- - - - - * Praca finansowana z funduszu prac własnych Uniwersytetu Medycznego w Łodzi nr 502-11-453. Autorzy nie zgłaszają konfliktu interesów. Ekspresja cząstki adhezyjnej ICAM-1 u chorych z polipami nosa* Expression of adhesion molecule ICAM-1 in patients with nasal polyps Izabela Olejniczak, Józef Kobos 1, Maciej Gryczyński, Marcin Durko, Wioletta Pietruszewska Katedra i Klinika Otolaryngologii Uniwersytetu Medycznego w Łodzi Kierownik: prof. dr hab. n. med. T. Durko 1Zakład Patologii Wieku Rozwojowego Katedry Biomedycznych Podstaw Pielęgniarstwa Uniwersytetu Medycznego w Łodzi Kierownik: prof. dr hab. med. J. Kobos Summary Introduction. Nasal polyposis is a chronic inflammatory disease of the nasal mucosa. The prevalence of nasal polyps seems to vary between 1 and 4% of the population. The pathogenesis of nasal polyps is still not entirely known and has been debated for many years. The aim of the present study was to evaluate the expression of adhesion molecule ICAM-1 in patients with nasal polyps. Materials and methods. 53 patients with nasal polyposis were selected and divided into two groups allergic and non-allergic. Patients with allergy were distinguished from those without allergy on the basis of positive allergy skin tests to dust and serum levels of IgE. Immunohistochemical studies with monoclonal antibody against ICAM-1 antigen (NCL-CD54, Novocastra) using immunoperoxidase method were performed to evaluate expression of ICAM- 1. Results. Immunoexpression of ICAM-1 was present on some epithelial cells and on fibroblast, inflammatory cells and endothelium in the submucosa. The mean ±SD values of the immunoexpression of ICAM-1 were significantly increased in dust-sensitive patients compared with dust-tolerant patients (1,93 ± 0,83 vs 0,83 ± 0,73 (p < 0,001). Conclusions. This research suggests that ICAM-1 plays an important role in the pathogenesis of nasal polyps and the allergic mechanism may play a fundamental role in this process. However, further examinations to confirm this need to be undertaken. Hasła indeksowe: polipy nosa, przewlekłe zapalenie, alergia, ICAM-1 Key words: nasal polyps, chronic inflammation, allergy, ICAM-1 Otolaryngol Pol 2007; LXI (4): 607 611 2007 by Polskie Towarzystwo Otorynolaryngologów Chirurgów Głowy i Szyi Polipy nosa są wypustkami błony śluzowej o gładkiej powierzchni i galaretowatej konsystencji. Znajdują się najczęściej na bocznej ścianie nosa, zwykle w przewodzie nosowym środkowym lub wzdłuż środkowej lub górnej małżowiny nosowej. Występują u około 1 4% populacji, ich częstość wzrasta z wiekiem, więcej przypadków zachorowań notuje się u mężczyzn. Patomechanizm powstawania polipów nosa nadal pozostaje kwestią sporną i istnieje wiele na ten temat teorii. W patomechanizmie polipów nosa istotną rolę odgrywa proces zapalny, udział komórek immunologicznych, produkowanych przez nie cytokin oraz cząstek adhezyjnych [2]. Zapalenie jest procesem, który towarzyszy bardzo różnym reakcjom i ma przebieg częściowo zależny od egzogennych czynników sprawczych, ale w znacznej części zależy od endogennych czynników i mechanizmów. W sposób bardzo precyzyjny reakcja zapalna zdefiniowana została w czasach 607
- - - - - I. Olejniczak i inni starożytnych: rzymski lekarz Celsus uszeregował objawy zapalenia jako następujące: rubor, dolor, tumor, calor zaczerwienienie, ból, obrzmienie, wzrost temperatury. Galen do objawów tych dodał bardzo istotną cechę functio laesa zaburzenia funkcji [9, 14]. Zapalenie rozpatrywane być może jako zjawisko zachodzące w dwóch fazach: ostrej i przewlekłej. Faza ostra trwa sekundy, minuty, godziny; faza przewlekła to dni, tygodnie, a nawet miesiące. Faza ostra zapalenia następuje bezpośrednio po zadziałaniu bodźca i uczynnieniu kilku procesów, do których zaliczyć można uwalnianie histaminy, kinin, wytwarzanie metabolitów kwasu arachidonowego. W końcowej części tej fazy zostaje pobudzona produkcja cytokin zapalnych [9]. Nasilona ekspresja cząsteczek adhezyjnych, m.in. ICAM-1 (intracellular adhesion molecule) i VCAM-1 (vascular cell adhesion molecule), na śródbłonkach ułatwia gromadzenie i przechodzenie do tkanek komórek zapalenia z krążenia (reakcja przewlekła). Te interakcje umożliwiają ścisłe przyleganie obu komórek i przekazanie sygnału pomiędzy innymi cząsteczkami znajdującymi się na ich powierzchni. Cząsteczki adhezyjne odgrywają znaczącą rolę w powstawaniu procesu zapalnego. Ekspresja cząstek adhezyjnych na powierzchni komórek nabłonka jest niezbędna, aby eozynofile, makrofagi, limfocyty, granulocyty, komórki plazmatyczne z krwi przedostały się do miejsca zapalenia [13, 14]. ICAM-1 (CD 54) należy do nadrodziny immunoglobulin, której wspólnym elementem budowy jest immunoglobulinowa jednostka homologiczna zawierająca około stu aminokwasów i posiadająca centralnie położony mostek dwusiarczkowy, tworzący pętlę z 50 70 aminokwasów. ICAM-1 jest wysoko glikozylowanym białkiem o masie 495 kd, którego obecność stwierdzono na powierzchni komórek śródbłonka, mięśni gładkich, fibroblastów, ale także na monocytach, limfocytach i komórkach nabłonka. Indukcja tego białka wiąże się z obecnością mediatorów procesu zapalnego, takich jak: TNF-alfa, IFNgamma, Il-1alfa i beta, Il-4, Il-13, lipopolisacharydy bakteryjne. Co istotne, ekspresję ICAM-1 obserwuje się na komórkach nabłonka układu oddechowego, w tym polipów nosowych. W pyłkowicach, w czasie trwania sezonu, dochodzi do zwiększenia ekspresji ICAM-1 na komórkach nabłonkowych błony śluzowej nosa i spojówek, dlatego też cząstkę tę rozpatruje się jako swoisty marker reakcji alergicznej [9, 12, 13]. ICAM-1 jest receptorem dla beta2 integryn, leukocytów: alfaabetab, LFA-1 (CD11a/CD18), alfambeta2, MAC-1 (CD11b/CD18), związanymi z procesem adhezji i migracją leukocytów przez barierę komórek śródbłonka. Dochodzi do aktywacji limfocytów T na drodze interakcji między TCR (T cell receptor) i MHC (Major Histocompatibility Complex) na komórkach prezentujących antygen (APC) I sygnał; oraz poprzez interakcję LFA-1 (domena I) na powierzchni komórek T i ICAM-1 na komórkach prezentujących antygen II sygnał. Stwierdzono, iż ligandem receptora dla ICAM-1 jest również fibrynogen. Jego obecność zwiększa zdolność leukocytów do wiązania się z komórkami śródbłonka [1, 7, 12, 13, 17]. ICAM-1 jest też receptorem dla wielu typów rhinowirusów. Zakażenia tymi wirusami są szeroko rozpowszechnione i wiążą się z występowaniem przeziębień, tzw. common cold. Zakażenia wirusowe mogą być jednym z czynników powodujących uszkodzenie endothelium i wzrost adhezji leukocytów, co w rezultacie stwarza warunki sprzyjające rozwojowi ogniska zapalnego [7]. Celem pracy była ocena ekspresji cząstki adhezyjnej ICAM-1 u chorych z polipami nosa oraz próba określenia jej udziału w powstawaniu polipów nosa. MATERIAŁ I METODY Badaniami objęto 53 chorych z polipami nosa w wieku od 27 do 65 lat (średnia wieku: 42,3), u których przeprowadzono leczenie operacyjne usunięcia polipów nosa. Do badania wyodrębniono chorych z polipowatością nosa uczulonych na antygeny roztocza, ponieważ polipy w przeważającej części występują u chorych z całorocznym alergicznym nieżytem nosa. Chorych podzielono na podstawie przeprowadzonych testów skórnych i pomiaru wartości całkowitej IgE w surowicy metodą immunoenzymatyczną ELISA (zestawem Allergopharma) na 2 grupy. Pierwszą grupę stanowili chorzy z alergią, tj. z dodatnimi testami skórnymi na roztocza i wartością całkowitej IgE w surowicy przekraczającą 100 IU/ml. Drugą grupę tworzyli chorzy bez potwierdzonej alergii, wykazujący ujemne testy skórne i IgE poniżej 20 IU/ml. Charakterystykę grupy przedstawiono w tabeli I. Przeprowadzono badania immunohistochemiczne w skrawkach parafinowych preparatów polipów nosa z zastosowaniem przeciwciała monoklonalnego skierowanego przeciwko antygenowi ICAM-1 (NCL-CD54; Novocastra) z zastosowaniem metody immunoperoksydazowej awidyna 608
- - - - - biotyna. Ekspresję cząsteczki ICAM-1 oceniano półilościowo, określając 0 jako brak ekspresji; 1 jako ekspresję w pojedynczych komórkach; 2 odczyn średnio nasilony; 3 reakcja barwna w większości komórek w polu widzenia. Wynik podano jako średnią z 10 pomiarów w każdym przypadku. WYNIKI We wszystkich przypadkach, po barwieniu rutynowym H+E, w ocenie w mikroskopie świetlnym potwierdzono rozpoznanie histologiczne polipów nosa. Ekspresję ICAM-1 stwierdzono na niektórych komórkach nabłonka, w warstwie podśluzowej na komórkach zapalnych i fibroblastach oraz na śródbłonku naczyń podścieliska pod postacią brunatnego, rozlanego odczynu błonowo-cytoplazmatycznego (ryc. 1). Średnie wartości immunoekspresji u chorych z alergią na roztocza kurzu domowego wynosiły 1,93 ± 0,83 i były istotnie wyższe niż u chorych z polipami bez alergii: 0,83 ± 0,73 (p < 0,001). DYSKUSJA Ryc. 1. Ekspresja ICAM-1: 1. w śródbłonku naczyń zrębu polipa nosowego (odczyn immunoperoksydazowy, pow. 100x); 2. w komórkach śródbłonka i w aktywowanych limfocytach (odczyn immunoperoksydazowy, pow. 300x) W patomechanizmie polipów nosa istotną rolę odgrywa proces zapalny i udział komórek immunologicznych oraz produkowanych przez nie cytokin. Znaczącą rolę odgrywają też cząstki adhezyjne, m.in. ICAM-1 (CD-54), które biorą udział w migracji komórek zapalnych: eozynofilów, neutrofilów, limfocytów T i fibroblastów [3 5, 8, 10, 15]. Migracja i aktywacja eozynofilów jest kluczowym procesem dla astmy oskrzelowej, nieżytu alergicznego nosa i polipów nosa. Literatura naukowa podaje istotne różnice w wynikach ekspresji ICAM-1 u zdrowych osób i chorych wykazujących cechy przewlekłego zapalenia dróg oddechowych w przebiegu astmy oskrzelowej, alergii i polipów nosa [4 6]. Nadal kwestią sporną pozostaje jednak udział procesów alergicznych u chorych z polipami nosa. Wyniki powyższych badań wskazują, że immunoekspresja cząsteczki adhezyjnej ICAM-1 jest istotnie zaburzona u chorych z polipami nosa i alergią na roztocza kurzu domowego w porównaniu z grupą bez alergii. ICAM-1 obserwuje się na komórkach nabłonka układu oddechowego, w tym polipów nosowych, Tabela I. Charakterystyka badanej grupy chorych z polipami nosa (N = 12) Cecha badana Chorzy z alergią na roztocza kurzu domowego (N = 22); Chorzy bez alergii na roztocza (N = 31); testy (-) Poziom istotności (p < 0,05) testy (+) Średnie IgE całkowite (IU/ml) 464,68 93,61 < 0,01 Średnie IgE na roztocza 5,06 0,35 < 0,01 Liczba polipektomii od 1 do 9; średnio: 4,3 od 1-3; średnio: 1,2 0,01 Astma oskrzelowa 11 chorych 10 chorych 0,1 Steroidy donosowe 12 chorych 10 chorych 0,5 609
- - - - - I. Olejniczak i inni na fibroblastach, śródbłonku naczyń [10, 16]. W badaniach obserwuje się zarówno wzrost, jak również zahamowanie ekspresji ICAM-1 pod wpływem różnych mediatorów biorących udział w procesach immunologicznych. W badaniach różnych autorów stwierdzono istotny wzrost ekspresji ICAM-1 na komórkach nabłonka polipów nosa pod wpływem IFN-gamma, co może świadczyć o korelacji ICAM-1 i sekrecji cytokin Th1-(IFN-gamma) zależnych [10]. Cytokiny produkowane przez subpopulację Th1 limfocytów znacznie zwiększają ekspresję ICAM- 1, natomiast cytokiny subpopulacji Th2, mające związek z reakcjami alergicznymi, nie odgrywają istotnej roli w aktywacji tej cząstki adhezyjnej. Podobne wyniki uzyskali inni autorzy badając ekspresję ICAM-1 na komórkach nabłonka pobranych od chorych z polipami nosa. TNF-alfa, należący do subpopulacji Th1 limfocytów, podobnie jak IFN-gamma, zwiększa ekspresję ICAM-1 prawdopodobnie stymulując NF-kB (nuclear transcription factor) w genie promotorowym [4, 16]. W kolejnych badaniach określono wpływ Il-1 (Th1-zależna) oraz Il-4, Il-6 i Il-8 (Th2-zależne) na ekspresję ICAM-1. Stwierdzono dodatnią korelację pomiędzy ekspresją ICAM-1 na nabłonku dróg oddechowych a Il-1. Cytokiny: Il-4, Il-6, Il-8 i GM-CSF wydają się nie hamować ani nie stymulować ekspresji ICAM-1, co po raz kolejny poddaje w wątpliwość udział procesów alergicznych w powstawaniu polipów nosa. Il- 1, IFN-gamma i TNF-beta mają także wpływ na ekspresję ICAM-1 na komórkach śródbłonka naczyń polipów nosowych [16]. Podobne wyniki uzyskali Silvestri i wsp. Autorzy przedstawili wzrost ekspresji ICAM-1 pod wpływem TNF-alfa i jednocześnie brak aktywacji ICAM-1 i migracji fibroblastów w obecności Il-4, odgrywającej kluczową rolę w procesach alergicznych [15]. Udowodniono też, że ocena poziomu ekspresji ICAM-1 na komórkach nabłonka dróg oddechowych nie może być stosowana jako wczesny marker alergicznego nieżytu nosa. Nie stwierdzono wzrostu ekspresji ICAM-1 u chorych z alergią na roztocza (D. pteronyssinus) w zależności od nasilenia objawów chorobowych (p = 0,602) [8]. Z drugiej strony istnieją badania wskazujące na korelację ekspresji ICAM-1 z procesami alergicznymi. W pyłkowicach, w czasie trwania sezonu, dochodzi do zwiększenia ekspresji ICAM-1 na komórkach nabłonkowych śluzówki nosa i spojówek. Nie obserwuje się tego zjawiska poza sezonem. Dlatego też ICAM-1 może być rozpatrywany jako swoisty marker reakcji alergicznej. Natomiast w uczuleniu na roztocza, gdzie stymulacja trwa cały rok, obserwujemy stałą podwyższoną ekspresję ICAM-1, mimo że u pacjentów nie stwierdza się objawów chorobowych. Mówimy o tzw. niewielkim stałym zapaleniu. ICAM- 1 pełniący rolę receptora dla rhinowirusów, może ulegać nadmiernej ekspresji na komórkach nabłonka po stymulacji endotoksyną zawartą w kurzu domowym [7]. W przeprowadzonym badaniu także uzyskano istotny wzrost ekspresji ICAM-1 u chorych z polipami nosa i stwierdzoną alergią na roztocza. W innych badaniach udowodniono, potwierdzając uzyskane przez autorów wyniki, że ICAM-1 pełni ważną rolę w migracji eozynofilów pod wpływem alergenu. W modelu myszy z niedoborem ICAM-1 stwierdzono istotny statystycznie spadek migracji eozynofilów do miejsca zapalenia po ekspozycji na alergen (p = 0,0001) [3]. Delbrouck i wsp. badali ekspresję ICAM-1 w dwóch grupach: u chorych z polipami nosa i alergią oraz bez alergii. Chorzy byli podzieleni na grupy na podstawie przeprowadzonych testów skórnych i pomiaru całkowitej IgE w surowicy krwi. Stwierdzono spadek ekspresji ICAM-1 pod wpływem budesonidu stosowanego donosowo, ale różnił się on u chorych z polipami nosa i alergią w porównaniu z chorymi z polipami nosa bez alergii. Istotne statystycznie zmniejszenie ekspresji ICAM-1 uzyskano u chorych ze stwierdzoną wcześniej alergią [5]. W innej pracy oceniano ekspresję Il-5, Il-10, Il-13 (należących do subpopulacji Th2) oraz ICAM-1 po ekspozycji na dwutlenek azotu. Opisano 5-krotny wzrost ekspresji ICAM-1 po inkubacji z cytokinami syntetyzowanymi przez limfocyty Th2, gdzie Il-13 odgrywa ważną rolę w zapaleniu alergicznym poprzez przełączanie klas immunoglobulin i zwiększenie syntezy IgE [11]. Podsumowując, stwierdzono istotny udział ICAM-1 w patomechanizmie powstawania polipów nosa. Uzyskane wyniki w badaniach własnych wydają się także potwierdzać rolę ICAM-1 w toczących się procesach alergicznych. Jednocześnie udział ICAM-1 w reakcjach immunologicznych jest bardziej złożony, co utrudnia wysunięcie jednoznacznych wniosków. Problem wymaga potwierdzenia w kolejnych badaniach. PIŚMIENNICTWO 01. Anderson ME, Siahaan TJ. Mechanism of binding and internalization of ICAM-1- derived cyclic peptides by LFA-1 on the surface of T cells: a potential method for targeted drug delivery. Pharm Res. 2003; 20(10): 1523 1532. 610
- - - - - 02. Bateman N, Fahy C, Woolford T. Nasal polyps: still more que- notrogen dioxide upregulates the expression of Il-5, Il-10, Il- stions than answers. J Laryngol Otol. 2003; 117(1): 1-10. 03. Broide DH, Sullivan S, Gifford T, Sriramarao P. Inhibition of pulmonary eosinophilia in P-selectin- and ICAM-1-deficient mice. Am J Respir Cell Mol Biol. 1998; 18(2): 218-225. 04. Burke-Gaffney A, Hellewell PG. A CD18/ICAM-1-dependent pathway mediates eosinophil adhesion to human bronchial epithelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 1998; 19(3): 408-418. 05. Delbrouck C, Kaltner H, Danguy A, Nifant ev NE, Bovin NV, Vandenhoven G, i wsp. Glucocorticoid-induced differential expression of the sialylated and nonsialylated Lewis epitopes and respective binding sites in human nasal polyps maintained under ex vivo tissue culture conditions. Ann Otol Rhinol Laryngol. 2002; 11(12): 1097-1107. 06. Hassid S, Choufani G, Nagy N, Kaltner H, Danguy A, Gabius H-J, i wsp. quantitative glycohistochemical characterization of normal nasal mucosa, and of single as opposed to massive nasal polyps. Ann Otol Rhinol Laryngol 1999; 108(8): 797-805. 07. Keicho N, Elliott WM, Hogg JC, Hayashi S. Adenovirus E1A gene dysregulates ICAM-1 expression in tranformed pulmonary epithelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 1997; 16(1): 23-30. 08. Klaewsongkram J, Ruxrungtham K, Wanakrairot P, Ruangvejvorachai P, Phanupak P. Eosinophil count in nasal mucosa is more suitable than the number of ICAM-1 positive nasal epithelial cells to evaluate the severity of house dustmite- sensitive allergic rhinitis: a clinical correlation study. Int Arch Allergy Immunol. 2003; 132(1): 68-75. 09. Kowalski ML. Immunologia kliniczna. Odpowiedź immunologiczna; Kliniczne postacie alergii atopowej. Łódź: Mediton; 2000. p. 1-32, 165-198. 10. Papon JF, Coste A, Gendron MC, Cordonnier C, Wingerstmann L, Peynegre R, i wsp. HLA-DR and ICAM-1 expression and modulation in epithelial cells from nasal polyps. Laryngoscope 2002; 112: 2067-2075. 11. Pathmanathan S, Krishna MT, Blomberg A, Helleday R, Kelly FJ, Sandstrom T, i wsp. Repeated daily exposure to 2 ppm 13, and ICAM-1 in the bronchial epithelium of healthy human airways. Occup Environ Med. 2003; 60(11): 892-896. 12. Rijcken E, Krieglstein CF, Anthoni C, Laukoetter MG, Mannigen R, Spiegel HU, i wsp. ICAM-1 and VCAM-1 antisense oligonucleotides attenuate in vivi leucocyte adherence and inflammation in rat inflammatory bowel disease. Gut 2002; 51(4): 529-535. 13. Rogala B, Namysłowski G, Mrówka-Kata K, Gawlik R, Gabriel A. Concentration of s-icam-1 in nasal polyps tissue. Med Sci Monit. 2000; 6(6): 1109-1112. 14. Roitt I, Brostoff J, Male D. Immunologia. Warszawa: Wydawnictwo Lekarskie PZWL; 2000. 15. Silvestri M, Sabatini F, Scarso L, Cordone A, Dasic G, Rossi GA. Fluticasone propionate downregulates nasal fibroblast functions involved in airway inflammation and remodeling. Int Arch Allergy Immunol. 2002; 128(1): 51-58. 16. Subauste MC, Choi DC, Proud D. Transient exposure of human bronchial epithelial cells to cytokines leads to persistent increased expression of ICAM-1. Inflammation 2001; 25(6): 373-380. 17. Tingsgaard PK, Larsen PL, Bock T, Lange Vejlsgaard G, Tos M. Expression of Intercellular Adhesion Molecule-1 on the vascular endothelium in nasal polyps before, during and after topical glucocorticoid treatment. Acta Otolaryngol. 1998; 118: 404-408. Adres autora: Izabela Olejniczak ul. Haśka 6 m. 28 92-502 Łódź e-mail: lizbet@wp.pl Pracę nadesłano: 06.05.2007 r. 611