikliwie przeanalizuje swoje wyniki pod kątem popełnionych błędów. Pozytywny wynik III tury sprawdzianu POLMI- CRO 2009 uzyskały wszystkie laboratoria biorące udział w programie. SPRAWDZIAN POLMICRO 2009/SSE (edycja dla laboratoriów Państwowej Inspekcji Sanitarnej) I tura/sse Do sprawdzianu przystąpiły 63 laboratoria mikrobiologiczne stacji sanitarno-epidemiologicznych, z których każde otrzymało po dwa izolaty bakteryjne zakodowane jako A i B. Dwadzieścia pięć laboratoriów poddało kontroli wyłącznie etap identyfikacji. Pozytywny wynik I tury sprawdzianu POLMICRO 2009/SSE uzyskało 50 laboratoriów biorących udział w programie. Szczep Salmonella enterica ser. Hadar PM-129 otrzymały wszystkie laboratoria. Za poprawną uznawano identyfikację Salmonella z grupy C. Wyniki identyfikacji przedstawiały się następująco: Salmonella Hadar (n=47), Salmonella z gr CO (n=7), S. enterica z grupy C2 (n=4) oraz S. Wippra (n=2) i Salmonella Molade (n=1), Salmonella spp (n=1). Rozbieżności dotyczyły wykrywania drugiej fazy antygenu rzęskowego. Grupy O:6,8 (dawna C2) i O:8 (dawna C3), różnią się tylko obecnością lub brakiem faktora O:6, zostały połączone w jedną grupę O:8 według Taksonomii i nazewnictwa rodzaju Salmonella Światowej Organizacji Zdrowia. Istotne znaczenie ma poddawanie kontroli jakości stosowanych surowic diagnostycznych. W oznaczaniu lekowrażliwości szczepu PM-129 najwięcej błędów wystąpiło w przypadku oznaczenia lekowrażliwości amoksycyliny z kwasem klawulanowym oraz ciprofloksa- 49
Ogólnopolski Sprawdzian Wiarygodności Badań Mikrobiologicznych - POLMICRO 2009 cyny. Niektóre laboratoria zmieniały interpretację kliniczną dla ciprofloksacyny na oporny, jednakże nie ma wytycznych zalecających dokonywanie takiej zmiany. Ze względu na możliwe niepowodzenie terapeutyczne przy zastosowaniu fluorochinolonów wobec szczepów Salmonella wrażliwych na fluorochinolony, a opornych na kwas nalidyksowy, laboratoriom nie uznawano takiego postępowania za błąd. Dla szczepu Escherichia coli PM-31 trzy laboratoria nieprawidłowo oznaczyły wytwarzanie ESBL Osiem laboratoriów zmieniało interpretację kliniczną dla amoksycyliny z kwasem klawulanowym. Zgodnie z zaleceniami szczepy wytwarzające ESBL należy traktować jako szczepy oporne na wszystkie penicyliny (bez połączeń z inhibitorami), cefalosporyny (z wyjątkiem cefamycyn) i aztreonam. II tura/sse W edycji tej przygotowano trzy zestawy kontrolne, zawierające jeden izolat bakteryjny spośród wymienionych: Shigella flexneri PM-75, Escherichia coli ATCC 25922 PM-22, Salmonella enterica ser. Typhimurium PM-134. Do sprawdzianu przystąpiło 79 laboratoriów mikrobiologicznych stacji sanitarno-epidemiologicznych. Trzydzieści dziewięć laboratoriów poddało kontroli wyłącznie etap identyfikacji. Pozytywny wynik II tury sprawdzianu POLMICRO 2009/SSE uzyskały wszystkie laboratoria biorące udział w programie. Założeniem omawianej edycji było sprawdzenie, jak laboratoria biorące udział w sprawdzianie POLMICRO kontrolują rutynowo jakość wykonywanych w laboratorium oznaczeń. Poprawną identyfikację szczepów wykonały wszystkie laboratoria. Oznaczenie lekowrażliwości przesłanych szczepów nie przysporzyło uczestnikom trudności. Wśród uczestników, którzy otrzymali szczep E. coli PM- 22 (n=25) postanowiono sprawdzić, jak uzyskiwane przez laboratoria wielkości stref i wartości MIC mieszczą się w zakresach referencyjnych (M100-S19, CLSI, 2009). Wyniki uzyskane przez laboratoria metodą dyfuzyjno-krążkową znajdują się w tabeli V. Żadne laboratorium nie oznaczyło wartości MIC. W wynikach uzyskanych metodą dyfuzyjnokrążkową dla większości antybiotyków odsetek prawidłowych wartości sięgał od 72% do 92%. Sytuacja ta była niepokojąca, gdyż dotyczyła wyników szczepów wzorcowych. Czy wyniki dla szczepów wzorcowych posiadanych w laboratorium były kontrolowane równolegle ze szczepem przesłanym w Tabela V. Wyniki uzyskane przez laboratoria metodą dyfuzyjno-krążkową (POLMICRO 2009/SSE II tura). Strefa zahamowania E. coli PM-22 Antybiotyk Z L W % Ampicylina 16-22 25 18 72,0% Amikacyna 19-26 24 21 87,5% Cefepim 31-37 22 17 77,3% Gentamicyna 19-26 25 20 80,0% Imipenem 26-32 25 21 84,0% Amoksycylina/kwas klawulanowy 18-24 25 22 88,0% Trimetoprim/sulfametoksazol 23-29 25 22 88,0% Meropenem 28-34 21 18 85,7% Cefuroksym 20-26 24 22 91,7% Cefotaksym 29-35 25 23 92,0% Ceftazydym 25-32 25 21 84,0% Z - zakres referencyjny (mm) L - liczba laboratoriów, które podały strefę zahamowania wzrostu W - liczba laboratoriów, których oznaczenie mieściło się w zakresie referencyjnym Tabela VI. Szczepy wzorcowe zastosowane przez laboratoria w kontroli jakości (POLMICRO 2009/SSE II tura). Szczep wzorcowy Liczba laboratoriów Nie stosowano 8 Staphylococcus aureus ATCC 25923 23 Escherichia coli ATCC 25922 49 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 21 Escherichia coli ATCC 35218 30 Enterococcus faecalis ATCC 29212 6 Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 18 Inny niż wymienione 2 ramach sprawdzianu? Czy laboratorium odnotowało jakieś rozbieżności? Każde laboratorium zostało zobowiązane do wnikliwego przeanalizowania uzyskanych wyników pod kątem popełnionych błędów. Zadaniem uczestników było też podanie informacji, jakie szczepy wzorcowe zostały zastosowane w kontroli jakości; laboratoria miały możliwość wyboru szczepów wzorcowych z listy dostępnej w ankiecie. W tabeli VI zamieszczone są deklarowane przez laboratoria szczepy wzorcowe. Zgodnie z rekomendacjami laboratorium powinno w kontroli jakości dla Enterobacteriaceae stosować szczepy wzorcowe E. coli ATCC 25922 i E. coli ATCC 35218. Podsumowując łącznie 62% (49) laboratoriów spośród 79 50
E. Stefaniuk i inni Tabela VII. Zestawienie laboratoriów uczestniczących w XVI edycji POLMICRO 2009. Tura sprawdzianu 2009 Liczba laboratoriów, które otrzymały badane izolaty Liczba laboratoriów, które odesłały odpowiedzi Liczba laboratoriów, które uzyskały ocenę pozytywną POLMICRO 2009/I 470 458 380 POLMICRO 2009/II 472 440 331 POLMICRO 2009/III 460 450 450 POLMICRO 2009 SSE/I 63 63 51 POLMICRO 2009 SSE/II 79 79 79 wszystkich uczestniczących w omawianym sprawdzianie zadeklarowało stosowanie szczepu E. coli ATCC 25922. Szczep E. coli ATCC 25922 służy do kontroli jakości testów lekowrażliwości Gram-ujemnych drobnoustrojów niewymagających, zarówno metody dyfuzyjno-krążkowej, jak i oznaczania najmniejszych stężeń hamujących MIC. Służy także do kontroli jakości oznaczenia ESBL jako kontrola negatywna. Tylko 30 laboratoriów (38%) na 79 zadeklarowało stosowanie szczepu E. coli ATCC 35218, wynika z tego, że ponad 60% laboratoriów nie kontrolowało połączeń krążków antybiotyków β-laktamowych z inhibitorami β-laktamaz. Szczep E. coli ATCC 35218 służy do kontroli jakości krążków z antybiotykami β-laktamowych w połączeniu z inhibitorami β-laktamaz kwas klawulanowy, sulbaktam, tazobaktam. Każde laboratorium powinno mieć taki szczep w swojej kolekcji do prowadzenia pełnej kontroli jakości oznaczeń wykonywanych rutynowo. Szczep P. aeruginosa ATCC 27853 służy do kontroli jakości testów lekowrażliwości w metodach dyfuzyjno-krążkowej i rozcienczeniowej dla Gram-ujemnych pałeczek niefermentujących. Zawiera indukowalną β-laktamazę AmpC. Służy także do kontroli jakości prawidłowej zawartości jonów Ca 2+ i Mg 2+ w podłożu Mueller Hinton (MHA). Szczep K. pneumoniae ATCC 700603 laboratorium powinno stosować do kontroli jakości oznaczania ESBL (kontrola pozytywna). S. aureus ATCC 25923 szczep zalecany do kontroli jakości oznaczania lekowrażliwości w metodzie dyfuzyjno-krążkowej Gram-dodatnich drobnoustrojów niewymagających. Szczep E. faecalis ATCC 29212 zalecany do kontroli jakości oznaczania MIC dla Enterococcus spp, oznaczania fenotypu HLAR w metodzie dyfuzyjno-krążkowej i przeglądowej oraz w metodzie przeglądowej z wankomycyną w podłożu. Służy także do oznaczania zawartości tyminy i tymidyny w podłożu. Podsumowanie Ogólnopolski Sprawdzian Wiarygodności Badań Mikrobiologicznych POLMICRO pełni przede wszystkim rolę edukacyjną. Założeniem organizatora Sprawdzianu jest promowanie aktualnych standardów diagnostyki mikrobiologicznej i ujednolicanie metod badawczych w polskich laboratoriach medycznych. Wyniki badań międzylaboratoryjnych pokazują niedoskonałości wewnętrznej kontroli jakości w tych laboratoriach. Mimo to, z roku na rok obserwowany jest postęp uczestników Programu POLMICRO w oznaczaniu lekowrażliwości drobnoustrojów, wykrywaniu i interpretacji mechanizmów oporności na leki. Uwagę zwraca również fakt wprowadzania do rutynowej diagnostyki nowoczesnych, szybkich metod badawczych takich jak: podłoża chromogenne, testy komercyjne do identyfikacji i lekowrażliwości, systemy automatyczne. W tabeli VII przedstawiono końcowe zestawienie dotyczące liczby laboratoriów, które w roku 2009 wzięły udział w ogólnej edycji programu POLMICRO oraz edycji dla laboratoriów PIS oraz liczby laboratoriów, których odpowiedzi uznano za pozytywne. Świadectwa uczestnictwa i uzyskania bardzo dobrych wyników w Zewnątrzlaboratoryjnym Ogólnopolskim Sprawdzianie Jakości Badań w Mikrobiologii w 2009 roku w edycji ogólnej otrzymało 297 laboratoriów (64,8 %) i były to tylko te laboratoria, które uzyskały pozytywne wyniki we wszystkich turach sprawdzianu POLMICRO 2009. Świadectwa uczestnictwa i uzyskania bardzo dobrych wyników w Zewnątrzlaboratoryjnym Ogólnopolskim Sprawdzianie Jakości Badań w Mikrobiologii dla laboratoriów Państwowej Inspekcji Sanitarnej w 2009 roku otrzymało 51 laboratoriów, które uzyskały dobre wyniki w dwóch turach sprawdzianu POLMI- CRO SSE/2009. Od zeszłego roku przyznawane laboratoriom świadectwa posiadają indywidualne numery i zachowują ważność w terminie jednego roku od dnia wystawienia. Piśmiennictwo: 1. Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; Nineteenth informational supplement: M100-S19. CLSI, Villanova PA. 2009 2. Clinical and Laboratory Standards Institute. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically; Approved standard - Eighth Edition: M7-A8. CLSI, Villanova, PA. 2009. 3. Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests; Approved Standard - Tenth Edition M2-A10. CLSI, Villanova, PA. 2009. 4. Grimont Patrick A.D., Weill Francois-Xavier; Antigenic formule of the Salmonella serovars, WHO Collaborating Centre for Refference and Research on Salmonella, 2007, 9 th edition. 5. Hryniewicz W. i wsp. Rekomendacje doboru testów do oznaczania wrażliwości bakterii na antybiotyki i chemioterapeutyki. Narodowy Instytut Leków, 2009. 6. Irving W., Boswell T., Ala Aldeen D.; Mikrobiologia Medyczna. Krótkie wykłady, PWN, 2008 51
Ogólnopolski Sprawdzian Wiarygodności Badań Mikrobiologicznych - POLMICRO 2009 Adres Autorów: Centralny Ośrodek Badań Jakości w Diagnostyce Laboratoryjnej Ul. Chełmska 30/34 00-725 Warszawa tel.: (22) 8415834 faks: (22) 8412949 e-mail: polmicro@cls.edu.pl (Praca wpłynęła do Redakcji: 2010-04-19) (Praca przekazana do opublikowania: 2010-04-20) 52