Gen eukariotyczny Działanie i regulacja etapy posttranskrypcyjne 1
Geny eukariotyczne Procesy transkrypcji i translacji są rozdzielone w przestrzeni i czasie Każdy gen ma własny promotor, nie występują operony Proces ekspresji genu składa się z wielu etapów Na każdym z etapów możliwe działanie regulacyjne Informacja kierująca syntezą białka może być modyfikowana po transkrypcji (alternatywne składanie, redagowanie) złożoność proteomu przekracza złożoność genomu 2
Poziom RNA w komórce Rys. dr Monika Zakrzewska-Płaczek, IGiB UW
Obróbka transkryptów poli i poliii Wieloetapowe mechanizmy cięcia rrna jedna jednostka transkrypcyjna, złożona obróbka trna cięcie prekursora na końcu 3 (RNaza Z) i 5 (RNaza P) 4
Obróbka prekursora rrna 5 Zakrzewska-Płaczek et al., Nucleic Acids Res. 2010
Obróbka mrna Czapeczka na końcu 5 Poliadenylacja końca 3 Wycinanie intronów składanie (splicing) Transport z jądra do cytoplazmy Degradacja 6
Transkrypcja i obróbka są sprzężone Tradycyjny obraz ekspresji genu Współczesny obraz ekspresji genu DNA Pre-mRNA Transkrypcja Pol RNA II Cap Transkrypcja i obróbka Pol RNA II Obróbka mrna Cap AAAAAAAAAAAA Cap AAAAAAAAAAAA 7 Rys. dr Zbigniew Domiński, University of North Carolina at Chapel Hill
Sprzężenie transkrypcji i obróbki RNA Na poszczególnych etapach tworzą się kompleksy różnych białek z polimerazą RNA Inicjacja/synteza czapeczki Elongacja/splicing Terminacja/poliadenylacja Kluczowym obszarem jest C-koniec polimerazy II (CTD) regulacja przez fosforylację 8
Transkrypcja i synteza czapeczki/splicing 9 Rys. dr Zbigniew Domiński, University of North Carolina at Chapel Hill
Czapeczka 5 Synteza tuż po inicjacji transkrypcji Istotna dla eksportu i translacji mrna 10
Terminacja i poliadenylacja 11
Terminacja i poliadenylacja 12
Kompleks cięcia i poliadenylacji Cleavage-Polyadenylation Specificity Factor (CPSF) Cleavage stimulation Factor (CstF) STOP CODON 30 100 73 160 AAUAAA Symplekin CA 50 77 64 G/U-rich Fip Poly(A) polymerase 68 25 Cleavage Factor II (CF II) Cleavage Factor I (CF I) 13 Rys. dr Zbigniew Domiński, University of North Carolina at Chapel Hill
Wyd użanie ogona polia Koniec gdy PAP utraci kontakt z CPSF Fip 30 100 73 160 PABP N AAUAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA PABP N PAP 14 Rys. dr Zbigniew Domiński, University of North Carolina at Chapel Hill
5 3 Terminacja mechanizm torpedy Cleavage Factors RNA Pol II Transkrypcja 3 5 CTD Splicing Factors CPSF 73 3 mrna 7 mg 15 Rys. dr Zbigniew Domiński, University of North Carolina at Chapel Hill
Alternatywne miejsce poliadenylacji Mechanizm regulacyjny AAUAAA..G/U rich 3 UTR polya1 polya2 polya3 AUU AUU polya AUU polya Elementy regulatorowe AUU polya 16 Rys. dr Zbigniew Domiński, University of North Carolina at Chapel Hill
Alternatywna poliadenylacja IgM forma błonowa (limfocyty B wczesna faza dojrzewania) forma rozpuszczalna (późna faza dojrzewania limfocyty w osoczu) 17 Rys. dr Zbigniew Domiński, University of North Carolina at Chapel Hill
Poliadenylacja Kontroluje (zwiększa) stabilność mrna Dotyczy większości mrna, wyjątkiem są mrna kodujące histony mrna histonów stabilne w fazie S, pod koniec szybko degradowane synchroniczna regulacja 18 Rys. dr Zbigniew Domiński, University of North Carolina at Chapel Hill
Sk adanie (splicing) Introny fragmenty pierwotnego transkryptu, które są wycinane i nie występują w dojrzałym transkrypcie Większość genów wyższych eukariontów zawiera introny, w przeciętnym genie stanowią przeważającą większość sekwencji transkrybowanej Alternatywne składanie różne kombinacje eksonów dają różne ostateczne transkrypty tego samego genu 19
Sk adanie mrna 20
Mechanizm sk adania 21
Sk adanie mrna W składaniu uczestniczą kompleksy białek i snrna: snrnp 22
snrnp Sm ring E G D3 F B D2 D1 U6 ring 23 Rys. dr Zbigniew Domiński, University of North Carolina at Chapel Hill
Alternatywne sk adanie Wybór różnych miejsc łączenia (tzw. miejsca kryptyczne) Składanie różnych kombinacji eksonów Jeden gen wiele białek Często tkankowo-specyficzne Może powodować wstawienie przedwczesnego STOP mechanizm regulacji 24
Geny wyższych Eukaryota sk adają się g ównie z intronów Exon Pre-mRNA Intron Splicing mrna Średni transkrypt: 27 000 nt/ 9 eksonów Eksony średnio stanowią 5% genu Średni ekson 145 nt Średni intron 3500 nt 25 Rys. dr Zbigniew Domiński, University of North Carolina at Chapel Hill
Jak znaleźć ekson? Rzeczywiste sekwencje często odbiegają od sekwencji najwyższej zgodności (consensus) Miejsce styku 5 Miejsce rozgałęzienia A Miejsce styku 3 5 Ekson A 3 Ekson Miejsce styku 5 Miejsce styku 3 26 Rys. dr Zbigniew Domiński, University of North Carolina at Chapel Hill
Mechanizm definicji eksonu U wyższych Eukaryota długie introny/krótkie eksony definicja eksonu : Kontakt poprzez ekson Intron U2 snrnp A U2AF65 35 YYRYY AG 70K Ekson wewn. GU U1 snrnp Intron 3 ss 5 ss U niższych Eukaryota (np. S. pombe) krótkie introny/długie eksony definicja intronu 27 Rys. dr Zbigniew Domiński, University of North Carolina at Chapel Hill
Sekwencje cis wzmacniające/hamujące splicing + ESE ESS ESE ESE (Exonic Splicing Enhancer) ESS ESS (Exonic Splicing Silencer) + Aktywator składania Represor składania 28 Rys. dr Zbigniew Domiński, University of North Carolina at Chapel Hill
Czynniki trans GU U2 snrnp U2AF65 35 A YRYRYY AG RS RRM 70K U1 snrnp GU Słaby trakt polipirymidynowy 3 ss 5 ss Białka SR aktywatory, wiążą ESE Białka hnrnp represory, wiążą ESS 29 Rys. dr Zbigniew Domiński, University of North Carolina at Chapel Hill
Alternatywne sk adanie - przyk ady Bardzo wiele genów człowieka ~75% genów 1 gen średnio 3 końcowe transkrypty Rekordy Neurexin 3 (człowiek) 2000 alternatywnych transkryptów DSCAM (Drosophila) 40 000 form!!! Amylaza śliniankowa i wątrobowa Tachykininy: neurotransmitery w narządach zmysłów neuropeptyd P w układzie nerwowym neuropeptyd K w tarczycy i jelicie Determinacja płci Drosophila 30
Redagowanie (editing) Zmiana konkretnego nukleotydu w RNA po transkrypcji Częste w organellach roślin i niższych eukariontów Np. apolipoproteina B człowieka Wątroba, białko 4563 aa Jelito, białko 2153 aa 31
Degradacja RNA Stała (obrót RNA) Głównie w cytoplazmie Regulowana Przez małe RNA (sirna, mirna) Przez białka Cytoplazma i jądro Kontrola jakości W jądrze (RNA niekodujące) W jądrze i cytoplazmie (mrna) 32
Degradacja RNA Czas życia mrna jest krótki (średnio 10-20 min. drożdże, kilka godzin ssaki) Różne ścieżki degradacji 3 -> 5 (egzosom) pierwszym etapem jest deadenylacja 5 -> 3 (Xrn) pierwszym etapem usunięcie czapeczki, egzonukleaza 5 ->3 Na stabilność wpływają sekwencję nie podlegające translacji (UTR) i polia Może podlegać regulacji przez czynniki trans 33
Degradacja mrna Rys. dr Monika Zakrzewska-Płaczek, IGiB UW
Kontrola jakości RNA Tylko w pełni obrobione (czapeczka, poliadenylacja, składanie) transkrypty są eksportowane z jądra Transkrypty nieprawidłowo obrobione są degradowane Degradacja transkryptów z przedwczesnym kodonem STOP (NMD nonsense mediated decay) wykrywane nieprawidłowe położenie STOP względem miejsc styku intron/ekson 35
Miejsce degradacji RNA
Mechanizmy kontroli jakości RNA degradacja mrna zawierających przedwczesne kodony stop (NMD- nonsense mediated decay) degradacja mrna z brakującymi kodonami stop (NSDnon-stop decay) degradacja jądrowych mrna i pre-mrna, które: nie uległy prawidłowemu dojrzewaniu (tj. składaniu, dojrzewaniu 3 końca) nie zostały wyeksportowane do cytoplazmy degradacja wadliwych stabilnych RNA (np. rrna) i ich prekursorów 37
Tajemnicze transkrypty - CUT Cryptic Unstable Transcripts Transkrypcji podlegają też długie obszary międzygenowe Często z promotorów genów, tylko w przeciwnym kierunku Szybko degradowane przez egzosom (3 ->5 exo) Rola nieznana, możliwe zaangażowanie w wyciszanie transpozonów, modyfikacje histonów zależne od transkrypcji, regulację (związek z RNAi?) W jądrze są jeszcze inne tajemnicze niestabilne transkrypty (NUT, PAST, XUT itp.) 38
Regulowana degradacja RNA Hartwell, Hood, Goldberg, Reynolds, Silver, Veres. Genetics. From Genes to Genomes. Copyright e McGraw-Hill Companies, Inc. 39
Cia ka P (P-bodies) Struktury w cytoplazmie, w których zachodzi degradacja mrna decapping przechowywanie nieaktywnych translacyjnie mrna miejsce działania mirna Marx J (2005), Science 310: 764-5 40
Po zakończeniu obróbki mrna jest transportowany do cytoplazmy tam ulega translacji Cytoplazma 7 mg AUG UAA AAUAAA polya 5 UTR ORF -sekwencja kodująca 3 UTR 41 Rys. dr Zbigniew Domiński, University of North Carolina at Chapel Hill
Model pętli AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA PABP 1 PABP 1 PABP 1 eif-4e Cap binding protein eif-4g 7 mg eif- 4A eif- 4B eif-3 5 UTR 40S 60S AUG Aktywne translacyjnie mrna tworzą pętlę Kluczowe jest białko eif-4g Kluczowe dla odróżniania prawidłowych mrna i kontroli jakości 42 Rys. dr Zbigniew Domiński, University of North Carolina at Chapel Hill
Translacja Regulowany może być każdy etap translacji Wybór kodonu AUG (nie ma sekwencji S-D, decydują oddziaływania z białkami wiążącymi 5 UTR) Inicjacja Elongacja Terminacja Np. zahamowanie translacji i indukcja GCN4 w odpowiedzi na głodzenie u drożdży 43
Bia ka też podlegają z ożonym modyfikacjom Fałdowanie wspomagane przez białka opiekuńcze Modyfikacje chemiczne (fosforylacja, glikozylacja itp.) Ubikwitynacja i degradacja Naturalna Degradacja źle sfałdowanych białek 44
Nowe role RNA Odkrycie roku 2002 regulacyjna rola małych RNA Nagroda Nobla w dziedzinie medycyny 2006, za odkrycie mechanizmu interferencji RNA A. Fire i C. Mello 45
Interferencja RNA Wyciszanie ekspresji genów przez krótkie dwuniciowe RNA homologiczne do sekwencji genu Może działać na różnych etapach PTGS posttranskrypcyjne wyciszanie genów hamowanie translacji degradacja RNA TGS transkrypcyjne wyciszanie genów wpływ na strukturę chromatyny zmiana aktywności czynników transkrypcyjnych 46
sirna, mirna, strna... sirna (short interfering RNA) pochodzą z dwuniciowych cząsteczek, głównie egzogenne (np. wirusy RNA) mirna (micro RNA) pochodzą z cząsteczek o strukturze szpilki do włosów, kodowane w genomie strna (small temporally regulated RNA) mirna regulujące rozwój (odkryte u nicieni) smrna (small modulatory RNA) reguluje działanie genów w neuronach przez zmianę funkcji białka regulującego transkrypcję (represor aktywator) 47
sirna a mirna sirna egzogenny dsrna (np. wirusa) mirna endogenny dsrna 48
sirna - jak to dzia a? dsrna jest egzogenny Efekt degradacja mrna 49 Hannon G.J.: RNA interference, Nature 418, July 11, 2002
mirna jak to dzia a? dsrna kodowany w genomie Efekt: degradacja mrna (pełna komplementarność) lub hamowanie translacji (częściowa kompl.) rozbicie struktury pętli 50
Cia ka P (P-bodies) przechowywanie nieaktywnych translacyjnie mrna po mirna degradacja niekiedy możliwe odzyskanie nieaktywnych mrna Marx J (2005), Science 310: 764-5 51
mirna Powszechny mechanizm regulacyjny Co najmniej 1000 mirna kodowanych w genomie człowieka Co najmniej 10 000 docelowych transkryptów 1/3 transkryptomu Nie jest wymagana pełna komplementarność Ogólna regulacja: dany mirna działa na wiele docelowych transkryptów np. procesy rozwojowe przerzuty nowotworów 52
Degradacja po cięciu przez RISC 53 Rys. dr Monika Zakrzewska-Płaczek, IGiB UW
Regulacyjne RNA dzia ają też na transkrypcję Efekt zmiana struktury chromatyny 54
RNA też może modyfikowac ekspresję chromosomu 55 Wyciszanie jednej kopii chromosomu X u kobiet przez RNA XIST
Zastosowania Badanie funkcji genów ( odwrotna genetyka ) - szczególnie skuteczne u nicienia Caenorhabditis, ale działa też w komórkach owadów, ssaków i roślin Hamowanie wybranych genów jako metoda leczenia (np. zwalczania wirusów czy nowotworów) 56
RNA a terapia genowa sirna skierowane przeciwko: wirusom (HIV, HCV) zmutowanym genom (np. pląsawica Huntingtona) onkogenom obniżenie poziomu cholesterolu LDL u myszy przez sirna przeciwko apolipoproteinie B 57