Doc. dr hab. BARBARA NAWROT Centrum Badañ Molekularnych i Makromolekularnych PAN Zak³ad Chemii Bioorganicznej ul. Sienkiewicza 112, 90-363 ódÿ

Doc. dr hab. BARBARA NAWROT Centrum Badañ Molekularnych i Makromolekularnych PAN Zak³ad Chemii Bioorganicznej ul. Sienkiewicza 112, 90-363 ódÿ e-mail: bnawrot@bio.cbmm.lodz.pl

NEUROPROTEKCJA XX Zimowa Szko³a Instytutu Farmakologii PAN Mogilany 2003 pod redakcj¹ Marii Œmia³owskiej 65 75 HAMOWANIE EKSPRESJI GENÓW BIA EK UCZESTNICZ CYCH W WYTWARZANIU -AMYLOIDU JAKO PERSPEKTYWA NEUROPROTEKCJI W CHOROBIE ALZHEIMERA BARBARA NAWROT, S³awomir Antoszczyk, Ma³gorzata Sierant Zak³ad Chemii Bioorganicznej CBMM PAN, ódÿ Wstêp Choroba Alzheimera (ang. Alzheimer s disease AD), opisana prawie sto lat temu przez Alojza Alzheimera [1], zosta³a zdefiniowana jako zespó³ zaburzeñ neurodegeneratywnych oœrodków mózgowych. Schorzenie to, statystycznie dotyka co dziewi¹t¹ osobê po 80-tym roku ycia i dotyczy kilkudziesiêciu milionów ludzi na œwiecie. Problem jest tym bardziej istotny, e stale powiêksza siê liczba ludnoœci na Ziemi i wyd³u a siê œredni czas ycia cz³owieka. Konsekwencj¹ jest wzrost populacji ludzi starych a podesz³y wiek stanowi najwiêkszy czynnik ryzyka wyst¹pienia tej choroby. Ponad dziesiêæ lat temu po raz pierwszy sformu³owano hipotezê kaskady amyloidowej, wed³ug której g³ówn¹ przyczyn¹ choroby Alzheimera jest odk³adanie siê w tkankach mózgowych nierozpuszczalnych z³ogów bia³kowych, tzw. blaszek -amyloidowych (Ryc. 1). Wed³ug tej hipotezy, obecnoœæ blaszek amyloidowych powoduje najwczeœniejsze i krytyczne zmiany patogenne istotne dla rozwoju choroby Alzheimera [16, 22]. blaszki amyloidowe mikroglej astrocyty blaszka amyloidowa zwyrodnienia neurofibrylarne Ryc. 1. Blaszki amyloidowe i zwyrodnienia neurofibrylarne widoczne w korze mózgowej pacjenta z chorob¹ Alzheimera (obraz uzyskany z mikroskopu œwietlnego). Blaszkom amyloidowym, zawieraj¹cym g³ównie peptyd -amyloidowy, towarzysz¹ komórki zapalne mikrogleju i astrocyty. Zwyrodnienia neurofibrylarne s¹ splotami hiperfosforylowanego bia³ka tau zwi¹zanego z mikrotubulami [16]

66 B. Nawrot, S. Antoszczyk, M. Sierant Geneza tworzenia siê -amyloidów G³ównym sk³adnikiem blaszek amyloidowych jest krótki peptyd zwany -amyloidem, peptydem -amyloidowym, -peptydem lub A [41]. -Amyloid wydzielany jest w postaci amyloidowego bia³ka prekursorowego APP (ang. amyloid precursor protein) [24]. Bia³ko APP o masie 90 130 kda wystêpuje w kilku odmianach izomorficznych, z których najczêstsze to forma zawieraj¹ca 695 lub 771 aminokwasów. APP jest bia³kiem transb³onowym retikulum endoplazmatycznego (siateczki œródplazmatycznej), aparatu Golgiego i innych przedzia³ów wewn¹trzkomórkowych. APP obecne jest we wszystkich typach komórek i tkanek, a szczególnie w mózgu, sercu, œledzionie, nerkach i miêœniach. Istniej¹ dwie drogi ciêcia APP (Ryc. 2). Pierwsza z nich to konwencjonalna droga sekrecji, w której bia³ko APP jest hydrolizowane przez dwa enzymy proteolityczne: - i -sekretazê. Produktami sekrecji s¹: du y, rozpuszczalny N-terminalny fragment bia³ka APP -APPs, krótki peptyd P3 oraz zakotwiczony w b³onie peptyd P7 (zwany tak e fragmentem C83 C-terminalnym koñcem bia³ka prekursorowego zawieraj¹cym 83 aminokwasy). Produkty sekrecji - i- odgrywaj¹ wa n¹ rolê m.in. w procesach os³ony komórek nerwowych przed zwyrodnieniem [35], w warunkach stresu oksydacyjnego obni aj¹c poziom jonów wapnia [3, 34]. S¹dzi Ryc. 2. Dwie drogi proteolizy bia³ka APP. W konwencjonalnej sekrecji uczestnicz¹ dwa bia³ka proteolityczne: -sekretaza, która wycina d³ugi rozpuszczalny N-terminalny fragment bia³ka APP (-APPs), oraz -sekretaza, która rozcina w obrêbie b³onowym fragment P10 na nietoksyczne peptydy P3 i P7. W amyloidogennej drodze sekrecji uczestnicz¹ -i-sekretaza. -Sekretaza generuje N-terminalny koniec peptydu -amyloidowego, wchodz¹cego w sk³ad blaszek amyloidowych siê tak e, e znajduj¹ce siê w p³ytkach krwi bia³ko -APPs, poprzez oddzia³ywania z heparyn¹, bierze udzia³ w procesach gojenia siê ran [31]. Ta droga sekrecji zachodzi w zdrowych komórkach i jest konieczna dla prawid³owego funkcjonowania organizmu. Druga droga sekrecji bia³ka APP, zachodz¹ca z udzia³em -sekretazy, prowadzi do utworzenia rozpuszczalnego N-terminalnego fragmentu bia³ka APP (-APPs) i transb³onowego peptydu P11 zwanego fragmentem C99 (peptyd zawiera 99 aminokwasów C-terminalnego koñca APP). Sekrecja P11 za pomoc¹ -sekretazy prowadzi do uwolnienia -amyloidu, peptydu o d³ugoœci 39 43 aminokwasów. Rozpuszczalne formy -amyloidu obecne s¹ powszechnie w p³ynach ustrojowych i tkankach. Wytwarzana w mniejszych iloœciach d³u sza forma -amyloidu (A42) szczególnie ³atwo ulega agregacji w tkankach i komórkach mózgowych tworz¹c nierozpuszczalne p³ytki amyloidowe, uwa ane za czynniki toksyczne w chorobie Alzheimera [10, 28]. Co wiemy o niszcz¹cym neurony dzia³aniu -amyloidu Jak siê powszechnie s¹dzi, czynnikiem toksycznym choroby Alzheimera s¹ blaszki amyloidowe, widoczne w obrazie mikroskopowym mózgu pacjenta z AD (Ryc. 1). Blaszki amyloidowe tworz¹ce siê w przestrzeniach miêdzykomórkowych uszkadzaj¹ neurony, chocia mechanizm tego zjawiska jest nie do koñca wyjaœniony i wci¹ jest przedmiotem dyskusji. Uwa a siê, e toksyczne z³ogi amyloidowe zaburzaj¹ mechanizm regulacji poziomu jonów wapnia w komórkach mózgowych oraz uszkadzaj¹ mitochondria, indukuj¹c wydzielanie siê wolnych rodników. Konsekwencj¹ tego procesu jest degeneracja DNA i bia³ek komórkowych. Procesom tym towarzyszy obecnoœæ komórek reakcji zapalnej mózgu astrocytów i komórek mikrogleju, których aktywnoœæ pog³êbia procesy degeneracji. Obok blaszek amyloidowych w obrazie mózgu widoczne s¹ tak e zwyrodnienia nerwowo-w³ókienkowe, zwane splotami neurofibrylarnymi (NFT ang. neurofibrilary tangles). G³ównym sk³adnikiem NFT jest hiperfosforylowane bia³ko tau zwi¹zane z tubulin¹, bia³kiem budulcowym mikrotubuli strukturalnych elementów neuronów. Sploty neurofibrylarne, które wed³ug hipotezy kaskady amyloidowej tworz¹ siê w nastêpstwie toksycznego dzia³ania blaszek amyloidowych, uszkadzaj¹ mikrotubule zmieniaj¹c ich kszta³t i zaburzaj¹c szlaki transportu substancji od- ywczych i organelli wewn¹trzkomórkowych oraz uniemo liwiaj¹c neuronom przekazywanie sygna³ów elektrycznych. Stopieñ demencji w AD zale ny jest zarówno od iloœci blaszek amyloidowych, jak i od zagêszczenia zwyrodnieñ neurofibrylarnych [16].

HAMOWANIE EKSPRESJI -SEKRETAZY SZANS NEUROPROTEKCJI W CHOROBIE ALZHEIMERA 67 Hipoteza kaskady amyloidowej Ponad dziesiêæ lat temu sformu³owano hipotezê kaskady amyloidowej (ang. amyloid cascade hypothesis) [41], wed³ug której obecnoœæ z³ogów amyloidowych w tkankach mózgu powoduje najwczeœniejsze i krytyczne zmiany patogenne istotne dla rozwoju choroby Alzheimera. W ci¹gu ostatniej dekady dokonano istotnego postêpu w badaniach nad genez¹ AD. Stwierdzono, e choroba Alzheimera jest syndromem kliniczno-patologicznym spowodowanym defektami w genach bia³ek, które bezpoœrednio lub poœrednio wp³ywaj¹ na ekspresjê bia³ka prekursorowego APP i/lub jego obróbkê proteolityczn¹, lub te maj¹ wp³yw na zmiany stabilnoœci peptydu -amyloidowego i tendencji do jego agregacji. Rezultatem tych procesów jest chroniczny brak równowagi pomiêdzy wytwarzaniem i usuwaniem -amyloidu w komórkach i przestrzeniach miêdzykomórkowych mózgu. Stopniowa akumulacja blaszek amyloidowych wywo³uje patogenn¹ kaskadê przemian takich jak rozrost gleju (glejoza), zapalne zmiany w neuronach/synapsach, utratê w³aœciwoœci przekaÿnikowych neuronu. Przemiany te w efekcie prowadz¹ do œmierci komórki, co klinicznie obserwowane jest jako otêpienie mózgowe. -sekretaza -sekretaza -sekretaza Przes³anki dla hipotezy kaskady amyloidowej Stwierdzono, e jedynie niewielka populacja cz¹steczek APP w zdrowym organizmie ulega sekrecji amyloidogennej. Badania wczesnych zachorowañ na chorobê Alzheimera wskazuj¹, e droga ta jest dominuj¹c¹, gdy w bia³ku APP wystêpuj¹ mutacje, szczególnie w miejscach ciêcia przez -, - i-sekretazy. Mutacje bia³ka APP, szczególnie w pozycjach 670/671 i w domenie transb³onowej (713 717) s¹ przyczyn¹ wydzielania siê d³u szych, toksycznych amyloidów A42 [20]. Tak e mutacje w obrêbie sekwencji A (692 694) prowadz¹ do sekrecji -amyloidu, szczególnie podatnego na agregacjê (Ryc. 3, Tab. 1) [20, 50]. Zidentyfikowano geny presenilin, PS1 [5] i PS2 [15], bia³ek posiadaj¹cych aktywnoœæ -sekretazy. Mutacje w genach, zarówno PS1 jak i PS2, promuj¹ amyloidogenn¹ sekrecjê bia³ka APP, i w konsekwencji, zwiêkszenie iloœci wydzielanego A (Ryc. 4) [13, 36, 44]. Obecne w mózgach pacjentów z chorob¹ Alzheimera sploty neurofibrylarne, zawieraj¹ce g³ównie ufosforylowane bia³ko tau, nie indukuj¹ agregacji A. Stwierdzenie to oparte jest na fakcie, e tworz¹cym siê w znacznych iloœciach z³ogom bia³ka tau, obecnym w mózgach pacjentów z chorob¹ Parkinsona, nie towarzyszy powstawanie Ryc. 3. Centralna domena bia³ka APP. Zaznaczone s¹ miejsca proteolizy za pomoc¹ -, -i-sekretazy. Mutacje amyloidogenne oznaczono kolorem czerwonym [20] z³ogów -amyloidowych. Prawdopodobnie w mózgach pacjentów z chorob¹ Alzheimera sploty neurofibrylarne zawieraj¹ce bia³ko tau tworz¹ siê dopiero w nastêpstwie pojawienia siê z³ogów -amyloidowych [21]. Ponadto stwierdzono, e u myszy transgenicznych z nadekspresj¹ ludzkich bia³ek APP i tau, pojawia siê zwiêkszona iloœæ k³êbków neurofibrylarnych zawieraj¹cych bia³ko tau, taka sama jak dla myszy z nadekspresj¹ jedynie bia³ka tau, podczas gdy iloœæ z³ogów -amyloidowych jest zasadniczo niezmieniona [32]. Posiadanie allelu 4 apolipoproteiny E (apoe4) zwiêksza zagro enie wyst¹pienia choroby Alzheimera [27]. Wed³ug jednej z hipotez, apoe4 rywalizuje z -amyloidem w wi¹zaniu siê do bia³ek usuwaj¹cych te cz¹steczki z przestrzeni miêdzykomórkowych. Brak genu apoe4 obni a iloœæ blaszek -amyloidowych, podczs gdy patogenna forma 4 allelu apoe wywo³uje zmiany w metabolizmie A. Pokazano, e krzy ówka transgenicznej myszy z nadekspresj¹ bia³ka APP z transgeniczn¹ mysz¹ nie zawieraj¹c¹ genu apolipo-

68 B. Nawrot, S. Antoszczyk, M. Sierant Tabela 1. Patogenne mutacje bia³ka APP i zwi¹zane z nimi zmiany fenotypowe [20] Mutacja Fenotyp Wiek wyst¹pienia zmian chorobowych (w latach) N665D AD, tak e niepatogenny 86? K/M670/1N/L (Szwedzka) AD 52 (44 59) T673A normalny nie wystêpuje A692G (Flamandzka) AD lub poudarowy 40 60 (zmienny) E693G AD, tak e niepatogenny 58 E693G (Arktyczna) wy szy poziom z³ogów N/A E693Q (Holenderska) syndrom poudarowy oko³o 50 A713V AD, mo e byæ nietoksyczny 78 A713T Schizofrenia? T714I (Austriacka) Mutacja wp³ywa na miejsce ciêcia -sekretaz¹. In vitro zwiêksza iloœæ A42 w stosunku do A40. W mózgu obecne tylko A42 V715M (Francuska) AD 52 (40 60) I716V (z Florydy) AD 55 V717F AD 47 (42 52) V717G AD 55 (45 62) V717I (Londyñska) AD 55 (50 60) V717L Z³ogi A i NFT œwiadcz¹ce o AD; choroba wyst¹pi³a wczeœniej ni przy innych mutacjach pozycji 717 L723P (Australijska) AD? Objawy w wieku 40 lat, œmieræ w 42 r.. Objawy AD w póÿnych latach 30., œmieræ w latach 40. proteiny E wykazuje obni ony poziom mózgowych blaszek -amyloidowych w potomstwie [2]. Coraz wiêcej jest te dowodów na to, e zachorowalnoœæ na chorobê Alzheimera, zwi¹zana ze starzeniem siê organizmu, zale y od szybkoœci degradacji i usuwania -amyloidu z komórek i tkanek mózgowych [4, 37, 49]. W œwietle przedstawionych danych hipoteza kaskady amyloidowej (Ryc. 5) zak³ada, e w dziedzicznych formach choroby Alzheimera mutacje w genach APP, PS1 i PS2, a w sporadycznych zaburzenia w mechanizmie usuwania A, np. poprzez dziedziczenie genu apoe4, prowadz¹ do zwiêkszonego wytwarzania d³u szych form peptydu -amyloidowego (A42) i jego akumulacji w tkankach i komórkach mózgowych. A42 ma zwiêkszon¹ tendencjê do tworzenia osadów i rozproszonych p³ytek amyloidowych w porównaniu do krótszych form A (A40). Powstaj¹ce agregaty A42 prawdopodobnie wywo³uj¹ subtelne zmiany w komórkach neuronalnych i zmieniaj¹ wydajnoœæ synaptyczn¹ w przekazywaniu sygna³ów elektrycznych. Efektem tych oddzia³ywañ mo e byæ aktywacja wytwarzania cytokin w astrocytach i komórkach mikrogleju lub bezpoœrednie uszkodzenia synaps i neuronów poprzez zmienione warunki równowagi jonowej (zmieniona iloœæ jonów wapnia), a tak e uszkodzenia spowodowane obecnoœci¹ wolnych rodników. Zmiany te prowadz¹ do zwiêkszonej aktywnoœci kinaz i fosfataz, szczególnie kinaz bia³kowych fosforyluj¹cych bia³ko tau. Pojawiaj¹ siê ufosforylowane formy bia³ka tau, które wykazuj¹ tendencjê do agregacji w sploty neurofibrylarne, dodatkowo uszkadzaj¹ce neurony. Zmiany te w efekcie prowadz¹ do rozszerzania siê zaburzeñ w funkcjonowaniu neuronów i obumierania komórek z deficytem przekaÿników. Argumenty przeciwko hipotezie kaskady amyloidowej Niektórzy badacze uwa aj¹, e œmieræ neuronów spowodowana jest raczej wewn¹trzkomórkow¹ toksycznoœci¹ A42 podczas proteolizy APP, lub te zwi¹zana jest z toksycznoœci¹ zewn¹trzkomórkowych form oligomerów A, jeszcze przed ich agregacj¹ do blaszek amyloidowych. -Amyloidy w tym przypadku s¹ raczej produktami przejœciowymi, a nie bezpoœrednimi czynnikami wywo³uj¹cymi utratê neuronów. Potwierdzeniem tej hipotezy

HAMOWANIE EKSPRESJI -SEKRETAZY SZANS NEUROPROTEKCJI W CHOROBIE ALZHEIMERA 69 Ryc. 4. Struktury transb³onowych bia³ek o aktywnoœci -sekretazy. S¹ to niedawno zsekwencjonowane preseniliny PS1 i PS2. Mutacje w presenilinach (zaznaczone kolorem czerwonym) zwiêkszaj¹ iloœæ wydzielanego toksycznego -amyloidu [20]

70 B. Nawrot, S. Antoszczyk, M. Sierant DZIEDZICZNE FORMY CHOROBY ALZHEIMERA Amyloidogenne mutacje w genach APP, PS1, PS2 Wzrastaj¹cy poziom A 42 w ci¹gu ca³ego ycia SPORADYCZNE FORMY CHOROBY ALZHEIMERA Zaburzenia mechanizmu usuwania A (n.p. dziedziczenie genu apoe4, uszkodzenia w degradacji A ) Oligomeryzacja A i odk³adanie siê rozproszonych blaszek amyloidowych w korze mózgowej Subtelny wp³yw oligomerów A na skutecznoœæ synaptyczn¹ w przekazywaniu sygna³ów Dalsze odk³adanie siê blaszek amyloidowych w przestrzeniach miedzykomórkowych Stopniowo wzrastaj¹cy poziom A 42 w mózgu Aktywacja systemu odpornoœciowego komórek mózgowych; pojawienie siê komórek zapalnych astrocytów i komórek mikrogleju; zaburzona równowaga jonowa w neuronach; uszkodzenia komórek wolnymi rodnikami Zmieniona aktywnoœæ enzymów komórkowych kinaz i fosfataz Propagacja uszkodzeñ neuronów, utrata komórek nerwowych, zaburzenia w przekazywaniu sygna³ów PIERWSZE OBJAWY KLINICZNE DEMENCJI (AD) Ryc. 5. Hipoteza kaskady amyloidowej Fosforylacja bia³ka tau; powstawanie NFT 1 MAQALPWLLLWMGAGVLPAHG TQHGIRLPLRSGLGGAPLGLRLPRETDEE 51 PEEPGRRGSFVEMVDNLRGKSGQGYYVEMTVGSPPQTLNILV DTGSSNFA 101 VGAAPHPFLHRYYQRQLSSTYRDLRKGVYVPYTQGKWEGELGTDLVSIPH 151 GPNVTVRANIAAITESDKFFINGSNWEGILGLAYAEIARPDDSLEPFFDS 201 LVKQTHVPNLFSLQLCGAGFPLNQSEVLASVGGSMIIGGIDHSLYTGSLW 251 YTPIRREWYYEVIIVRVEINGQDLKMDCKEYNYDKSIVDSGTTNLRLPKK 301 VFEAAVKSIKAASSTEKFPDGFWLGEQLVCWQAGTTPWNNIFPVISLYLMG 351 EVTNQSFRITILPQQYLRPVEDVATSQDDCYKFAISQSSTGTVMGAVIME 401 GFYVVFDRARKRIGFAVSACHVHDEFRTAAVEGPFVTLDMEDCGYNIPQT 451 DESTLMTIAYVMAAICALFMLPLCLMVCQWRCLRCLRQQHDDFADDISLL 501 K Miejsce odciêcia peptydu sygna³owego Domena transmembranowa Pro-peptyd Bia³ko transb³onowe sk³ada siê z 501 aa (~70 kda) Domena C-koñcowa umieszczona jest w czêœci cytoplazmatycznej (485-501aa) Domena transb³onowa zawiera aminokwasy 461-477 Miejsca N-glikozylacji Gln153, Gln172, Gln223 i Gln354 (N) Bia³ko zawiera dwie typowe dla aktywnoœci proteaz aspartylowych domeny katalityczne DTGS (43-46) i DSGT (289-292) Optimum aktywnoœci w ph 5.5 Ryc. 6. Sekwencja i w³aœciwoœci protezay aspartylowej Asp2 (BACE, memapsyna 2). Zaznaczone s¹ miejsca tworzenia mostków disiarczkowych () s¹ badania histopatologiczne, w których stwierdzono, e ubytek komórek nerwowych jest nieadekwatny do iloœci blaszek amyloidowych. Tak wiêc proteoliza APP, jak i tworzenie siê -amyloidu s¹ istotne dla procesu AD, jednak e utrata komórek neuronalnych wywo³uj¹ca objawy choroby, nie jest spowodowana jedynie toksycznoœci¹ A42, zawartego w blaszkach amyloidowych [7]. Sugeruje siê tak e, e A42 jest jedynie poœrednio toksyczny dla neuronów [48] i nie blaszki amyloidowe, a rozpuszczalna wewn¹trzkomórkowa forma A42, poprzez oddzia³ywania z bia³kiem p53, jest czynnikiem patogennym dla komórki mózgowej [53]. Wp³yw zmniejszonej iloœci -sekretazy i -amyloidu na neurony Do po³owy lat dziewiêædziesi¹tych nie by³ dostêpny aden lek hamuj¹cy rozwój choroby Alzheimera. Obecnie ponad 20 zwi¹zków o ró norodnym mechanizmie dzia³ania poddawanych jest testom klinicznym [12, 23]. W laboratoriach najwiêkszych firm farmaceutycznych œwiata, takich jak Glaxo- SmithKline, Novartis i Merck, poszukuje siê skutecznych terapeutyków zdolnych do hamowania degeneracji komórek nerwowych i/lub do redukcji istniej¹cych zaburzeñ czynnoœci mózgu. Nowe mo liwoœci pojawi³y siê w momencie zsekwencjonowania genu i sklonowania -sekretazy bia³ka odpowiedzialnego za tworzenie siê -amyloidu. Sformu³owano hipotezê, i zahamowanie aktywnoœci tego bia³ka mo e skutecznie obni aæ wydzielanie siê toksycznego -amyloidu, i w konsekwencji stanowiæ efektywn¹ drogê ochrony neuronów przed szkodliwym dzia³aniem blaszek -amyloidowych [9, 11, 29, 43]. Szczególnie zachêcaj¹cy by³ wynik badañ nad myszami knock-out, których genom nie zawiera³ genu -sekretazy [40]. Stwierdzono, e myszy te s¹ zdrowe i nie wykazuj¹ zmian fenotypowych w porównaniu z myszami kontrolnymi (badano morfologiê ró nych komórek i tkanek, w tym obraz tkanek mózgowych; analizowano sk³ad chemiczny krwi i moczu, morfologiê krwi, zachowanie i odruchy nerwowe). Hodowle komórek nerwowych, pobranych z kory mózgowej takich myszy nie wykazywa³y w³aœciwej dla -sekretazy aktywnoœci proteolitycznej. Brak takiej aktywnoœci nie powodowa³ fenotypowych defektów komórek mózgu. Wykazano te, e zawartoœæ peptydów -amyloidowych by³a znacznie ni sza w hodowlach komórek nerwowych myszy knock-out. Dlatego enzym ten jest doskona³ym celem dla badañ w obszarze poszukiwania nowych terapeutyków anty-amyloidowych [9].

HAMOWANIE EKSPRESJI -SEKRETAZY SZANS NEUROPROTEKCJI W CHOROBIE ALZHEIMERA 71 Charakterystyka -sekretazy Dwa lata temu zsekwencjonowano gen -sekretazy i scharakteryzowano w³aœciwoœci bia³ka [26, 33, 42, 47, 52]. -Sekretaza to transb³onowa proteaza aspartylowa Asp2, zwana tak e bia³kiem BACE (ang. -site APP cleaving enzyme) lub memapsyn¹ 2, o d³ugoœci 501 aminokwasów (Ryc. 6). Asp2 zawiera dwa motywy centrum katalitycznego DTGS (aminokwasy 93 96) i DSGT (aminokwasy 289 292), charakterystyczne dla proteaz aspartylowych i wykazuje oko³o 30% homologiê z bia³kami rodziny pepsyn komórkowych proteaz aspartylowych. Zidentyfikowano tak e bia³ko BACE2, wykazuj¹ce 64% homologiê z bia³kiem BACE (teraz nazwanym BACE1), i posiadaj¹ce C-terminaln¹ domenê transb³onow¹. Obydwa te bia³ka stanowi¹ now¹ rodzinê proteaz aspartylowych (Ryc. 7). Wykazano, e bia³ko BACE2 nie odgrywa zasadniczej roli w wytwarzaniu -amyloidu [14, 52]. Terapeutyczne kwasy nukleinowe w hamowaniu wytwarzania -amyloidu Znajomoœæ sekwencji koduj¹cej -sekretazy otworzy³a tak e mo liwoœci wykorzystania dostêpnych strategii terapeutycznych z u yciem kwasów nukleinowych. Narzêdzia molekularne s³u ¹ce do hamowania biosyntezy patogennych bia³ek i znajduj¹ce siê w zasiêgu naszych mo liwoœci, to pochodne kwasów nukleinowych, syntetyczne oligonukleotydy. Istnieje kilka mo liwych podejœæ terapeutycznych z wykorzystaniem tych narzêdzi molekularnych. Informacja genetyczna zawarta w j¹drze komórkowym (w DNA) jest przepisywana w procesie transkrypcji na sekwencjê informacyjnego RNA (mrna), Inhibitory -sekretazy W wielu laboratoriach na œwiecie trwaj¹ intensywne poszukiwania skutecznego inhibitora hamuj¹cego aktywnoœæ -sekretazy. Dotychczasowe badania prowadzone s¹ w obszarze krótkich peptydów o sekwencji homologicznej do sekwencji bia³ka APP, rozpoznawanej przez -sekretazê. Inhibitory peptydowe Inhibitory peptydowe s¹ krótkimi peptydami o sekwencji homologicznej do fragmentu bia³ka APP rozpoznawanego przez -sekretazê. W natywnej sekwencji dekapeptydu SEVKM/DAEF proteoliza zachodzi pomiêdzy Met671 i Asp672. Zbadano, e oktapeptyd EVNL/AAEF, zawieraj¹cy mutacjê szwedzk¹ (K670N i M671L) oraz niehydrolizowalne (hydroksymetylenowe) wi¹zanie peptydowe w miejscu ciêcia, wykazuje silne powinowactwo do -sekretazy i jest bardzo dobrym inhibitorem tego bia³ka (sta³a inhibicji Ki = 9,58 nm) [17, 18]. Peptyd ten sta³ siê podstaw¹ do dalszych poszukiwañ bardziej efektywnych, niskocz¹steczkowych inhibitorów -sekretazy [45]. Wykazano, e inhibitory stanowi¹ce substraty dla -sekretazy charakteryzuj¹ siê równie znacznym powinowactwem do innych proteaz aspartylowych, kluczowych dla prawid³owego funkcjonowania zdrowej komórki. Ponadto, wydaje siê, e dotychczas zidentyfikowane inhibitory -sekretazy nie posiadaj¹ koniecznych w³aœciwoœci leku, w szczególnoœci nie przekraczaj¹ bariery krew-mózg. Dlatego te problem znalezienia nowych, specyficznych i wysoce selektywnych inhibitorów proteazy aspartylowej Asp2 jest wci¹ otwarty. Ryc. 7. Drzewo rodziny proteaz aspartylowych. Bia³ka BACE1 i BACE2 stanowi¹ now¹ rodzinê transb³onowych proteaz aspartylowych, spokrewnionych z proteazami z rodziny pepsyn. Proteazy aspartylowe retrovirusów (asp MMLV, HIV i RSV) wykazuj¹ dalekie pokrewieñstwo z bia³kami BACE1 i BACE2 Ryc. 8. Terapeutyczne kwasy nukleinowe jako molekularne narzêdzia hamowania ekspresji genów niepo ¹danych bia³ek. Terapia antygenowa skierowana jest na dwuniciowe, genomowe DNA. Oligonukleotydy TFO (ang. triplex forming oligonucleotides) tworz¹ kompleks wed³ug regu³ Hoogsteena i hamuj¹ ekspresjê genu na etapie transkrypcji. Zahamowanie ekspresji genu na etapie translacji odbywa siê poprzez ukierunkowan¹ degradacjê niechcianego mrna. Proces niszczenia matrycy jest osi¹gniêty poprzez aktywnoœæ oligonukleotydów antysensowych, katalitycznych kwasów nukleinowych (rybozymów i deoksyrybozymów) oraz poprzez wyciszanie genów na drodze interferencji RNA (RNAi). W strategiach skierowanych na degradacjê mrna syntetyczny lub endogennie generowany oligonukleotyd rozpoznaje komplementarn¹ sekwencjê poprzez wi¹zania Watsona-Cricka i w wyniku w³asnej aktywnoœci katalitycznej lub aktywacji komórkowych rybonukleaz prowadzi do hydrolizy wi¹zania internukleotydowego w docelowym mrna

72 B. Nawrot, S. Antoszczyk, M. Sierant które z kolei jest matryc¹ przepisywan¹ na sekwencjê tworz¹cego siê ³añcucha polipeptydowego (Ryc. 8). 1. Terapia antygenowa (ang. antigene) wykorzystuje oligonukleotydy TFO (ang. triplex forming oligonucleotides) do hybrydyzacji z dwuniciowym DNA i utworzenia trwa³ego trypleksu hamuj¹cego proces transkrypcji [19]. 2. Terapia antysensowa (ang. antysense) polega na tworzeniu komplementarnych dupleksów antysensowy DNA/mRNA i aktywacji RNazy H degraduj¹cej RNA w takich kompleksach. Konsekwencj¹ jest inhibicja ekspresji genu na etapie translacji [46]. 3. Efekt niszczenia matrycy translacyjnej mo na osi¹gn¹æ wykorzystuj¹c rybozymy i deoksyrybozymy. Cz¹steczki te rozpoznaj¹ komplementarn¹ sekwencjê substratu w sposób analogiczny do oligonukleotydów antysensowych i degraduj¹ mrna poprzez katalityczn¹ hydrolizê lub trans- -estryfikacjê wi¹zania internukleotydowego [8]. 4. Najnowsz¹, bardzo atrakcyjn¹ strategi¹ terapeutyczn¹ wyciszania ekspresji genów na etapie translacji jest wykorzystanie zjawiska interferencji RNA. Syntetyczne dupleksy RNA (ang. M NO EM Rz-1 Rz-1i Rz-2 Rz-2i BACE GAPDH short interfering RNA sirna) podawane do komórek ssaczych wywo³uj¹ efekt wyciszania ekspresji genu komplementarnego do antysensowej nici sirna. W procesie tym bierze udzia³ kompleks bia³kowy RISC zawieraj¹cy zarówno helikazy RNA jak i rybonukleazy [6]. W Zak³adzie Chemii Bioorganicznej CBMiM PAN w odzi uzyskano pierwsze wyniki doœwiadczeñ nad hamowaniem ekspresji genu bia³ka BACE w ludzkich komórkach embrionalnych nerki (ang. human embrional kidney cells) HEK293 za pomoc¹ endogennie generowanych rybozymów typu hammerhead [38]. Skonstruowano dwa plazmidy bakteryjne puc-ke-trna-cte koduj¹ce rybozymy Rz-1 i Rz-2, skierowane na dwie ró ne sekwencje docelowe mrna bia³ka BACE. W komórkach transfekowanych tymi plazmidami zaobserwowano ponad 95% obni enie iloœci mrna bia³ka BACE, podczas gdy iloœæ mrna -sekretazy by³a niezmieniona w komórkach transfekowanych rybozymami nieaktywnymi, zawieraj¹cymi mutacje w centrum katalitycznym, b¹dÿ te w komórkach transfekowanych sam¹ lipofektyn¹ lub lipofektyn¹ z pustym plazmidem (Ryc. 9). Wynik ten potwierdzono metod¹ Western blottingu, okreœlaj¹c iloœæ bia³ka BACE w ekstraktach bia³kowych z komórek transfekowanych w analogiczny sposób. W tym przypadku iloœæ bia³ka BACE obni y³a siê do oko³o 90% po podaniu plazmidów koduj¹cych rybozymy, w porównaniu z transfekcjami kontrolnymi. Nieco ni - szy poziom inhibicji ekspresji genu -sekretazy osiagniêto stosuj¹c do transfekcji komórek HEK293 syntetyczny sirna (Ryc. 10). Wzglêdna iloœæ produktu reakcji RT-PCR (%) 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 NO EM Rz-1 Rz-1i Rz-2 Rz-3 Ryc. 9. Okreœlenie poziomu ekspresji mrna bia³ka BACE w komórkach HEK293 transfekowanych plazmidami puc-ke- -trna-cte-rz-1 i Rz-2 (odpowiednio Rz-1 i Rz-2) oraz ich nieaktywnymi analogami (Rz-1i i Rz-2i) za pomoc¹ metody RT PCR. Kontrolnie komórki transfekowano tylko lipofektyn¹ (NO) lub lipofektyn¹ i pustym plazmidem puc-ke-trna-cte (EM). Ca³kowite RNA izolowano z komórek 36 godz. po transfekcji. Reakcje RT PCR prowadzono w warunkach kompetycyjnych z dwoma parami primerów (dla bia³ka BACE i dla bia³ka kontrolnego GAPDH) 120% 100% 80% 60% 40% 20% 0% K 12 24 36 48 60 72 h K 12 24 36 48 60 72 h BACE GAPDH Ryc. 10. Analiza poziomu ekspresji genu bia³ka BACE w komórkach HEK293, transfekowanych sirna (35 nm) za pomoc¹ metody RT PCR. 72 Godz. po transfekcji komórek obserwuje siê spadek poziomu mrna bia³ka BACE do 40% w porównaniu z kontrol¹ (transfekcja komórek jednoniciowym RNA, nie wywo³uj¹cym efektu wyciszania eksperesji genu docelowego)

HAMOWANIE EKSPRESJI -SEKRETAZY SZANS NEUROPROTEKCJI W CHOROBIE ALZHEIMERA 73 Ponadto nasze badania wskazuj¹, e ni sza zawartoœæ -sekretazy w komórkach HEK293 ma istotny wp³yw na iloœæ produktów sekrecji bia³ka prekursorowego APP. Stwierdzono, e iloœæ -amyloidu wydzielanego do pod³o a komórkowego obni a siê do poziomu oko³o 15%, a w ekstraktach komórkowych do poziomu 60%, w porównaniu z zawartoœci¹ -amyloidu w doœwiadczeniach kontrolnych [39]. Skuteczne zahamowanie biosyntezy bia³ka BACE, i w konsekwencji obni enie poziomu toksycznego -amyloidu, mo e stanowiæ istotn¹ przes³ankê do badañ nad znalezieniem efektywnych terapeutyków zapobiegaj¹cych tworzeniu siê z³ogów amyloidowych u osób cierpi¹cych na chorobê Alzheimera. Perspektywy projektowania nowych leków w prewencji choroby Alzheimera G³ównym celem projektowania nowych leków w terapii choroby Alzheimera jest inhibicja pierwszego etapu kaskady amyloidowej, prowadz¹cego do produkcji toksycznego -amyloidu, za który przede wszystkim odpowiedzialna jest -sekretaza. W³aœnie to bia³ko jest g³ównym celem w terapii anty-amyloidowej. Istniej¹ pewne argumenty przeciwko u yciu bia³ka -sekretazy jako celu inhibicji. Nale y zadaæ wa ne pytanie czy inhibicja BACE jest odpowiedni¹ strategi¹ dla terapeutycznej interwencji w AD. Jest prawdopodobne, e bia³ko BACE posiada kilka substratów, innych ni APP, których produkty hydrolizy pe³ni¹ wa ne funkcje fizjologiczne. Inhibicja BACE mia³aby wówczas toksyczne konsekwencje dla organizmu. Trangeniczne myszy nie posiadaj¹ce genu BACE1, oprócz zahamowania tworzenia -amyloidu, nie wykazuj¹ adnych innych ró nic morfologicznych, anatomicznych, histologicznych, hematologicznych itd. Równie analiza zachowañ nie wykaza³a zmian neurologicznych czy fizjologiczych. Dlatego te przypuszcza siê, e inhibicja -sekretazy, przynajmniej w organizmie myszy nie powoduje wyraÿnych zmian fenotypowych. Inne substraty i produkty aktywnoœci nie s¹ istotne lub te s¹ zastêpowane przez dodatkowe mechanizmy. Poszukiwania inhibitorów id¹ w kierunku ma³ych organicznych cz¹steczek, które mog³yby specyficznie hamowaæ aktywnoœæ -sekretazy, w szczególnoœci posiada³yby zdolnoœæ pokonywania bariery krew-mózg. Obecnie dostêpne informacje na temat krystalicznej struktury domeny katalitycznej bia³ka BACE1, skompleksowanej z inhibitorem peptydowym, mog¹ byæ bardzo pomocne w projektowaniu nowych inhibitorów [25]. Ca³kowita struktura enzymu jest bardzo podobna do struktur wystêpuj¹cych w innych proteazach aspartylowych, natomiast istniej¹ szczegó³owe ró nice miejsca aktywnego, które jest generalnie bardziej otwarte i mniej hydrofobowe. Jednak doœwiadczenia w poszukiwaniu specyficznych inhibitorów innych proteaz aspartylowych, w szczególnoœci proteazy aspartylowej wirusa HIV wskazuj¹, e badania te s¹ d³ugie i bardzo pracoch³onne. Obiecuj¹ce w tych poszukiwaniach mo e byæ zastosowanie metody wyciszania ekspresji genów za pomoc¹ zjawiska RNAi. W ubieg³ym roku ukaza³o siê kilka prac opisuj¹cych inhibicjê kilku wybranych genów w komórkach neuronalnych, co stwarza perspektywê zastosowania krótkich interferuj¹cych RNA do specyficznego wyciszania ekspresji genów bia³ek patogennych w chorobie Alzheimera [30, 51]. Niniejsza praca zosta³a finansowana z funduszu grantu PBZ-KBN-059/T09/09 i grantu European Commission 5th Framework Programme no. 2001-02774. Piœmiennictwo 1. Alzheimer A.: Über eine eigenartige Erkrankung der Hirnrinde. Centralblatt fûr Nervenheilkunde und Psychiatrie, 1907, 30, 177 179. 2. Bales K.R., Verina T., Dodel R.C., Du Y., Altstiel L., Bender M., Hyslop P., Johnstone E.M., Little S.P., Cummins D.J., Piccardo P., Ghetti B., Paul S.M.: Lack of apolipoprotein E dramatically reduces amyloid betapeptide deposition. Nat. Genet., 1997, 17, 263 264. 3. Barger S.W., Fiscus R.R., Ruth P., Hofmann F., Mattson M.P.: Role of cyclic GMP in the regulation of neuronal calcium and survival by secreted forms of -amyloid precursor. J. Neurochem., 1995, 64, 2087 2096. 4. Bastianetto S., Quirion R.: Natural extracts as possible protective agents of brain aging. Neurobiol. Aging, 2002, 23, 891 897. 5. Calenda A., Mestre-Frances N., Czech C., Pradier L., Petter A., Bons N., Bellis M.: Molecular cloning, sequencing, and brain expression of the presenilin 1 gene in Microcebus murinus. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1996, 228, 430 439. 6. Capodici J., Kariko K., Weissman D.: Inhibition of HIV-1 infection by small interfering RNA-mediated RNA interference. J. Immunol., 2002, 169, 5196 5201. 7. Carter J., Lippa C.F.: Beta-amyloid, neuronal death and Alzheimer s disease. Curr. Mol. Med., 2001, 1, 733 737. 8. Christoffersen R.E., Marr J.J.: Ribozymes as human therapeutic agents. J. Med. Chem., 1995, 38, 2023 2037. 9. Citron M.: -Secretase as a target for the treatment of Alzheimer s Disease. J. Neurosci. Res., 2002, 70, 373 379. 10. Citron M., Diehl T.S., Gordon G., Biere A.L., Seubert P., Selkoe D.J.: Evidence that the 42- and 40-amino acid forms of amyloid beta protein are generated from the beta-amyloid precursor protein by different protease activities. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1996, 93, 13170 13175. 11. De Strooper B., Koenig G.: Alzheimer s disease. A firm base for drug development. Nature, 1999, 402, 471 472. 12. Evans J.: New paths to Alzheimer s drugs. Chemistry in Britain, 2001, April, 47 51.

74 B. Nawrot, S. Antoszczyk, M. Sierant 13. Ezquerra M., Carnero C., Blesa R., Oliva R.: A novel presenilin 1 mutation (Leu166Arg) associated with early-onset Alzheimer disease. Arch. Neurol., 2000, 57, 485 488. 14. Farzan M., Schnitzler C.E., Vasiliewa N., Leung D., Choe H.: BACE2, a -secretase homolog, cleaves at the -site and within the amyloid -region of the amy - loid- precursor protein. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 2000, 97, 9712 9717. 15. Finckh U., Muller-Thomsen T., Mann U., Eggers C., Marksteiner J., Meins W., Binetti G., Alberici A., Hock C., Nitsch R.M., Gal A.: High prevalence of pathogenic mutations in patients with early-onset dementia detected by sequence analyses of four different genes. Amer. J. Hum. Genet., 2000, 66, 110 117. 16. George-Hyslop P.S.: Otêpienna uk³adanka. Œwiat Nauki (Scientific American), 2001, 2, 56 63. 17. Ghosh A.K., Bilcer G., Harwood C., Kawahama R., Shin D., Hussain K.A., Hong L., Loy J.A., Nguyen C., Koelsch G., Ermolieff J., Tang J.: Structure-based design: potent inhibitors of human brain memapsin 2 (beta-secretase). J. Med. Chem., 2001, 44, 2865 2868. 18. Ghosh A.K., Shin D., Downs D., Koelsch G., Lin X., Ermolieff J., Tang J.: Design of Potent Inhibitors for Human Brain Memapsin2 (-secretase). J. Amer. Chem. Soc., 2000, 122, 3522 3523. 19. Giovannangeli C., Helene C.: Progress in developments of triplex-based strategies. Antisense Nucleic Drug Dev., 1997, 7, 413 421. 20. Hardy J.: www.alzforum.org. 21. Hardy J., Duff K., Hardy K.G., Perez-Tur J., Hutton M.: Genetic dissection of Alzheimer s disease and related dementias: amyloid and its relationship to tau. Nat. Neurosci., 1998, 1, 355 358. 22. Hardy J., Selkoe D.J.: The amyloid hypothesis of Alzheimer s Disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science, 2002, 297, 353 356. 23. Haugabook S.J., Yager D.M., Eckman E.A., Golde T.E., Younkin S.G., Eckman C.B.: High throughput screens for the identification of compounds that alter the accumulation of the Alzheimer s amyloid beta peptide (Abeta). J. Neurosci. Methods, 2001, 108, 171 179. 24. Hendriks L., Van Broeckhoven Ch.: A beta A4 amyloid precursor protein gene and Alzheimer s disease. Eur. J. Biochem., 1996, 237, 6 15. 25. Hong L., Koelsch G., Lin X., Wu S., Terzyan S., Ghosh A.K., Zhang X.C., Tang J.: Structure of the protease domain of memapsin 2 (beta-secretase) complexed with inhibitor. Science, 2000, 290, 150 153. 26. Hussain I., Powell D., Howlett D.R., Tew D.G., Meek T.D., Chapman C., Gloger I.S., Murphy K.E., Southan C.D., Ryan D.M., Smith T.S., Simmons D.L., Walsh F.S., Dingwall C., Christie G.: Identification of a novel aspartic protease (Asp 2) as beta-secretase. Mol. Cell Neurosci., 1999, 14, 419 427. 27. Hyman B.T., West H.L., Rebeck G.W., Buldyrev S.V., Mantegna R.N., Ukleja M., Havlin S., Stanley H.E.: Quantitative analysis of senile plaques in Alzheimer disease: observation of log-normal size distribution and molecular epidemiology of differences associated with apolipoprotein E genotype and trisomy 21 (Down syndrome). Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1995, 92, 3586 3590. 28. Jarrett J.T., Berger E.P., Lansbury P.T. Jr.: The carboxy terminus of the beta amyloid protein is critical for the seeding of amyloid formation: implications for the pathogenesis of Alzheimer s disease. Biochemistry, 1993, 32, 4693 4697. 29. Kahana J.: A new BACE for therapy of Alzheimer s disease. Trends Cell Biol., 2001, 11, 192. 30. Krichevsky A.M., Kosik K.S.: RNAi functions in cultured mammalian neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2002, 99, 11926 11929. 31. Kummer C., Wehner S., Quast T., Werner S., Herzog V.: Expression and potential function of beta-amyloid precursor proteins during cutaneous wound repair. Exp. Cell Res., 2002, 280, 222 232. 32. Lewis J., Dickson D.W., Lin W.L., Chisholm L., Corral A., Jones G., Yen S.H., Sahara N., Skipper L., Yager D., Eckman C., Hardy J., Hutton M., McGowan E.: Enhanced neurofibrillary degeneration in transgenic mice expressing mutant tau and APP. Science, 2001, 293, 1487 1491. 33. Lin X., Koelsch G., Wu S., Downs D., Dashti A., Tang J.: Human aspartic protease memapsin 2 cleaves the beta-secretase site of beta-amyloid precursor protein. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 2000, 97, 1456 1460. 34. Mattson M.P., Cheng B., Culwell A.R., Esch F.S., Lieberburg I., Rydel R.E.: Evidence for excitoprotective and intraneuronal calcium-regulating roles for secreted forms of the -amyloid precursor protein. Neuron, 1993, 10, 243 254. 35. Mattson M.P., Furukawa K.: Alzheimer s disease. Short precursor shortens memory. Nature, 1997, 387, 457 458. 36. Murrell J.R., Hake A.M., Quaid K.A., Farlow M.R., Ghetti B.: Early-onset Alzheimer disease caused by a new mutation (V717L) in the amyloid precursor protein gene. Arch. Neurol., 2000, 57, 885 887. 37. Myers A., Holmans P., Marshall H., Kwon J., Meyer D., Ramic D., Shears S., Booth J., DeVrieze F.W., Crook R., Hamshere M., Abraham R., Tunstall N., Rice F., Carty S., Lillystone S., Kehoe P., Rudrasingham V., Jones L., Lovestone S., Perez-Tur J., Williams J., Owen M.J., Hardy J., Goate A.M.: Susceptibility locus for Alzheimer s disease on chromosome 10. Science, 2000, 290, 2304 2305. 38. Nawrot B., Antoszczyk S., Maszewska M., Rebowski G., Kuwabara T., Warashina M., Taira K., Stec W.J.: Modulation of -secretase gene expression by action of catalytic nucleic acids. Nucleic Acids Res., 2002, Suppl. 2, 105 106. 39. Nawrot B., Antoszczyk S., Maszewska M., Rebowski G., Kuwabara T., Warashina M., Taira K., Stec W.J., Efficient inhibition of beta-secretase (BACE) gene expression in HEK293T cells by trna Val -driven and CTE-helicase associated hammerhead ribozymes. Publikacja przes³ana do J. Biol. Chem. 40. Roberds S.L., Anderson J., Basi G., Bienkowski M.J., Branstetter D.G., Chen K.S., Freedman S.B., Frigon N.L., Games D., Hu K., Johnson-Wood K., Kappenman K.E., Kawabe T.T., Kola I., Kuehn R., Lee M., Liu W., Motter R., Nichols N.F., Power M., Robertson D.W., Schenk D., Schoor M., Shopp G.M., Shuck M.E., Sinha S., Svensson K.A., Tatsuno G., Tintrup H., Wijsman J., Wright S., McConlogue L.: BACE knock-out mice are healthy despite lacking the primary beta-secretase ac-

HAMOWANIE EKSPRESJI -SEKRETAZY SZANS NEUROPROTEKCJI W CHOROBIE ALZHEIMERA 75 tivity in brain: implications for Alzheimer s disease therapeutics. Hum. Mol. Genet., 2001, 10, 1317 1324. 41. Selko D.J.: The molecular pathology of Alzheimer s disease. Neuron, 1991, 6, 487 498. 42. Sinha S., Anderson J.P., Barbour R., Basi G.S., Caccavello R., Davis D., Doan M., Dovey H.F., Frigon N., Hong J., Jacobson-Croak K., Jewett N., Keim P., Knops J., Lieberburg I., Power M., Tan H., Tatsuno G., Tung J., Schenk D., Seubert P., Suomensaari S.M., Wang S., Walker D., John V. et al.: Purification and cloning of amyloid precursor protein beta-secretase from human brain. Nature, 1999, 402, 537 540. 43. Skovronsky D.M., Lee V.M.-L.: -Secretase revealed: starting gate for race to novel therapies for Alzheimer s disease. Trends Pharmacol. Sci., 2000, 21, 161 163. 44. Smith M.J., Gardner R.J., Knight M.A., Forrest S.M., Beyreuther K., Storey E., McLean C.A., Cotton R.G., Cappal R., Masters C.L.: Early-onset Alzheimer s disease caused by a novel mutation at codon 219 of the presenilin-1 gene. Neuroreport, 1999, 10, 503 507. 45. Turner R.T. 3ed, Koelsch G., Hong L., Castanheira P., Ermolieff J., Ghosh A.K., Tang J.: Subsite specificity of memapsin 2 (beta-secretase): implications for inhibitor design. Biochemistry, 2001, 40, 10001 10006. 46. Uhlmann E., Peyman A.: Antisense oligonucleotides: a new therapeutic principle. Chem. Rev., 1990, 90, 544 584. 47. Vassar R., Bennett B.D., Babu-Khan S., Kahn S., Mendiaz E.A., Denis P., Teplow D.B., Ross S., Amarante P., Loeloff R., Luo Y., Fisher S., Fuller J., Edenson S., Lile J., Jarosinski M.A., Bier A.L., Curran E., Burgess T., Louis J.C., Collins F., Treanor J., Rogers G., Citron M.: Beta-secretase cleavage of Alzheimer s amyloid precursor protein by the transmembrane aspartic protease BACE. Science, 1999, 286, 735 741. 48. Walsh D.T., Montero R.M., Bresciani L.G., Jen A.Y., Leclercq P.D., Saunders D., EL-Amir A.N., Gbadamoshi L., Gentleman S.M., Jen L.S.: Amyloid-beta peptide is toxic to neurons in vivo via indirect mechanisms. Neurobiol. Dis., 2002, 10, 20 27. 49. Wavrant-DeVrieze F., Lambert J.C., Stas L., Crook R., Cottel D., Pasquier F., Frigard B., Lambrechts M., Thiry E., Amouyel P., Tur J.P., Chartier-Harlin M.C., Hardy J., Van Leuven F.: Association between coding variability in the LRP gene and the risk of late-onset Alzheimer s disease. Hum. Genet., 1999, 104, 432 434. 50. Wisniewski T., Ghiso J.: Frangione B Peptides homologous to the amyloid protein of Alzheimer s disease containing a glutamine for glutamic acid substitution have accelerated amyloid fibril formation. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1991, 180, 1528. 51. Xia H., Mao Q., Paulson H.L., Davidson B.L.: sirna- Mediated gene silencing in vitro and in vivo. Nat. Biotech., 2002, 20, 1006 1010. 52. Yan R., Bienkowski M.J., Shuck M.E., Miao H., Tory M.C., Pauley A.M., Brashier J.R., Stratman N.C., Mathews W.R., Buhl A.E., Carter D.B., Tomasselli A.G., Parodi L.A., Heinrikson R.L., Gurney M.E.: Membraneanchored aspartyl protease with Alzheimer s disease beta-secretase activity. Nature, 1999, 402, 533 537. 53. Zhang Y., McLaughlin R., Goodyer C., LeBlanc A.: Selective cytotoxicity of intracellular amyloid beta peptide1-42 through p53 and Bax in cultured primary human neurons. J. Cell Biol., 2002, 156, 519 529.