Temat 12-13: Mikrobiologia osadu czynnego Aby zaliczyć to ćwiczenie student powinien: znać podział metod oczyszczania ścieków; wiedzieć, co to jest osad czynny i flokulacja; umieć scharakteryzować morfologię kłaczka (wielkość, kształt, struktura, nitkowatość); umieć opisać sukcesję mikroorganizmów w osadzie czynnym; znać rolę poszczególnych grup drobnoustrojów w oczyszczaniu ścieków i ich znaczenie wskaźnikowe w ocenie pracy osadu; wiedzieć co to jest i od czego zależy puchnięcie włókniste i niewłókniste osadu; znać pojęcie indeksu osadu czynnego. Wyróżnia się trzy zasadnicze metody oczyszczania ścieków : mechaniczne, chemiczne i biologiczne. W konkretnej oczyszczalni mogą być wykorzystane wszystkie wymienione sposoby lub niektóre z nich. W oczyszczalniach biologicznych zanim ścieki zostaną poddane działaniu mikroorganizmów, są wstępnie oczyszczane na drodze mechanicznej np. na kratach, w osadnikach czy piaskownikach. Istnieją cztery stopnie oczyszczania ścieków : I stopień - oczyszczanie mechaniczne, polegające na usuwaniu zanieczyszczeń stałych, do zawiesin opadających włącznie, II stopień - oczyszczanie biologiczne usuwające zanieczyszczenia rozpuszczone, III stopień - usuwanie związków biogennych (głównie soli azotu i fosforu), IV stopień - usuwanie resztkowych zanieczyszczeń trudno rozkładalnych, tzw. związków refrakcyjnych (ten stopień oczyszczania określany jest jako odnowa wody). Biologiczne oczyszczanie ścieków opiera się na naturalnych procesach samooczyszczania, które zachodzą w każdym zbiorniku wodnym oraz w glebie, głównie dzięki aktywności drobnoustrojów. Jednak zdolności samooczyszczania są często niewystarczające do unieszkodliwienia tak dużych ilości ścieków, jakie powstają w wyniku działalności człowieka. Dlatego w biologicznym oczyszczaniu dużych ładunków zanieczyszczeń intensywność procesów samooczyszczania musi być zwielokrotniona metodami inżynieryjnymi. Metody oczyszczania wykorzystujące specjalne urządzenia intensyfikujące te naturalne procesy określa się jako sztuczne, natomiast metody oparte wyłącznie na procesach samooczyszczania nazywane są metodami naturalnymi. Część naturalnych sposobów oczyszczania ścieków ma charakter pośredni ze względu na pewien stopień ingerencji człowieka w proces. Do naturalnych metod oczyszczania należą m. in.: nawadnianie szerokoprzestrzenne pól, filtry gruntowe, stawy ściekowe i oczyszczalnie hydrobotaniczne (np. trzcinowe). Do sztucznych biologicznych metod oczyszczania należą: złoża biologiczne i osad czynny. Sztuczne metody biologicznego oczyszczania ścieków, podobnie jak naturalne, wykorzystują procesy samooczyszczania zachodzące w naturze, jednak ze zwielokrotnioną intensywnością. Np. procesy przebiegające w złożach biologicznych przypominają samooczyszczanie w glebie (udoskonalone filtry gruntowe ), a metoda osadu czynnego opiera się na podobnych zjawiskach zachodzących w środowisku wodnym (ulepszone stawy ściekowe ). Osad czynny jest metodą oczyszczania, w której elementem oczyszczającym są bakterie zlepione w kłaczki zawieszone w środowisku płynnym (ścieki). Kłaczki osadu powstają podobnie jak błona biologiczna, w wyniku łączenia się bakterii zooglealnych wytwarzających lepki śluz. Proces tworzenia się kłaczków, zwany flokulacją, zachodzi spontanicznie w trakcie napowietrzania komory wypełnionej ściekami.
W oczyszczalniach pracujących metodą osadu czynnego ścieki, po oczyszczaniu mechanicznym w osadniku wstępnym, są kierowane do komory osadu czynnego, zwanej też komorą napowietrzania, gdzie odbywa się właściwe oczyszczanie biologiczne. Kłaczki osadu wchodzą tu w kontakt ze ściekami w warunkach sztucznego napowietrzania i intensywnego mieszania. Bakterie obecne w kłaczkach pochłaniają substancję organiczną ze ścieków i część jej zużywają jako paliwo (źródło energii), część natomiast przyswajają jako materię budulcową, co prowadzi do zwiększenia biomasy. Efektem tych procesów jest mineralizacja ścieków i wzrost masy osadu czynnego. Wykorzystanie zanieczyszczeń przez bakterie osadu czynnego. Po kilku godzinach przetrzymywania ścieków w komorze, są one przepuszczane do osadnika wtórnego, w którym zachodzi oddzielenie kłaczków od oczyszczonych ścieków. Kłaczki osadzają się na dnie osadnika i są recyrkulowane albo z powrotem do komory napowietrzania, by utrzymać stężenie biomasy (osad powrotny), albo do osadnika wstępnego i wraz z osadem wstępnym usuwane z obiegu oraz unieszkodliwiane (osad nadmierny). Układ technologiczny procesu osadu czynnego przedstawia rysunek: Układ oczyszczalni ścieków z osadem czynnym: 1 - osadnik wstępny, 2 - komora osadu czynnego, 3 - osadnik wtórny, 4 - stacja pomp osadowych, Qść - ścieki, Qn - osad nadmierny, Qr - osad powrotny Jako, że elementem oczyszczającym w tej metodzie są kłaczki zlepionych bakterii, dlatego ważne jest, aby proces flokulacji przebiegał prawidłowo i aby powstałe kłaczki miały odpowiednią wielkość, kształt i strukturę. Flokulacja zależy od stopnia obciążenia osadu ładunkiem zanieczyszczeń. Przy bardzo wysokim i bardzo niskim obciążeniu obserwuje się bowiem zjawisko deflokulacji, czyli rozpraszania się bakterii skupionych w kłaczki. Gdy osad jest nadmiernie obciążony, kłaczki są nie dotlenione, natomiast w przypadku niedociążenia bakterie giną z braku pokarmu. Wielkość kłaczków jest istotną cechą wpływającą na efektywność oczyszczania. Zależą od niej dwa ważne procesy: biosorpcja (pochłanianie zanieczyszczeń ) i sedymentacja (opadanie kłaczków). Biosorpcja jest etapem poprzedzającym biodegradację i zależy od wielkości powierzchni kłaczków. Powierzchnia ta jest tym większa, im kłaczki są mniejsze. Jednak zbyt małe kłaczki, choć mają dużą powierzchnię sorpcyjną, źle opadają w osadniku wtórnym. Może to prowadzić do wtórnego zanieczyszczenia odbiornika, do którego odprowadza się oczyszczone, ale nie oddzielone od kłaczków ścieki. Natomiast kłaczki zbyt duże, choć świetnie sedymentują, to jednocześnie słabo oczyszczają ścieki. Wynika to z faktu, że bakterie umieszczone w centralnej części dużego kłaczka mają utrudniony dostęp do tlenu i zanieczyszczeń będących substratem pokarmowym. Kłaczki muszą więc wykazywać właściwy stan rozdrobnienia zapewniający odpowiednie warunki tlenowe i pokarmowe. Kształt kłaczków jest cechą, która może wskazywać na pewne niekorzystne zjawiska w osadzie. Np. kształt gwiaździsty, pierzasty czy siatkowaty wiążą się zwykle z obecnością
mikroorganizmów nitkowatych (głównie bakterii i grzybów), których obecność w osadzie jest niepożądana, gdyż powodują jego puchnięcie. Struktura kłaczka może być spoista bądź luźna. W warunkach niedotlenienia lub braku pokarmu kłaczki przybierają formę zbitych, obłonionych tworów koloru szarego. Obecność takich kłaczków w osadzie powoduje spadek jego aktywności. Wiele różnych czynników powoduje rozluźnienie kłaczków. Należą do nich: rozwój form nitkowatych, nadmiar lub niedostatek tlenu, przeciążenie osadu lub warunki głodowe. Niekorzystnym zjawiskiem obniżającym zdolności sedymentacyjne kłaczków jest puchnięcie osadu czynnego. Z puchnięciem mamy do czynienia, gdy zwiększa się objętość osadu przy zachowaniu tej samej masy. Liczbowo wyraża to indeks osadu, który przedstawia objętość (w cm 3 ) jednego grama jego suchej masy. Indeks wyraża więc gęstość osadu, lub stopień uwodnienia. Jeden gram suchej masy dobrze pracującego osadu czynnego ma zwykle objętość 67 cm 3 (indeks = 67 cm 3 /g). Indeks osadu spuchniętego mieści się w granicach od 100-400 cm 3 /g. Spuchnięty osad jest co prawda bardzo aktywny (duża powierzchnia biosorpcyjna), jednak z powodu obniżonej opadalności nie może być on oddzielony od oczyszczonych ścieków w osadniku wtórnym. Wiele jest przyczyn puchnięcia osadu. Bezpośrednią przyczyną tego zjawiska mogą być organizmy nitkowate, bakterie zooglealne, rozproszenie kłaczków lub wzrost lekkości osadu spowodowany wydzielaniem się pęcherzyków gazu. Organizmy nitkowate (głównie bakterie i grzyby) wywołują tzw. puchnięcie włókniste. Zwykle dochodzi do niego, gdy skład ścieków jest niewłaściwy (zbyt duże ilości węglowodanów w stosunku do azotu i fosforu), w sytuacji przeciążenia osadu, nagłych zmian obciążenia, niedotlenienia, zakwaszenia, zatrucia, obniżenia temperatury lub niedostatecznie długiego przetrzymywania osadu w komorze napowietrzania. Do najczęściej spotykanych mikroorganizmów nitkowatych należą bakterie: Sphaerotilus, Beggiatoa i promieniowce. Mniej poznanym zjawiskiem jest puchnięcie niewłókniste. Wywołane jest ono nadmierną produkcją pozakomórkowych substancji śluzowych przez pewne bakterie zooglealne. Śluzy te wiążą bardzo dużo wody, co sprawia, że osad jest czterokrotnie silniej uwodniony niż w przypadku spuchnięcia włóknistego. Zwiększenie indeksu osadu może też spowodować rozproszenie kłaczków w wyniku zbyt silnej turbulencji w komorze lub też wynoszenie osadu w osadniku wtórnym. Z tym drugim przypadkiem mamy do czynienia, gdy osad jest zbyt długo przetrzymywany w osadniku i dochodzi do rozwoju beztlenowych bakterii denitryfikacyjnych wydzielających pęcherzyki azotu cząsteczkowego. Bakterie tworzące kłaczki nie są jedynymi organizmami występującymi w osadzie czynnym. Oprócz bakterii występują tu liczne pierwotniaki i wrotki, rzadziej robaki, pierścienice i grzyby. Biocenoza osadu czynnego ma charakter heterotroficzny. Piramida przedstawiająca zależności troficzne w osadzie czynnym. Bazą pokarmową całego zespołu organizmów jest materia organiczna dopływająca wraz ze ściekami. Pierwszy poziom troficzny tworzą bakterie heterotroficzne, grzyby i pierwotniaki saprotroficzne (korzenionóżki i wiciowce), które odżywiają się materią organiczną w postaci roztworów i zawiesin. Drugi poziom stanowią pierwotniaki holozoiczne (gr.holos - cały) odżywiające się całymi mikroorganizmami. Należą tu orzęski. Wreszcie, najwyższy poziom troficzny zajmują orzęski drapieżne (zwłaszcza osiadłe gatunki z grupy Suctoria, które zjadają pierwotniaki bakteriożerne), a także bezkręgowce takie, jak wrotki, robaki z grupy nicieni i in. Organizmy obecne we wpracowanym osadzie czynnym tworzą zespół, który powstał w wyniku procesu sukcesji. Początkowo w ściekach obecne są głównie bakterie, wiciowce (Zooflagellata) i korzenionóżki (ameby) (Rhizopoda), a więc organizmy odżywiające się materią organiczną zawartą w ściekach. Z czasem pojawiają się orzęski (Ciliata) zjadające
bakterie i drapieżne. Z orzęsków najwcześniej rozwijają się formy wolno pływające, pożerające bakterie, które nie zlepiły się jeszcze w kłaczki (nie sflokulowane). W następnym etapie, gdy proces flokulacji jest już zaawansowany, pojawiają się formy osiadłe orzęsków (przyczepione do kłaczków). W ostatnim etapie rozwijają się wrotki (Rotatoria). Opisane przemiany ilustruje wykres: Sukcesja mikroorganizmów podczas hodowli osadu czynnego Znajomość przemian sukcesyjnych w osadzie oraz właściwości biologicznych mikroorganizmów jest przydatna w ocenie pracy oczyszczalni. Służy do tego analiza mikroskopowa próbki osadu, obejmująca, oprócz opisu wyglądu kłaczków, również badanie składu mikrofauny. Stwierdzenie dużej liczebności wiciowców i ameb (korzenionóżek), a więc pierwotniaków pionierskich, świadczy o przeciążeniu osadu i jego niedotlenieniu (a więc o warunkach przypominających początkowe etapy rozwoju osadu). Występowanie orzęsków natomiast, zwykle świadczy o dobrej pracy osadu. Dotyczy to zwłaszcza form osiadłych. Orzęski bakteriożerne wywierają stałą presję na populacje bakteryjne, które pobudzane są przez to do ciągłych podziałów. Wynikiem tego jest odmładzanie się flory bakteryjnej i jej zwiększona aktywność metaboliczna. Poza tym orzęski przyczyniają się do klarowania ścieków zjadając nie sflokulowane bakterie. Obecność w osadzie wrotków zwykle świadczy o dobrym natlenieniu osadu i jego stabilizacji.
CZĘŚĆ PRAKTYCZNA Zadanie 1. Oznaczenie objętości osadu czynnego 1. Do leja Imhoffa wlać 1 dm 3 zawartości komory osadu czynnego 2. Pozostawić osad na 30 min. w celu sedymentacji 3. Określić objętość osadu czynnego. Wyniki podać w [cm 3 /dm 3 ]. Zadanie 2. Oznaczanie suchej masy osadu czynnego 1. Pobrać 10 cm 3 zawartości komory osadu czynnego i filtrować przez zważone i wysuszone w 105 0 C sączki bibułowe. 2. Po przefiltrowaniu suszyć sączki z osadem do stałej wagi w temp. 105 0 C. 3. Zważyć sączek z osadem i obliczyć wagę wysuszonego osadu (suchą masę). Wynik podać w [g s.m./dm 3 ]. Zadanie 3. Wyznaczanie indeksu osadu czynnego 3 obj. osadu w 1000cm Indeks obliczyć korzystając ze wzoru: I = 3 sucha masa w g /1000cm Zadanie 4. Badanie aktywności enzymatycznej osadu czynnego a. Aktywność dehydrogenazowa (test TTC) Dehydrogenazy to enzymy katalizujące odłączanie wodoru od utlenianego substratu. Aktywność dehydrogenazową określa się za pomocą sztucznego akceptora wodoru, który przejmuje go od dehydrogenazy i na skutek redukcji zmienia swoje zabarwienie. Tym akceptorem jest chlorek trifenylotetrazolowy TTC. Bezbarwny TTC ulega redukcji do czerwonego formazanu (trifenylofurazonu TF). 1. Do probówki wlać pipetą 1 cm 3 buforu Tris o ph 8,4 i 1 cm 3 osadu czynnego 2. Dodać 0,4 cm 3 roztworu TTC i umieścić probówkę w termostacie o temp. 37 C 3. Inkubować przez 30 min. Pojawienie się czerwonego zabarwienia świadczy o aktywności dehydrogenazowej osadu b. Aktywność oksydazowa W omawianym ćwiczeniu będzie wykrywana pewna specyficzna grupa oksydaz - oksydazy fenolowe. Przenoszą one elektrony i protony ze związków fenolowych na tlen. Związki fenolowe (np.pirokatechina) w wyniku utlenienia przechodzą w chinony, które
ulegają spontanicznej polimeryzacji z wytworzeniem ciemno zabarwionych barwników melaninowych. 1. Wlać do probówki 1 cm 3 osadu czynnego 2. Dodać kilka kropli 1% roztworu pirokatechiny 3. Inkubować w temp. 40 C przez 15 min Pojawienie się brunatnej barwy świadczy o aktywności oksydazowej próby. c. Aktywność katalazowa Katalaza, podobnie jak dehydrogenaza i oksydaza, należy do oksydoreduktaz. Jest to enzym powszechnie występujący w komórkach organizmów tlenowych i jest jednym z najszybciej działających enzymów (rozkłada truciznę H2O2.). Mechanizm działania katalazy polega na oderwaniu tlenu od jednej cząsteczki H2O2 i przeniesieniu go na drugą cząsteczkę H2O2. W efekcie dochodzi do rozpadu obu cząsteczek nadtlenku wodoru i wytworzenia dwu cząsteczek H2O oraz wydzielenia tlenu. Reakcja przebiega następująco: H2O2 + H2O2 KATALAZA 2 H2O + O2 1. Do probówki wprowadzić 1 cm 3 osadu czynnego 2. Dodać kilka kropli roztworu H2O2 i obserwować pojawiające się zmiany. Pojawienie się pęcherzyków gazu (jakiego?) świadczy o aktywności katalazowej. d. Aktywność proteazowa Proteaza jest hydrolazą katalizującą hydrolizę białek. Żelatyna jest białkiem, które pod wpływem proteazy ulega hydrolizie, co przejawia się jej upłynnieniem. 1. Posiać osad metodą kłutą na słupek żelatynowy. 2. Po tygodniu inkubacji w temp. pokojowej sprawdzić, czy żelatyna uległa upłynnieniu. e. Aktywność ureazowa Ureaza jest hydrolazą katalizującą rozkład mocznika CO(NH2)2. W wyniku reakcji uwalniają się grupy aminowe (-NH2)), które w roztworze wodnym przyjmują postać kationów amonowych (NH4 + ) alkalizujących środowisko. Zmiana odczynu na zasadowy, wykrywana zmianą zabarwienia indykatora obecnego w pożywce, pośrednio świadczy o aktywności ureazowej. 1. Wprowadzić ezą próbkę osadu czynnego do pożywki 2. Inkubować w temp. 37 C przez 48 godz. W przypadku aktywności ureazowej pożywka zmieni kolor na amarantowy.
Zadanie 5. Makroskopowa i mikroskopowa analiza osadu czynnego 1. Próbę osadu czynnego ocenić pod względem następujących cech: - barwa osadu, - zapach osadu, - obecność piany, - wygląd cieczy nadosadowej 2. Wykonać preparat przyżyciowy osadu czynnego 3. Obserwować osad pod mikroskopem zwracając uwagę na morfologię kłaczków i skład jakościowy mikrobiocenozy osadu czynnego 4. Wyniki obserwacji wpisać do arkusza