Trichoderma spp. as a seed dressing bioproduct against damping-off seedlings of vegetables crops

PROGRESS IN PLANT PROTECTION/POSTĘPY W OCHRONIE ROŚLIN 53 (2) 2013 Trichoderma spp. as a seed dressing bioproduct against damping-off seedlings of vegetables crops Trichoderma spp. jako zaprawa nasienna przeciwko zgorzelom siewek roślin warzywnych Jan Sobolewski, Aleksandra Gidelska, Magdalena Szczech, Józef Robak Summary The aim of study was to assess the effect of carrot seed dressing with selected isolates of the fungus Trichoderma spp. against damping-off seedlings of carrots. It was shown that the used isolates of Trichoderma spp. significantly reduced the infection of germinating seeds and carrots seedlings by the pathogenic fungus species Pythium spp. The use of Trichoderma spp. more efficiently affected the height and weight of the tested carrot seedlings as compared to thestandart seed dressing Zaprawa Nasienna T 75 DS/WS, as well as the biopreparation based on Trichoderma harzianum. No effect of phytotoxicity of Trichoderma spp. isolates used on seed germination and the development of carrot seedlings was started. Key words: Trichoderma, carrot, damping off, seed dressing Streszczenie Badano wpływ zaprawiania nasion marchwi nowymi izolatami grzyba Trichoderma spp. na ograniczenie zgorzeli siewek spowodowanej przez Pythium spp. oraz wzrost i masę siewek. Wykazano korzystne działanie Trichoderma spp. w ograniczeniu infekcji kiełkujących nasion marchwi i siewek przez organizm Pythium spp. występujący w podłożu. Obserwowano istotną zwyżkę zarówno wysokości, jak i ogólnej masy siewek marchwi po zastosowaniu izolatów Trichoderma w stosunku do standardowej zaprawy Zaprawa Nasienna T 75 DS/WS, a także w porównaniu do komercyjnej zaprawy nasiennej zawierającej Trichodrma viride. Badane izolaty nie miały fitotoksycznego działania na kiełkujące nasiona i siewki marchwi. Słowa kluczowe: Trichoderma, marchew, zgorzel siewek, zaprawianie nasion Instytut Ogrodnictwa Zakład Ochrony Roślin Warzywnych Pracownia Fitopatologii Konstytucji 3 Maja 1/3, 96-100 Skierniewice jan.sobolewski@inhort.pl; magdalena.szczech@inhort.pl; aleksandra.gidelska@inhort.pl; jozef.robak@inhort.pl Institute of Plant Protection National Research Institute Prog. Plant Prot./Post. Ochr. Roślin 53 (2): 340-344 Instytut Ochrony Roślin Państwowy Instytut Badawczy ISSN 1427-4337

Progress in Plant Protection/Postępy w Ochronie Roślin 53 (2) 2013 341 Wstęp / Introduction Grzyb Trichoderma spp. jest powszechnie znany jako organizm antagonistyczny, wykorzystywany do ograniczania grzybów patogenicznych w uprawie wielu roślin (Nederloff 2001; Weber i wsp. 2001; Alfanoi wsp. 2007; Ebtsam i wsp. 2009). Istnieją izolaty tego grzyba, różniące się antagonistycznym działaniem w stosunku do wybranych patogenów (Benítez i wsp. 2004). Jak podaje Howell (2003) w wielu przypadkach antagonistyczne działanie tych organizmów polega na zdolności do produkcji antybiotyków, czy pasożytniczego działania w stosunku do patogenów. Są też doniesienia (Harman 2000; Kowalska i wsp. 2012) o wpływie gatunków Trichoderma na stymulację wzrostu roślin, a także na zwiększanie tolerancji roślin na stresy abiotyczne w okresie ich wzrostu. Było to spowodowane stymulacją rozwoju systemu korzeniowego, co wpływało na lepsze pobieranie wody i składników pokarmowych. Grzyby z rodzaju Trichoderma są często stosowane jako zaprawy nasienne, wpływając korzystnie na cechy kondycyjne siewek (Sadowski i wsp. 2005; Mastouri i wsp. 2010). Przypuszcza się, że zabiegi takie wykazują korzystne działanie krótkoterminowe i niewiele jest doniesień o dalszym wpływie Trichoderma na rośliny w trakcie rozwoju. Zwykle nasiona reagują pozytywnie na zaprawianie grzybem Trichoderma harzianum (Harman 2000). W ostatnich latach w Polsce obserwuje się nagły wzrost występowania zgorzeli siewek spowodowany między innymi przez Pythium spp. na wielu gatunkach roślin warzywnych, powodując znaczne straty (Sobolewski i wsp. 2010). Jednym z powodów nasilającego się zagrożenia tą chorobą są ograniczone zasoby zapraw grzybobójczych dopuszczonych do stosowania w kraju, w uprawie większości gatunków roślin warzywnych, szczególnie w integrowanej i ekologicznej ochronie. Celem badań było określenie wpływu zaprawiania nasion marchwi nowymi izolatami grzyba Trichoderma spp. na ograniczenie zgorzeli siewek spowodowanej przez Pythium spp. oraz na wzrost i masę siewek. Istnieje konieczność poszukiwania nowych środków pochodzenia naturalnego. Oceniano także ich wpływ na kondycję siewek marchwi i możliwości toksycznego wpływu na siewki. Pracownia Mikrobiologii Instytutu Ogrodnictwa Oddział Warzywnictwa umożliwiła przetestowanie wybranych izolatów Trichoderma, jako preparatów do zaprawiania nasion marchwi. Materiały i metody / Materials and methods W latach 2012 2013 przeprowadzono dwa cykle doświadczeń z marchwią. Przyjęto ogólny schemat stosowanych zapraw, w którym wariantem porównawczym (standardowym) była konwencjonalna Zaprawa Nasienna T 75 DS/WS oraz zaprawa pochodzenia naturalnego T22, której substancją czynną jest grzyb T. harzianum. Do zaprawiania nasion zastosowano trzy wyselekcjonowane izolaty Trichoderma spp. Izolaty pochodziły z Pracowni Mikrobiologii Instytutu Ogrodnictwa Oddział Warzywnictwa. Każdy izolat stosowano w formie zawiesiny zarodników w trzech następujących koncentracjach: 1 10 4, 10 5 i 10 6 zarodników/ml. Doświadczenie kontenerowe założono w 4 powtórzeniach, w układzie losowanych bloków. Ogółem było 14 kombinacji. Na jeden kontener o wymiarach 30 25 7 cm, stanowiący powtórzenie, przypadało 100 nasion marchwi. Przed wysiewem nasiona zaprawiono na mokro, stosując dawkę 10 g nasion, na 50 ml zawiesiny zarodników o zagęszczeniu zgodnym ze schematem doświadczenia. Czas zaprawiania wynosił pięć minut. W przypadku Zaprawy Nasiennej T 75 DS/WS środek na nasiona nanoszono na sucho w dawce 5 g/kg nasion, zgodnie z etykietą. Po 24 godzinach suszenia nasion na bibule filtracyjnej wysiewano je po 100 sztuk do kontenerów z ziemią kompostową inokulowaną Pythium spp. Zakażenia gleby dokonano poprzez wymieszanie 10 ml zawiesiny Pythium spp. z 1 kg gleby mineralnej. Zawiesinę inokulum przyrządzono zgodnie z metodyką, jaką podaje Sivan i wsp. (1984). Po 14 dniach inkubacji grzybni hodowanej na pożywce ziemniaczanej PDA (Potato Dextrose Agar) w temperaturze 30 C dokonano homogenizacji pożywki z grzybnią przez 5 minut przy pomocy miksera. Uzyskana zawiesina inokulanta zawierała 5 10 6 oospor w 1 ml. Kontenery z wysianymi nasionami utrzymywano w szklarni, w temperaturze 20 C zapewniając optymalny wzrost siewek i patogeniczność Pythium spp. (Trujillo i wsp. 1967; Thompson i wsp. 1971). Ocenę liczby siewek wzeszłych oraz siewek martwych, porażonych przez Pythium spp. dokonano po 2 tygodniach od siewu. Dane te przeliczono na średni procent siewek zdrowych i martwych. Po 6 tygodniach wykonano pomiary wysokości siewek i ich świeżej, całkowitej masy. Ponadto szacowano stopień wpływu badanych izolatów na fitotoksyczność siewek, według skali 0 5 (0 brak efektów fitotoksycznych, 5 100 procent uszkodzenia siewek) (Sobolewski i wsp. 2010). Wyniki opracowano analizą wariancji, istotność różnic oceniono testem Newmana-Keulsa. Wyniki i dyskusja / Results and discussion Wykazano, że zaprawianie nasion marchwi badanymi izolatami spowodowało istotny wzrost liczebności siewek zdrowych w stosunku do kombinacji kontrolnej, w której wysiewano nasiona niezaprawiane. Po zaprawieniu nasion zarodnikami pochodzącymi z izolatów: Nr 2 i Nr 3 grzyba Trichoderma spp. uzyskano najwyższą liczbę siewek. Zaprawianie nasion zarodnikami Trichoderma spp. miało również istotny wpływ na zwiększenie masy ogólnej młodych roślin. Najwyższą masę roślin zanotowano w kombinacji, w której nasiona zaprawiono izolatem Nr 3 przy najwyższym poziomie zagęszczenia zarodników 1 10 6 /ml. Zastosowanie Trichoderma przy różnym zagęszczeniu zawiesiny zarodników w zakresie 1 10 4 1 10 6 nie miało istotnego wpływu na wysokość wschodów siewek, ich masę i wysokość. W doświadczeniu nr 1 (2012 r.), w porównaniu do standardowej zaprawy Zaprawa Nasienna T 75 DS/WS (2012 r.) stwierdzono istotną zwyżkę wschodów siewek zdrowych jedynie po zaprawieniu nasion zawiesiną zarodników 1 10 5 i 1 10 6 /ml grzyba Trichoderma izolat Nr 2 oraz zawiesiną zarodników o koncentracji 1 10 6 /ml izolat Nr 3. Po zaprawianiu

342 Trichoderma as the seed dressing / Trichoderma jako zaprawa nasienna Tabela 1. Wpływ zaprawiania nasion marchwi izolatami Trichoderma na wschody, zdrowotność siewek i ich wzrost Table 1. Influence of Trichoderma seed treatment on emergence, health and growth of carrot seedlings Doświadczenie nr 1 Experiment No. 1, Skierniewice 2012 Badany środek Treatment Średni procent roślin porażonych of plants infected Średni procent zdrowych siewek of healthy seedlings after sowing wysokość roślin Average plant height [cm] 6 tygodni 6 weeks masa roślin w kontenerze Average weight of plants per container [g] 6 tygodni 6 weeks Kontrola Control 2,2 a 4,2 a 58,5 g 55,5 e 7,5 g 10,2 f Zaprawa Nasienna T 75 DS/WS 3 g 0 b 0 b 72,8 def 73,5 d 9,9 f 19,1 e T22 10 4 0 b 0 b 60,3 g 62,0 e 10,5 bcd 27,2 cd T22 10 5 0 b 0,1 b 72,8 ef 74,3 d 11,1 f 28,3 bcd T22 10 6 0 b 0,2 b 73,0 def 75,0 cd 11,8 a 30,1 bc Izolat Nr 1 10 4 0 b 0,1 b 71,8 ef 74,0 d 10,4 bcd 28,6 bcd Izolat Nr 1 10 5 0 b 0 b 75,8 cdef 77,0 bcd 10,4 bcd 31,0 bc Izolat Nr 1 10 6 0 b 0 b 77,0 bcde 78,0 abcd 10,8 ab 29,9 bcd Izolat Nr 2 10 4 0 b 0,1 b 78,3 bcd 78,0 abcd 10,2 f 37,5 bc Izolat Nr 2 10 5 0 b 0 b 80,3 abc 81,0 abc 10,7 ef 39,8 b Izolat Nr 2 10 6 0 b 0 b 82,0 ab 82,0 ab 11,7 ab 39,9 b Izolat Nr 3 10 4 0 b 0 b 71,3 f 73,3 d 10,3 e 35,7 b Izolat Nr 3 10 5 0 b 0 b 74 def 74,8 d 11,6 bc 36,5 b Izolat Nr 3 10 6 0 b 0 b 83,0 a 83,3 a 11,9 a 43,4 a Wartości liczbowe w kolumnach oznaczone tą samą literą nie różnią się istotnie przy p = 0,05 według testu Newmana-Keulsa The mean numbers with the same letter are not significantly different at p = 0.05, Newman-Keuls test Tabela 2. Wpływ zaprawiania nasion marchwi izolatami Trichoderma na wschody, zdrowotność siewek i ich wzrost Table 2. Influence of Trichoderma seed treatment on emergence, health and growth of carrot seedlings Doświadczenie nr 2 Experiment No. 2, Skierniewice 2013 Badany środek Treatment Średni procent roślin porażonych of plants infected Średni procent zdrowych siewek of healthy seedlings wysokość roślin Average plant height [cm] masa roślin w kontenerze Average weight of plants per container [g] Kontrola Control 3,1 a 4,3 a 53,5 b 60,2 b 10,2 g 10,5 f Zaprawa Nasienna T 75 DS/WS 3 g 0 c 0 b 62,0 ab 65,5 ab 10,6 f 17,3 e T22 10 4 0,2 b 0,1 b T22 10 5 0,1 b 0,1 b T22 10 6 0 c 0 b Izolat Nr 1 10 4 0 c 0,1 b 67,0 a 70,0a 11,4 bc 29,2 cd Izolat Nr 1 10 5 0 c 0 b 67,3 a 69,3 a 11,5 bc 30,7 bcd Izolat Nr 1 10 6 0 c 0 b 65,5 a 66,0 a 11,5 bc 25,9 d Izolat Nr 2 10 4 0 c 0,2 b 66,8 a 69,0 a 11,0 cdef 35,9 abc Izolat Nr 2 10 5 0 c 0 b 70,7 a 72,5 a 11,3 cde 39,5 a Izolat Nr 2 10 6 0 c 0 b 70,2 a 72,0 a 11,4 bcd 38,4 ab Izolat Nr 3 10 4 0 c 0,1 b 71,7 a 73,2 a 10,8 ef 33,3 abcd Izolat Nr 3 10 5 0 c 0 b 67,7 a 68,7 a 11,5 bc 35,0 abc Izolat Nr 3 10 6 0 c 0 b 75,2 a 76,7 a 12,1 a 39,6 a Wartości liczbowe w kolumnach oznaczone tą samą literą nie różnią się istotnie przy p = 0,05 według testu Newmana-Keulsa The mean numbers with the same letter are not significantly different at p = 0.05, Newman-Keuls test

Progress in Plant Protection/Postępy w Ochronie Roślin 53 (2) 2013 343 nasion marchwi pozostałymi izolatami w zróżnicowanym zagęszczeniu zarodników uzyskano podobną liczebność wschodów do kombinacji z zaprawianiem nasion środkiem standardowym Zaprawa Nasienna T 75 DS/WS. Stwierdzono istotne zwiększenie masy ogólnej siewek po zaprawieniu nasion wszystkimi badanymi izolatami Trichoderma w stosunku do kombinacji z zaprawianiem nasion środkiem Zaprawa Nasienna T 75 DS/WS (tab. 1). W doświadczeniu nr 2 nie udowodniono istotnego wpływu zaprawiania nasion badanymi izolatami Trichoderma i zaprawą Zaprawa Nasienna T 75 DS/WS na liczebność wschodów siewek. Stwierdzono istotne zwiększenie masy ogólnej siewek w stosunku do kombinacji, gdzie stosowano stanardowy środek Zaprawa Nasienna T 75 DS/WS. Zaprawianie nasion badanymi izolatami nie wywołało efektów fitotoksyczności na siewkach (tab. 2). Jak donosi Ozbay i Newman (2004), podobnie korzystny wpływ na rośliny wykazał izolat T. harzianum stosowany w zagęszczeniu 1 10 7 zarodników w 1 ml. Spowodował istotną poprawę wzrostu siewek wyrażoną w zwiększeniu liczby liści właściwych, a także zwiększeniu świeżej masy roślin. Mastouri i wsp. (2010) udowodnili, że Trichoderma spp. stosowana w formie zaprawiania nasion pomidora spowodowała poprawę kiełkowania nasion narażonych na stres i ograniczyła zgorzel siewek spowodowany przez Pythium ultimum. Zaprawianie nasion zmniejszyło gromadzenie nadtlenków lipidów w siewkach i izolat T. harzianum T22 zwiększył wigor siewek oraz indukował ich efekt obronny przed warunkami stresowymi. W badaniach własnych uzyskano także poprawę kiełkowania i ograniczenie porażenia siewek marchwi przez Pythium spp. Korzystny wpływ grzyba z rodzaju Trichoderma na poprawę rozwoju i zdrowotności truskawki wykazała Kowalska i wsp. (2012). Khalil i wsp. (2009) stosowali mieszaninę T. polysporum i T. harzianum do podlewania roślin pomidora, co powodowało zmniejszanie nasilenia zgorzeli wywołane przez Pythium spp., Phytophthora cryptogea i Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici w uprawie pomidorów. Podobny, pozytywny wpływ T. harzianum na ograniczenie zgorzeli siewek marchwi powodowanych przez Pythium spp. uzyskano w badaniach własnych. Nowe izolaty będą mogły znaleźć zastosowanie jako produkty komercyjne chroniące siewki marchwi przed zgorzelą siewek i korzystnie wpływające na wzrost roślin. Jak podaje Sadowski i wsp. (2005) istnieje możliwość użycia Trichoderma do otoczkowania nasion wielu gatunków roślin uprawnych. Pozostaje jedynie problem współrzędnego stosowania fungicydów i herbicydów, które mogą ograniczać aktywność Trichoderma (Damszel i wsp. 2009; Górski i wsp. 2010; Perek i Świerczyńska 2012). Wnioski / Conclusions 1. Wybrane izolaty Trichoderma zastosowane do zaprawiania nasion marchwi chronią siewki przed porażeniem przez Pythium spp. 2. Zaprawianie nasion marchwi izolatami Trichoderma korzystnie wpłynęło na masę i wysokość roślin. 3. Najwyższą masę roślin zanotowano w kombinacji, w której nasiona zaprawiono izolatem Nr 3 stosując 1 10 6 zarodników/ml. 4. Koncentracja zarodników izolatów Trichoderma w zakresie 1 10 4 10 6 /ml stosowanych do zaprawiania nasion marchwi nie miała istotnego wpływu na zwiększenie wschodów siewek, ich masy i wysokości. 5. Badane izolaty nie wykazały fitotoksycznego działania na kiełkujące nasiona i siewki marchwi. 6. Wybrane izolaty Trichoderma mogą znaleźć w przyszłości zastosowanie do zabezpieczenia siewek przed Pythium spp.w integrowanej ochronie marchwi. Praca finansowana w ramach projektu badawczego współfinansowanego przez Unię Europejską z Europejskiego Funduszu Rozwoju Regionalnego w ramach Działania 1.3 Programu Operacyjnego Innowacyjna Gospodarka, Poddziałanie 1.3.1. Nr Projektu UDA-POIG.01.03.01-00- 129/09-05. Literatura / References Alfano G., Lewis Ivey M.L.C., Cakir C., Bos J.I.B., Miller S.A., Madden L.V., Kamoun S., Hoitink H.A.J. 2007. Systemic modulation of gene expression in tomato by Trichoderma hamatum. Phytopathology 97: 429 437. Benítez T., Rincón A.M., Limón M.C., Codón A.C. 2004. Biocontrol mechanisms of Trichoderma strains. Int. Microbiol. 7 (4): 249 260. Damszel M.M., Wachowska U., Kowalska E. 2009. Interakcje patogen (Fusarium) antagonista (Trichoderma) w warunkach stresu herbicydowego. [Interactions of pathogen (Fusarium) antagonist (Trichoderma) under herbicide stress conditions]. Prog. Plant Prot./Post. Ochr. Roślin 49 (2): 851 855. Ebtsam M.M., Abdel-Kawi K.A., Khalil M.N.A. 2009. Efficiency of Trichoderma viride and Bacillus subtilis as biocontrol agents against Fusarium solani on tomato plants. Egypt. J. Phytopathol. 37 (1): 47 57. Górski R., Kozłowska M., Góra K. 2010. Analiza porównawcza wpływu naturalnych olejków eterycznych na ograniczenie wzrostu grzyba Trichoderma harzianum występującego w uprawie pieczarki dwuzarodnikowej (Agaricus bisporus). [Comparitive analysis of the effectof natural essential oils growth reduction of the fungus Trichoderma harzianum found in button mushroom (Agaricus bisporus)]. Prog. Plant Prot./Post. Ochr. Roślin 50 (1): 352 356. Harman G. 2000. Myths and dogmas of biocontrol: changes in perceptions derived from research on Trichoderma harzianum T-22. Plant Dis. 84: 377 393. Howell C.R. 2003. Mechanisms employed by Trichoderma species in the biological control of plant diseases: history and evolution of current concepts. Plant Dis. 87: 4 10.

344 Trichoderma as the seed dressing / Trichoderma jako zaprawa nasienna Khalil S., Hultberg M., Alsanius B.W. 2009. Effect of growing medium on the interactions between biocontrol agents and tomato root pathogens in a closed hydroponic system. J. Hortic. Sci. Biotechnol. 84 (5): 489 494. Kowalska J., Remlein-Starosta D., Drożdżyński D. 2012. Wykorzystanie Trichoderma asperellum w ekologicznej uprawie truskawek. [Using of Trichoderma asperellum in organic strawberry production]. Prog. Plant Prot./Post. Ochr. Roślin 52 (2): 351 353. Mastouri F., Björkman T., Harman G.E. 2010. Seed treatment with Trichoderma harzianum alleviates biotic, biotic, and physiological stresses in germinating seeds and seedlings. Phytopathology 100 (11): 1213 1221. Nederloff E. 2001. Biological control of root diseases especially with Trichoderma. Grower 56 (5): 24 25. Ozbay N., Newman S.E. 2004. The effect of the Trichoderma harzianum strains on the growth of tomato seedlings. p. 131 135. Proc. XXVI IHC Managing Soil-Borne Pathogens (A. Vanachter, ed.). Acta Hort., 635 pp. Perek A., Świerczyńska I. 2012. Wpływ fungicydów na antagonizm grzybów Trichoderma viride i Fusarium spp. w warunkach in vitro. [Influence of fungicides on antagonism of fungi Trichoderma viride and Fusarium spp. under in vitro conditions]. Prog. Plant Prot./Post. Ochr. Roślin 52 (4): 1038 1041. Sivan B., Elad Y., Chet I. 1984. Biological control effects of a new isolate of Trichoderma harzianum on Pythium spp. Phytopathology 74: 498 503. Sadowski Cz., Pańka D., Lenc L., Domoradzki M. 2005. Badania nad możliwością wykorzystania biopreparatów do otoczkowania nasion warzyw ekologicznych. [Research on possibility of biopreperations for organic vegetable seed coating]. Prog. Plant Prot./Post. Ochr. Roślin 45 (2): 1055 1057. Sobolewski J., Robak J., Ostrowska A., Gidelska A., Janas R. 2010. Weryfikacja aktualnego stanu zabezpieczenia siewek wybranych gatunków roślin warzywnych przed patogenami. [Verification state of seed protection of selected vegetable plants against seed borne pathogenes]. Prog. Plant Prot./Post. Ochr. Roślin 50 (2): 741 747. Thompson T.B., Athew K.L., Laviolette F.A. 1971. The effect of temperature on the pathogenicity of Pythium spp., P. debaryanum and P. ultimum on soybean. Phytopathology 61: 933 935. Weber Z., Weber M., Frużyńska-Jóźwiak D. 2001. Przeżywalność grzybów z rodzaju Trichoderma w biopreparatach z różnymi nośnikami i ich skuteczność w ochronie roślin przed Fusarium oxysporum. [Surviving of Trichoderma fungi in bioproducts with different inactive ingredients and their efficacy in plant protection against Fusarium oxysporum]. Prog. Plant Prot./Post. Ochr. Roślin 41 (2): 769 772.