Markery molekularne. chronionych chronion i zagrożonych. flory Polski

Anna Rucińska, Jerzy Puchalski, Adam Kapler Markery molekularne w ocenie skuteczności ochrony ex situ wybranych gatunków chronionych i zagrożonych flory Polski Polska Akademia Nauk Ogród Botaniczny - Centrum Zachowania Różnorodności Biologicznej w Powsinie. Markery Markery moleku w ocenie w skutec ocenie ochrony ochrony ex situ wybranych wybranyc gatu chronionych chronion i zagrożonych i zagrożo fl Polski Polski 3

4

Anna Rucińska, Jerzy Puchalski, Adam Kapler Markery molekularne w ocenie skuteczności ochrony ex situ wybranych gatunków chronionych i zagrożonych flory Polski Polska Akademia Nauk Ogród Botaniczny Centrum Zachowania Różnorodności Biologicznej w Powsinie Warszawa 2013

Markery molekularne w ocenie skuteczności ochrony ex situ wybranych gatunków chronionych i zagrożonych flory Polski Polska Akademia Nauk Ogród Botaniczny Centrum Zachowania Różnorodności Biologicznej w Powsinie Anna Rucińska, Jerzy Puchalski, Adam Kapler Polska Akademia Nauk Ogród Botaniczny Centrum Zachowania Różnorodności Biologicznej w Powsinie ul.prawdziwka 2 02-973 Warszawa www.ogrod-powsin.pl bgpas@obpan.eu Autorzy zdjęć: Wiesław Gawryś, Antoni Krzyżewski, Arkadiusz Nowak, Anna Rucińska, Agata Smieja, Piotr Walerowski ISBN 978-83-938900-1-9 Wydawca PAN Ogród Botaniczny - Centrum Zachowania Różnorodności Biologicznej w Powsinie Projekt i skład: www.k13.com.pl Druk: Agencja reklamowa K13 ul. Rabatkowa 53, 94-214 Łódź Drukarnia OLTOM www.oltom.eu Nakład 300 egzemplarzy Warszawa 2013 rok. Praca naukowa finansowana ze środków na naukę w latach 2010-2013 jako projekt badawczy promotorski MNiSW Nr N N304 370038 pt. Molekularna ocena skuteczności i ochrony ex situ dla zachowania różnorodności genetycznej u roślin zagrożonych na przykładzie pszonaka pienińskiego Erysimum pieninicum (Zapał.) Pawł. oraz dzięki wsparciu finansowemu programu Fundacji na Rzecz Nauki Polskiej - Pomost Nr POMOST C20 w ramach Europejskiego Funduszu Rozwoju Regionalnego Dotacje na innowacje, Inwestujemy w waszą przyszłość 6

Istota ochrony bioróżnorodności Ostatnie doniesienia o stanie różnorodności biologicznej na Ziemi wskazują na niepokojące zmiany w ekosystemach i gatunkach, które wystąpiły z największym nasileniem w przeciągu ostatnich 50 lat niż kiedykolwiek wcześniej. Widocznym skutkiem tego jest drastyczny spadek liczby gatunków, określany nawet szóstym masowym wymieraniem. Mimo że tematyka szeroko pojętej ochrony różnorodności biologicznej podejmowana jest od wielu dziesiątek lat, to jednak kompleksowe ujęcie potrzeby wdrażania rozwiązań dla tego typu problemów w skali globalnej zostało poruszone podczas konferencji ONZ Środowisko i Rozwój w 1992 roku w Rio de Janeiro, znanej jako Szczyt Ziemi. Pojęciem kojarzonym z Szczytem Ziemi stała się bioróżnorodność, która została zdefiniowana w ogłoszonym i przyjętym podczas tej konferencji dokumencie o randze międzynarodowej Konwencji o Różnorodności Biologicznej (Convention on Biological Diversity CBD). Zgodnie z założeniami CBD przyjęło się grupować bioróżnorodność na trzech poziomach różnorodność wewnątrzgatunkową (różnorodność genetyczną) wszystkich żyjących populacji, międzygatunkową (różnorodność taksonomiczną) oraz ponadgatunkową (różnorodność zbiorowisk i krajobrazów czy też zwaną ekosystemową lub ekologiczną) (Ryc. 1). 7

Pomijając nasz moralny i etyczny obowiązek ochrony bioróżnorodności, konieczne jest sięgnięcie po argumenty praktyczne, aby uzmysłowić niebezpieczeństwo związane z zaniechaniem i zaniedbaniem naszych zadań wobec świata przyrody. Obecne tempo zmian w środowisku naturalnym nieuchronnie prowadzi do utraty wielu istotnych dla życia i dobrobytu człowieka czynników, takich jak dostęp odpowiedniej ilości ogółu społeczeństwa, aby wspólnie podjęte działania przyniosły jak najlepsze efekty dla zatrzymania dalszej utraty bioróżnorodności na każdym poziomie jej organizacji. Dlatego też trwającą obecnie dekadę nazwano Dekadą Bioróżnorodności i ogłoszono dzień 22 maja Międzynarodowym Dniem Bioróżnorodności. Ponadto aktualna wizja ochrony bioróżnorodności bazuje na próbie wyeksponowania wymiernych jej wartości, Bioróżnorodność Zróżnicowanie wszystkich żywych organizmów pochodzących, inter alia, z ekosystemów lądowych, morskich i innych wodnych ekosystemów oraz zespołów ekologicznych, których są one częścią. wewnątrzgatunkowa (genetyczna) międzygatunkowa (taksonomiczna) ponadgatunkowa (ekosystemowa, ekologiczna) Ryc. 1. Definicja oraz poziomy grupowania bioróżnorodności. i jakości zasobów wodnych, produktów do wyrobu pożywienia, odzieży czy farmaceutyków. Istnieje pilna potrzeba zaangażowania wielu instytucji i organizacji państwowych i pozarządowych oraz przede wszystkim traktując ją osobowo, jako usługodawcę w zakresie zaopatrzenia społeczeństwa w niezbędne do funkcjonowania dobra (żywność, czysta woda i powietrze) (European Commission 2011). W tym aspekcie kluczowe znaczenie dla przyrody i gospodarki ma świat Cele Światowej Strategii Ochrony Świata Roślin GSPC (2011-2020) w zakresie zachowania flory naturalnej Cele szczegółowe (targets): Różnorodność roślin jest natychmiastowo i skutecznie zachowana. Cel 4. Co najmniej 15% różnorodności roślin typowej dla danego ekoregionu i strefy bioklimatycznoroślinnej jest zabezpieczona dzięki skutecznemu zarządzaniu i/lub czynnemu odtwarzaniu. Cel 5. W każdym ze światowych ekoregionów chroni się co najmniej 75% terenów o najwyższej różnorodności roślin i podejmuje się wielorakie działania z zakresu czynnej ochrony przyrody na rzecz zachowania gatunków roślin i ich różnorodności genetycznej. Cel 6. Co najmniej 75% obszarów produkcyjnych w każdym sektorze gospodarki użytkuje się w sposób zrównoważony, przyjazny środowisku, zgodny z celami Strategii dla zachowania różnorodności roślin. Cel 7. Co najmniej 75% znanych gatunków roślin zagrożonych jest chronionych in situ (w parkach narodowych, rezerwatach itd.) Cel 8. Co najmniej 75% znanych gatunków roślin zagrożonych jest chronionych w kolekcjach ex situ, najlepiej działających w kraju ich pochodzenia. Co najmniej 20% z nich będzie dostępne do działań na rzecz realizacji programów wzmocnienia lub odtwarzania populacji naturalnych. Cel 9. 70% różnorodności genetycznej roślin uprawnych i pokrewnych im roślin dziko rosnących oraz innych gatunków roślin o znaczeniu socjoekonomicznym jest zabezpieczone. Cel 10. Powstają i są wprowadzane w życie plany skutecznej walki z gatunkami inwazyjnymi oraz zapobiegania nowym inwazjom biologicznym, a obszary chronione stanowiące ostoje roślinne (IPAs) o największej różnorodności roślin są zabezpieczone przed gatunkami inwazyjnymi. Ryc. 2. Cele szczegółowe Światowej Strategii Ochrony Świata Roślin GSPC (2011-2020) dotyczące jednego z celów głównych: Różnorodność roślin jest natychmiastowo i skutecznie zachowana. 8

roślin, w którym ponad połowa gatunków w przeciągu tego stulecia może być narażona na wymarcie (Bramwell 2007). Szeroko zakrojone działania w skali globalnej, mające na celu przeciwdziałanie dalszemu ubożeniu bioróżnorodności, koordynowane są przez Sekretariat Konwencji o Różnorodności Biologicznej. Natomiast podstawowym dokumentem, opartym o CBD, traktującym o zachowaniu różnorodności flory jest przyjęta w 2002 roku Globalna Strategia Ochrony Świata Roślin Global Strategy for Plant Conservation GSPC (Secretariat CBD 2002, 2010), w której zwrócono szczególną uwagę na konieczność zachowania różnorodności roślin dziko rosnących i uprawnych oraz wyznaczono w tym celu główne zadania, które powinny zostać zrealizowane do 2020 roku (Wyse Jackson i Sharrock 2011) (Ryc. 2). Głównym przedmiotem ochrony różnorodności biologicznej roślin są gatunki i populacje o zagrożonych pulach genowych, świadczące o unikatowości flory danego regionu, charakteryzujące się dużą odrębnością genetyczną, reprezentowane przez gatunki zanikające lub zagrożone, a także małe oraz silnie izolowane populacje lokalne, a więc przede wszystkim endemity i gatunki o wyspowym występowaniu na obszarach swoich zasięgów geograficznych (Puchalski 1998). Decydują one w sposób szczególny o tożsamości przyrodniczej danej jednostki biogeograficznej i jako takie są elementem o podstawowym znaczeniu dla zrozumienia historii, zarówno całych geoflor, jak i flor regionalnych. 9

Różnorodność flory naczyniowej Polski Z perspektywy oceny stopnia zachowania pierwotnie występujących gatunków i zbiorowisk, Polskę można zaliczyć do krajów o stosunkowo dużym zróżnicowaniu przyrodniczym, zwłaszcza na terenach o niskim uprzemysłowieniu. Mimo to, w mniejszym nasileniu, niż ma to miejsce w krajach Europy Zachodniej, ale również w naszym kraju występują zagrożenia różnorodności biologicznej typowe dla procesów cywilizacyjnych. Do najważniejszych z nich należy postępująca urbanizacja, zbyt wolno zmniejszający się poziom zanieczyszczenia poszczególnych elementów środowiska czy niekorzystne zmiany sposobów użytkowania ziemi. Coraz częściej zwraca się uwagę na destrukcyjny wpływ zmian klimatycznych i związaną z tym fragmentację siedlisk i globalne zmiany klimatyczne. Ostatnie wydania Polskiej Czerwonej Księgi Roślin (Kaźmierczakowa i Zarzycki 2001) oraz Czerwonej Listy Roślin i Grzybów Polski (Mirek i in. 2006) przynoszą niepokojące dane dotyczące stanu zagrożenia wymarciem znaczącej części polskiej flory. Tendencje regresywne obserwowane są w przypadku 1648 gatunków roślin. Około 1,7% (38) rodzimych gatunków uznane jest za wymarłe na stanowiskach naturalnych, natomiast prawie dwukrotnie więcej gatunków jest krytycznie zagrożonych (74). Sumaryczna liczba gatunków zagrożonych wymarciem (około 2,5% - 59 gatunków) i narażonych (około 4% - 101 gatunków) stanowi ponad 10% flory Polski (Zarzycki i Szeląg 2006). Jednak na wszystkich regionalnych czerwonych listach uwzględniono łącznie 1686 taksonów, co stanowi 72% całej flory krajowej. Fakt ten sugeruje, że większość z gatunków jest zagrożona regionalnie lub lokalnie (Piękoś Mirkowa 2006). 10

Spośród ponad 2500 rodzimych gatunków i podgatunków roślin naczyniowych, 170 to taksony endemiczne lub subendemiczne, co stanowi około 7% całości flory Polski. Większość z nich (140) to taksony endemiczne dla jednostek geobotanicznych przekraczających granice naszego kraju. Tylko 30 gatunków i podgatunków endemicznych to endemity Polski ograniczone swoim występowaniem do granic naszego kraju (Piękoś Mirkowa i Mirek 2010). Spośród nich w Polskiej Czerwonej Księdze Roślin i na Czerwonej Liście Roślin i Grzybów Polski znalazło się 5: pszonak pieniński, przytulia krakowska i skalnica darniowa bazaltowa, jako narażone na wyginięcie (VU), mniszek pieniński, jako krytycznie zagrożony (CR) oraz wymarła na naturalnym stanowisku warzucha polska (EW). Ogólnie w Polskiej Czerwonej Księdze Roślin figurują 32 endemity i subendemity, lecz po uwzględnieniu taksonów endemicznych, zamieszczonych na regionalnych czerwonych listach i w czerwonych księgach, łączna liczba taksonów endemicznych uznanych za zagrożone na obszarze Polski wzrasta aż do 96, co stanowi 57% wszystkich endemitów i subendemitów występujących w naszym kraju (Piękoś Mirkowa i Mirek 2010). Na tle innych obszarów o wyjątkowej różnorodności flory naczyniowej Polski szczególnie wyróżniają się Jura Krakowsko Częstochowska (ok. 1600 gatunków), Tatry (ok. 1300 gatunków) i Pieniny (ok. 1200 gatunków) (Michalik 1974). Uderzającym rysem bioróżnorodności Jury i Pienin jest współwystępowanie dwu grup typów organizmów o wprost przeciwnych wymaganiach środowiskowych - zimnolubnych i cienioznośnych gatunków górskich oraz ciepłolubnych, światłożądnych gatunków kserotermicznych. Ogromna rozmaitość mikroklimatów, mikrosiedlisk, łatwość przenikania gatunków z sąsiednich pasm górskich i niżu na Jurze Krakowsko Częstochowskiej decyduje o bogactwie bioróżnorodności tego regionu, dla którego charakterystycznymi elementami są taksony autogeniczne, jak warzucha polska, przytulia krakowska, brzoza Szafera lub wykraczające poza Jurę - brzoza ojcowska i modrzew polski. Jura jest najwybitniejszym obok Gór Świętokrzyskich centrum występowania roślin górskich poza Karpatami i Sudetami, na przykład storczycy kulistej, znanej z Doliny Sąspowskiej czy długosza królewskiego (Puszcza Dulowska), w tym także posiadających tu jedne z nielicznych poza Karpatami stanowisk: lulecznicy kraińskiej, tojada mołdawskiego, storzana bezlistnego, goryczki trojeściowej, przenęta purpurowego, przetacznika górskiego, kostrzewy leśnej, miesiącznicy trwałej czy śnieżycy wiosennej karpackiej. Natomiast niezwykła flora Pienin zawdzięcza swoje bogactwo sąsiedztwu Tatr, Wyżyn i Nizin Polski, bardzo ciepłemu mikroklimatowi, silnie zróżnicowanej topografii terenu oraz swoistemu wapiennemu podłożu (Strojny 1987; Nyka 2006; Mirek i Piękoś-Mirkowa 2008; Zarzycki i Wróbel 2012). Na cenne elementy Pienin składa się kilka grup gatunków, w tym relikty flory przedholoceńskiej (złocień Zawadzkiego, jałowiec sawina, sosna zwyczajna reliktowa), gatunki (mniszek pieniński, pszonak pieniński), podgatunki i odmiany endemiczne (chaber barwny pieniński, piołun pieniński, rozchodnik ostry wapienny) oraz subendemiczne (modrzew polski, miejscowa forma mokrzycy szczeciolistnej), gatunki kserotermiczne (dwulistnik muszy, mokrzyca szczeciolistna, pępawa różyczkolistna, krwawnik szczecinkolistny), rzadkie gatunki świetlistej dąbrowy (dzwonecznik wonny, miodownik melisowaty) czy rzadkie gatunki łąkowe (mieczyk dachówkowaty, okrzyn szerokolistny) (Pawłowski 1972; Nyka 2006). Mimo stosunkowo gęstej sieci obszarów chronionych w formie parków narodowych, rezerwatów i pomników przyrody w obrębie Wyżyny Krakowsko Częstochowskiej i Pienin uzasadnione wydaje się być zabezpieczenie różnorodności genetycznej wielu cennych elementów ich flory w warunkach ex situ, zwłaszcza, że nierzadko charakteryzują się one małymi zasięgami i niewielkimi oraz nielicznymi populacjami. 11

Formy zabezpieczania różnorodności roślin Alarmujący stan różnorodności świata roślin, gdzie prawie jedna trzecia wszystkich gatunków roślin flory światowej jest zagrożona wymarciem (Pitman i Jørgensen 2002), zmusza do wdrożenia wszelkich czynności niezbędnych dla jej zabezpieczenia. Ogólnie działania te grupują się w obrębie dwóch form: in situ i ex situ (Dulloo i in. 2010). Pierwsza z nich obejmuje ochronę gatunków w miejscu ich naturalnego występowania, druga poza nimi (Ryc. 3). Programy zachowawcze pul genowych gatunków wysokiego ryzyka wymarciem opierają się przede wszystkim na ochronie in situ, w środowisku ich naturalnego występowania. Niewątpliwą zaletą tej formy ochrony jest zapewnienie istnienia naturalnych interakcji między gatunkami oraz, co najważniejsze, możliwość zabezpieczenia całego bogactwa ekosystemu. Realizacja tej strategii wiąże się z tworzeniem obszarów chronionych. Przybierają one szereg form organizacyjnych. W powszechnym użyciu są takie kategorie jak: parki natury, parki krajobrazowe, rezerwaty przyrody, obszary chronionego krajobrazu, pomniki przyrody, obszary krajobrazowo przyrodnicze czy użytki ekologiczne. Metoda in situ nie chroni jednak przed takimi zagrożeniami jak czynniki chorobotwórcze, szkodniki, zjawiska atmosferyczne czy konkurencja ze strony gatunków inwazyjnych (Heywood i Dulloo 2005). Zdarza się także, że naturalne stanowiska gatunków o wysokim statusie konserwatorskim mieszczą się poza obszarem chronionym i tym samym są bezpośrednio poddane destruktywnemu działaniu czynników otoczenia, w tym również antropogenicznych. Dlatego też działania z zakresu ochrony różnorodności gatunkowej flory coraz częściej nakierowane są na ochronę ex situ. Konwencja o Różnorodności Biologicznej (CBD) zwróciła szczególną uwagę na znaczenie tej formy ochrony jako uzupełnienie powszechnie stosowanej ochrony w warunkach in situ, a w Globalnej Strategii Ochrony Świata Roślin (GSPC) nakreślono Strategie ochrony różnorodności roślin In situ Wzmocnienie Odtworzenie Ex situ Banki genów nasiona, kultury in vitro, pyłek, DNA Ochrona gatunku w miejscu jego naturalnego występowania. Kolekcje Ochrona gatunku poza miejscem jego naturalnego występowania. Kolekcje żywych roślin ogrody botaniczne i arboreta Działalność naukowo-badawcza botanika, ekologia, genetyka, biologia gatunku Uprawa Protokoły zabezpieczenia materiału z populacji in situ,protokoły rozmnażania materiału do kolekcji. Edukacja Programy edukacyjne dla podnoszenia świadomości społecznej o bogactwie flory naturalnej. Ryc. 3. Strategie ochrony różnorodności roślin. 12

konkretne zadania dla zachowania różnorodności flory w warunkach ex situ. Należy również zauważyć, że ochrona ex situ może być podstawową metodą zabezpieczenia różnorodności genetycznej (Schemske i in. 1994), co akcentuje jej definicja: ochrona ex situ to zabezpieczenie różnorodności genetycznej gatunku poza miejscem jego występowania Heywood i Iriondo (2003). Jednak w dobie nieustającej utraty, degradacji i przekształceń środowiska, konieczne jest zwrócenie uwagi na ochronę ex situ jako niekiedy jedyną możliwą formę zachowania gatunku, szczególnie, że sieć obszarów chronionych, podlegająca także zmianom, może nie zagwarantować długotrwałego zachowania różnorodności biologicznej (Parga i in. 1996; Tilman i Lehman 2001). Priorytetowym obiektem troski konserwatorskiej są szczególnie gatunki o wysokim stopniu zagrożenia wymarciem, endemiczne, reliktowe, o występowaniu wyspowym, także pochodzące ze skrajnych środowiskowo stanowisk, jak również taksony o niskiej tolerancji na zmiany klimatyczne. W ostatnim czasie zaczęto zwracać więcej uwagi także na gatunki decydujące o unikatowym charakterze flory danego regionu, a występujące powszechnie (Hawkins i in. 2008). Bardziej dalekowzroczne perspektywy ochrony ex situ biorą również pod uwagę prognozy do 2080 roku, alarmujące o zagrożeniu połowy flory europejskiej do tego czasu (Guisan i Thuiller 2005). W przypadku niektórych gatunków zabezpieczenie ich różnorodności genetycznej poza miejscem ich naturalnego występowania bądź powstania, i ewentualnie poddanych reintrodukcji czy metaplantacji, jest niekiedy jedynym sposobem na zachowanie ich w naturze. Forma ochrony ex situ z założenia posiada charakter konserwatorski i jako wspierająca metodę in situ, ma na celu zabezpieczenie materiału rozmnożeniowego danego taksonu dla jego ewentualnej reintrodukcji bądź wzmocnienia jego populacji naturalnych. Dlatego materiał ten powinien odzwierciedlać możliwie najpełniej pierwotną różnorodność genetyczną (Booy i in. 2000), a sposób jego przechowywania zminimalizować ryzyko wprowadzenia jakichkolwiek zmian na poziomie genotypów (Husband i Campbell 2004; Menges i in. 2004). Najczęściej stosowaną formą ochrony ex situ jest uprawa w postaci kolekcji żywych roślin utrzymywanych w gruncie lub szklarniach, głównie w ogrodach botanicznych (Ryc. 3). Coraz częściej dla zabezpieczenia w formie ex situ pul genowych gatunków zagrożonych stosuje się techniki przechowywania diaspor w warunkach niskich i ultraniskich temperatur (kriokonserwacja), co wcześniej zostało sprawdzone i z powodzeniem stosowane głównie dla zachowania zasobów genowych roślin użytkowych (Linington 2009). Zdarza się, że nasiona przechowywane są w temperaturze pokojowej, zazwyczaj jednak do długoterminowego ich zabezpieczenia wykorzystuje się ujemne temperatury (od -20 o C w przypadku komór zamrażalniczych do -196 o C w przypadku ciekłego azotu). Nasiona przechowywane w warunkach kriogenicznych mogą zachować swoją żywotność przez bardzo długi czas, nawet ponad kilkaset lat (Roos i in. 1996), ale wymaga to uprzedniego ich przygotowania poprzez wysuszenie do poziomu 3 7% zawartości wody. Tym samym metoda ta jest użyteczna dla nasion, które tolerują wysuszenie i niskie temperatury (nasiona typu orthodox) (Puchalski 2000). W przypadku niektórych grup i gatunków roślin, których nasiona są wrażliwe na suszenie i niskie temperatury (nasiona typu recalcitrant), rozmnażających się głównie wegetatywnie lub o długiej fazie juwenilnej ochrona ex situ bazuje na narzędziach biotechnologicznych (tzw. conservation biotechnology ), umożliwiając długoterminowe przechowywanie materiału w warunkach kultur in vitro w ultraniskich temperaturach (Pence 2005). Inne strategie zachowania różnorodności roślin, takie jak banki pyłku i banki DNA, są rzadziej stosowane i posiadają głównie charakter wspierający inną strategię ochrony ex situ dla danego gatunku, chociażby dlatego, że informacje zawarte w materiale genetycznym są bezcenne dla pełnego rozpoznania i dokumentacji różnorodności roślin (taksonomia, systematyka, filogenetyka, ekologia) oraz prawidłowo prowadzonego monitoringu stanu populacji (Dulloo i in. 2006). 13

Znaczenie ogrodów botanicznych w ochronie różnorodności roślin Misję zachowania różnorodności roślin w warunkach ex situ powierzono przede wszystkim ogrodom botanicznym i arboretom, jako instytucjom o największym doświadczeniu i długiej tradycji w gromadzeniu, zbiorze i przechowywaniu materiału genetycznego roślin rodzimych i obcego pochodzenia. Ostatnie wydanie dokumentu przewodniego dla ogrodów botanicznych o randze międzynarodowej International Agenda for Botanic Garden in Conservation (BGCI 2012) podaje szereg funkcji ogrodów botanicznych, lecz zwraca szczególną uwagę na konieczność prowadzenia ochrony ex situ jako formy dopełniającej i wspomagającej ochronę in situ (Ryc. 4). Zdarza się, że ogrody botaniczne stają się jedynym miejscem występowania niektórych gatunków i z tej perspektywy należałoby uznać niekiedy wyższość ochrony ex situ w stosunku do ochrony in situ i traktować ją jako bardziej niezawodną w aspekcie konserwatorskim (Pavlick 1997; Pritchard i Harrop 2010). W skrajnych przypadkach kolekcje botaniczne stanowić by mogły swoistą Arkę Noego dla roślin, umożliwiając przetrwanie wymarłego gatunku w przyrodzie. 14

Główne kierunki działalności współczesnych ogrodów botanicznych w zakresie zachowania flory naturalnej Zachowanie w kolekcjach ex situ roślin zagrożonych Prowadzenie badań nad biologią gatunków zagrożonych i skuteczność ochrony ex situ Tworzenie banków genów roślin dziko rosnących (polowe banki genów, banki nasion, banki kultur tkankowych, banki DNA) Ryc. 4. Główne kierunki działalności ogrodów botanicznych w zakresie zachowania flory naturalnej. Sygnalizuje się konieczność podjęcia przez ogrody botaniczne intensyfikacji działań ochronnych dla zachowania różnorodności roślin. Koordynację ich działalności na arenie międzynarodowej prowadzi specjalnie w tym celu powołana w 1987 roku organizacja znana w skrócie jako BGCI (Botanic Gardens Conservation International). Skupiając ponad 700 instytucji ze 118 krajów, wydaje szereg dokumentów, w tym poradników dla udoskonalenia działań konserwatorskich, ujednolicenia strategii konserwatorskich oraz wspólnej polityki konserwatorskiej. Duże znaczenie ma prowadzona przez BGCI międzynarodowa baza roślin PlantSearch Base, zawierająca informacje o kolekcjach ex situ występujących w ponad 600 ogrodach botanicznych z całego świata, połączona z innymi bazami danych, w tym także internetową bazą Czerwonej Listy Roślin IUCN (The IUCN Red List web site, www.iucnredlist.org). Dzięki współpracy największych światowych ogrodów botanicznych, w tym Royal Botanic Gardens Kew i Missouri Botanical Garden tworzona jest dokumentacja wszystkich gatunków roślin na świecie (http://www.theplantlist.org/). Szacuje się, że w kolekcjach ex situ żywych roślin w skali światowej zabezpieczono około 80 tys. gatunków roślin, w tym 10 tys. gatunków zagrożonych zgodnie z kryteriami IUCN (www.bgci.org). W kolekcjach polskich ogrodów botanicznych uprawia się obecnie 275 gatunków roślin zagrożonych (61.7%), 299 gatunków prawnie chronionych (74%) i 23 gatunki z listy Konwencji Berneńskiej (67.7%) (Puchalski i Gawryś 2007). Ze względu na problemy związane z prowadzeniem kolekcji żywych roślin, ogrody botaniczne sięgają po nowe narzędzia do realizacji przedsięwzięć ochronnych. Coraz więcej tego typu jednostek korzysta z możliwości, jakie dają banki genów, spośród których największą uwagę skupiają banki nasion. Są one rekomendowane przez International Agenda for Botanic Garden in Conservation jako instytucje o największym znaczeniu konserwatorskim. Obecnie ponad 100 ogrodów botanicznych na świecie deklaruje posiadanie w swoich strukturach banków nasion (BGCI GardenSearch Base). Na tym tle silnym zaangażowaniem w zabezpieczenie różnorodności flory uwagę przykuwają europejskie ogrody botaniczne, organizujące się w sieci i realizujące liczne projekty. Za najważniejsze spośród tych programów uważa się MSB (Millennium Seed Bank) i ENSCONET (European Native Seeed Conservation Network) (Puchalski 2004). Obiektem pierwszego z nich, realizowanego przez Royal Botanic Gardens Kew, jest zagrożona flora całego świata, reprezentowana w banku nasion przez ponad 1.8 mld nasion około 30 tysięcy gatunków, spośród których 12 uznanych jest za wymarłe na stanowiskach naturalnych (www.kew.org/collections). Efektem pracy instytucji zaangażowanych w drugi program (ENSCO- NET) jest zachowanie 70% flory europejskiej, w tym 27% gatunków zagrożonych w Europie i 44% gatunków z Dyrektywy Siedliskowej UE (Sharrock i Jones 2011). 15

Działalność PAN Ogrodu Botanicznego CZRB w Powsinie w kierunku zabezpieczenia różnorodności flory Polski A PAN Ogród Botaniczny w Powsinie, będący jednocześnie Centrum Zachowania Różnorodności Biologicznej, pełni istotne funkcje w ochronie flory naczyniowej Polski i zasobów genowych gatunków uprawnych. Od wielu lat realizuje liczne programy zachowania różnorodności rodzimej flory, które dotyczą wielu zagadnień z zakresu konserwatorskiej ochrony przyrody i jako takie przyjmują charakter interdyscyplinarny, łącząc wiedzę i doświadczenie, zarówno z zakresu konwencjonalnej uprawy roślin, jak też zabezpieczania materiału genetycznego w warunkach kriogenicznych oraz prowadzenia badań naukowych nad skutecznością zachowywania różnorodności genetycznej populacji naturalnych (Puchalski i in. 2010). B Jako czołowa instytucja w Polsce w zakresie zabezpieczania nasion gatunków dziko rosnących, Ogród Botaniczny w Powsinie prowadzi od 1991 roku Bank Nasion Gatunków Rzadkich i Chronionych Flory Polski, pełniący rolę Narodowego Banku Flory Polski. Po 10 latach działalności zgromadził on nasiona 110 gatunków reprezentowanych przez około 350 populacji (Puchalski 2006). Obecnie w Banku Nasion w Powsinie zabezpieczono nasiona 160 gatunków o wyso- C D A. Widok ogólny; B. D. Kolekcje roślin górskich; C. Bank Nasion Gatunków Rzadkich i Chronionych Flory Polski 16

kim statusie konserwatorskim (570 próbek), z czego 86 gatunków jest prawnie chronionych, 51 figuruje w Czerwonej Księdze, 72 na Czerwonej Liście, 16 ma znaczenie ogólnounijne (Dyrektywa Siedliskowa), 14 ma znaczenie ogólnoeuropejskie (Konwencja Berneńska), a 10 ma charakter endemiczny lub subendemiczny dla Polski (Puchalski i in. 2013). Dzięki zapleczu laboratoryjnemu Ogród Botaniczny w Powsinie prowadzi badania molekularne nad skutecznością ochrony ex situ dla zachowania różnorodności genetycznej najcenniejszych gatunków flory Polski. Wdrożony w ostatnim czasie program FlorNaturOB miał na celu zapewnienie kompleksowej i długofalowej ochrony różnorodności gatunkowej 61 wymierających i rzadkich przedstawicieli flory Polski Wschodniej w warunkach ex situ w postaci banku nasion (www.ogrod-powsin.pl/flornatur.pdf). Komplementarny do niego FlorNaturLBG realizowany przez Leśny Bank Genów w Kostrzycy, obejmował 60 dziko rosnących, rzadkich i ginących gatunków zachodniej części naszego kraju. Obecnie, we współpracy z czterema innymi instytucjami, Ogród Botaniczny w Powsinie realizuje program Ocena stanu populacji oraz ochrona ex situ wybranych dziko rosnących gatunków roślin rzadkich i zagrożonych na terenie Polski, w ramach którego zaplanowano zbiór nasion 30 gatunków z 75 stanowisk naturalnych, zwłaszcza położonych poza parkami narodowymi i rezerwatami (Galej, Matynia 2013). W kolekcjach polowych PAN OB CZRB zabezpieczono 582 gatunki, w tym 169 zagrożonych wymarciem, 166 ściśle chronionych i 12 częściowo chronionych, 13 gatunków o znaczeniu międzynarodowym (Dyrektywa Siedliskowa i Konwencja Berneńska) oraz 56 endemitów i subendemitów Polski (dane własne jednostki). Ponadto zgromadzono nasiona form lokalnych żyta, zrazy pąkowe historycznych odmian jabłoni (Boczkowska i in. 2007; Puchalski i in. 2010; Niedzielski i in. 2010), opracowano techniki długotrwałego przechowywania gametofitów i zarodników paproci (Mikuła i in. 2011), stworzono Narodową Kolekcję Róż (Monder 2011) oraz liczne zbiory warzyw, roślin leczniczych i przyprawowych, kosaćców, funkii, różaneczników, azalii i innych wrzosowatych oraz magnolii. A B C Ryc. 6. Przykładowe gatunki roślin objętych projektem FlorNaturOB. A. Dzwonecznik wonny (Adenophora lilifolia) w fazie kwitnienia; B. Owoce różanecznika żółtego (Rhododendron luteum); C. Fiołek torfowy (Viola uliginosa) w fazie kwitnienia 17

Techniki molekularne w ochronie różnorodności roślin Ochrona ex situ postrzegana jest jako rodzaj wspomagania ochrony in situ, a jej zasadniczym założeniem jest zabezpieczenie różnorodności danego gatunku w celu odtworzenia lub wzmocnienia jego populacji w warunkach naturalnych. Na podstawie dotychczas wdrożonych planów reintrodukcji gatunków zagrożonych nakreślone zostały uwagi i wytyczne dotyczące prawidłowego prowadzenia kolekcji ex situ (Guerrant i Kaye 2007). Wskazują one na konieczność zachowania reprezentatywnego pod względem zmienności genetycznej charakteru materiału dziedzicznego tak, aby odtworzona przy jego wykorzystaniu populacja posiadała jak najwyższy potencjał adaptacyjny (Cochrane i in. 2007). Zatem populacja ex situ powinna charakteryzować się jak najbardziej zbliżonym do populacji in situ poziomem zmienności genetycznej. Tego rodzaju porównawcza analiza genetycznej struktury obu typów populacji (in situ i ex situ) jest możliwa dzięki narzędziom biologii molekularnej. Oszacowanie poziomu zmienności genetycznej wybranego gatunku bazuje na analizie genomu poszczególnych osobników, która najczęściej wyrażana jest w postaci profili genetycznych opisanych przez markery molekularne. Techniki generujące markery molekularne stanowią cenne narzędzie w genetyce populacyjnej i genetyce konserwatorskiej roślin, gdyż można je stosować w oparciu o każdy materiał zawierający DNA, więc dają one możliwość analizy zarówno świeżych, jak i zamrożonych czy suchych fragmentów roślin. Ponadto są one wolne od plejotro 18

powych czy epigenetycznych zależności oraz od czynników środowiskowych. Markery molekularne opierają się na różnicach w sekwencjach kwasu nukleinowego różnych osobników i dlatego są w stanie wskazać na polimorfizm nieujawniony fenotypowo. Polimorfizm w sekwencjach kwasów nukleinowych ujawniany jest różnorako może być wynikiem restrykcji DNA, wynikiem amplifikacji fragmentu DNA lub wynikiem sekwencjonowania DNA. Obecnie w genetyce konserwatorskiej najczęściej stosuje się techniki bazujące na technice PCR (Polymerase Chain Reaction). Dostępny jest szeroki zestaw technik molekularnych wykorzystywanych w ocenie i rozpoznaniu różnorodności genetycznej i opracowań przeglądowych szczegółowo opisujących rodzaje metod generowania markerów zmienności genetycznej i możliwości ich zastosowania w świecie roślin (Agarwal i in. 2008; Arif i in. 2010; Poczai i in. 2013). O wyborze konkretnej metody decyduje cel jej zastosowania, jej użyteczność, wymagana pracochłonność, ale także wysokość kosztów związanych z jej wdrożeniem (Arnaud Haond i in. 2005). W zależności od zastosowania startera (starterów) reakcji PCR pozwalają one przeanalizować jeden locus lub wiele loci jednocześnie, dysponując niewielką ilością materiału genetycznego, nierzadko bez konieczności znajomości genomu wybranego gatunku, co jest bardzo istotne w przypadku gatunków o zagrożonych pulach genowych. Jako jedną z pierwszych tego typu technik w genetyce konserwatorskiej zastosowano RAPD (Random Amplified Polimorphic DNA) (Wiliams i in. 1990; Rosetto i in. 1995), wykorzystującą arbitralne startery, zazwyczaj 10-nukleotydowe. Dużą popularnością ze względu na możliwość przeanalizowania dziesiątek loci przy wykorzystaniu zaledwie kilku par starterów, cieszy się technika AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), łącząca etap restrykcji DNA z amplifikacją selektywną fragmentów DNA (Vos i in. 1995). Dość liczną grupę technik molekularnych wykorzystywanych w genetyce konserwatorskiej stanowią metody oparte na sekwencjach mikrosatelitarnych. Mikrosatelity to sekwencje z motywami 1-6 pz (par zasad) powtórzonymi tandemowo, równomiernie rozproszone w chromosomach lub wykazujące preferencje do obszarów przycentromerowych (Shulman i in. 2004). Są szczególnie przydatne w genetyce i genomice populacyjnej, gdyż szacowana przy ich użyciu zmienność genetyczna może stanowić podstawę ewolucji adaptacyjnej (Kashi i King 2006). Sekwencje te są nierzadko źródłem polimorfizmu wynikającego głównie z liczby ich powtórzeń. Jedna z najpopularniejszych technik, oparta o sekwencje mikrosatelitarne, to SSR (Simple Sequence Repeat). Markery SSR wnoszą wiele informacji o strukturze genetycznej populacji, ponieważ posiadają charakter kodominujący, lecz u roślin dziko rosnących znajdują sporadyczne zastosowanie ze względu na specyficzność starterów, choć obiecującą alternatywą wydaje się być możliwość wykorzystania sekwencjonowania nowej generacji (New Generation Sequencing NGS) (Santana i in. 2009; Wöhrmann i in. 2013). Inne metody opierające się na sekwencjach mikrosatelitarnych (Rakoczy Trojanowska i Bolibok 2004) nie wymagają znajomości genomu badanego gatunku, często posiadają startery semiarbitralne wielkości kilkunastu nukleotydów, co znacząco zmniejsza ryzyko związane z niepewnością powtarzalności wyników i dlatego znajdują wykorzystanie wśród gatunków o zagrożonych pulach genowych. Pod tym względem największym zainteresowaniem cieszy się technika ISSR (Inter Simple Sequence Repeat) (Ziętkiewicz 1994), choć nierzadko do opisu genetycznej struktury populacji zastosowanie znajduje technika SAMPL (Selective Amplification of Microsatellite Polymorphic Loci), bazująca głównie na założeniach techniki AFLP, lecz wykorzystująca w końcowym etapie startery z sekwencjami mikrosatelitarnymi (Morgante i Vogel 1994). Techniki molekularne umożliwiają analizę genetycznej struktury populacji oraz pozwalają na określenie procesów w nich zachodzących i sił ją kształtujących. Na podstawie opracowań uogólnionej i szeroko zakrojonej charakterystyki genetycznej struktury populacji gatunków roślin, przy uwzględnieniu zasięgu ich występowania, posiadanych form życiowych i sposobu rozmnażania, oszacowano średni poziom zmienności genetycznej i zróżnicowania genetycznego reprezentowanych przez najczęściej stosowane techniki generowania markerów (Hamrick 1989; Hamrick i in. 1991; Nybom i Bartish 2000; Cole 2003; Nybom 2004). 19

Ocena zabezpieczenia różnorodności genetycznej populacji in situ w warunkach ex situ Zasadniczym celem ochrony ex situ jest zabezpieczenie różnorodności gatunkowej i genetycznej flory określonego regionu w taki sposób, aby zabezpieczony materiał jak najwierniej odzwierciedlał różnorodność charakterystyczną dla warunków naturalnych. Jak podają doniesienia literaturowe, w populacjach ex situ można spodziewać się spadku poziomu zmienności genetycznej wraz z czasem prowadzenia uprawy tego typu populacji (Rice i in. 2006; Enßlin i in. 2011; Lauterbach i in. 2012) na skutek wzrostu prawdopodobieństwa wsobności i dryfu genetycznego w związku z następowaniem po sobie kolejnych pokoleń. Kwestię tę trudno traktować jako generalne założenie ze względu na wciąż stosunkowo niewielką liczbę doniesień literaturowych opisujących bezpośrednie porównanie genetycznej struktury populacji ex situ różniących się wiekiem z populacjami naturalnymi gatunków zagrożonych. Zasadniczym problemem wydaje się być rzetelne udokumentowanie pochodzenia populacji ex situ, gdyż niejednokrotnie są one wynikiem wzajemnej wymiany materiału roślinnego między ogrodami botanicznymi. Populacje wielu gatunków zagrożonych w kolekcjach botanicznych były zwykle zakładane wiele lat temu, często w celu ekspozycji wybranego gatunku dla edukacji społeczeństwa (Donaldson 2009) lub jako ciekawostka botaniczna, prezentująca bogactwo obcej flory. Dopiero w ostatnich kilku dekadach położono szczególny nacisk na znaczenie konserwatorskie kolekcji botanicznych dla zabezpieczenia różnorodności genetycznej gatunku. (Oldfield 2009). Niewystarczająco poznaną dotych- 20

czas jest też kwestia skuteczności ogólnie dostępnych form ochrony ex situ dla zabezpieczenia różnorodności genetycznej gatunków zagrożonych oraz procesów kształtujących ich genetyczną strukturę (Laikre 2010). W niniejszym opracowaniu zestawiono i porównano i chronionych gatunków flory Polski: warzuchy polskiej (Cochlearia polonica), złocienia Zawadzkiego (Dendranthema zawadzkii) oraz pszonaka pienińskiego (Erysimum pieninicum). Poruszono również kwestie skuteczności konserwatorskiej dwóch najczęściej Ocena skuteczności ochrony ex situ dla zabezpieczenia pierwotnej zmienności genetycznej populacji in situ Ocena skuteczności ochrony ex situ w postaci kolekcji żywych roślin (kolekcji botanicznych) na przykładzie trzech gatunków: Cochlearia polonica Erysimum pieninicum Dendranthema zawadzkii. Ocena skuteczności ochrony ex situ prowadzonych w dwóch różnych formach: kolekcja żywych roślin ver. kriokonserwacja nasion na przykładzie populacji Erysimum pieninicum z Ogrodu Botanicznego w Powsinie i Banku Nasion Gatunków Rzadkich i Chronionych Flory Polski w Powsinie. Ocena skuteczności ochrony ex situ w formie kolekcji żywych roślin różniących się długością ich prowadzenia na przykładzie populacji Erysimum pieninicum z Ogrodu Botanicznego w Powsinie i Arboretum w Bolestraszycach. Ryc. 7. Schematyczny zakres zagadnień oceny skuteczności ochrony ex situ dla zabezpieczenia pierwotnej zmienności genetycznej populacji in situ wybranych gatunków flory Polski ujętych w niniejszym opracowaniu. kilka aspektów ochrony ex situ (Ryc. 7). Przedstawiono w nim przede wszystkim zagadnienia związane z zabezpieczaniem w warunkach ex situ pul genowych gatunków roślin o wysokim statusie konserwatorskim w Polsce. Skupiono się szczególnie na próbie molekularnej oceny efektywności konserwatorskiej ochrony ex situ w formie prowadzenia kolekcji żywych roślin w aspekcie zachowania różnorodności genetycznej populacji naturalnej (in situ) na przykładzie trzech zagrożonych stosowanych form ochrony ex situ kolekcji żywych roślin i kriokonserwacji nasion, a także długości okresu uprawy kolekcji na przykładzie populacji pszonaka pienińskiego dla zabezpieczenia różnorodności genetycznej gatunku. Populacje in situ stanowiły populacje naturalne, będące jednocześnie populacjami wyjściowymi macierzystymi dla populacji ex situ (Ryc. 9). Zebrany materiał roślinny poddano analizom molekularnym według załączonego schematu (Ryc. 8). Cochlearia polonica ex situ Ogród Botaniczny w Powsinie Cochlearia polonica in situ Źródliska rzeki Centurii Dendranthema zawadzkii ex situ Ogród Botaniczny w Powsinie Dendranthema zawadzkii in situ Macelowa Góra i Zawiesy (PPN) Izolacja genomowego DNA Ocena ilościowa i jakościowa DNA PCR Cochlearia polonica ex situ Ogród Botaniczny w Powsinie Cochlearia polonica in situ Źródliska rzeki Centurii Dendranthema zawadzkii ex situ Ogród Botaniczny w Powsinie Dendranthema zawadzkii in situ Macelowa Góra i Zawiesy (PPN) Porównawcza charakterystyka genetycznej struktury populacji naturalnych (in situ) i kolekcji botanicznych (ex situ) w aspekcie zabezpieczenia różnorodności genetycznej populacji in situ Erysimum pieninicum ex situ Ogród Botaniczny w Powsinie Erysimum pieninicum in situ Wzgórze Zamkowe (PPN) SAMPL Elektroforeza pionowa ISSR Elektroforeza pozioma Analiza statystyczna wyników Erysimum pieninicum ex situ Ogród Botaniczny w Powsinie Erysimum pieninicum in situ Wzgórze Zamkowe (PPN) Erysimum pieninicum ex situ Arboretum w Bolestraszycach Erysimum pieninicum ex situ Bank Nasion w Powsinie Porównawcza charakterystyka genetycznej struktury populacji ex situ i in situ Erysimum pieninicum w aspekcie zabezpieczenia różnorodności genetycznej populacji in situ Populacje ex situ - kolekcje żywych roślin Populacje in situ Populacja ex situ - kriokonserwacja nasion Ryc. 8. Schemat analiz molekularnych z uwzględnieniem podziału użytego materiału roślinnego pod względem podjętych problemów badawczych 21

Cochlearia polonica E. Fröhlich Populacja in situ Stanowisko u źródlisk rzeki Centurii Populacja ex situ Kolekcja żywych roślin w Ogrodzie Botanicznym w Powsinie Dendranthema zawadzkii (Herbich) Tzvelev Populacja in situ Stanowisko na Macelowej Górze i Zawiesach - teren Pienińskiego Parku Narodowego Populacja ex situ Kolekcja żywych roślin w Ogrodzie Botanicznym w Powsinie Erysimum pieninicum (Zapał.) Pawł. Populacja in situ Stanowisko na Wzgórzu Zamkowym w Czorsztynie - teren Pienińskiego Parku Narodowego Populacja ex situ Kolekcja żywych roślin w Arboretum w Bolestraszycach Populacja ex situ Kolekcja żywych roślin w Ogrodzie Botanicznym w Powsinie Populacja ex situ Bank Nasion Gatunków Rzadkich i Chronionych Flory Polski w Powsinie Ryc. 9. Pochodzenie materiału roślinnego z populacji in situ i ex situ poszczególnych analizowanych gatunków. Cochlearia polonica E. Fröhlich Jednym z priorytetowych dla Polski gatunków jest warzucha polska (Cochlearia polonica E. Fröhlich), należąca do rodziny Brassicaceae, stanowiąca rodzimy element flory polskiej ze względu na swój endemiczny charakter (Fröhlich 1937; Cieślak i Ronikier 2006; Cieślak i in. 2007). Warzucha polska jest rośliną krótkowieczną, zimozieloną, obcopylną. Kwitnie od kwietnia do września, z optimum kwitnienia od kwietnia do czerwca (Ryc. 10). Rozmnaża się głównie generatywnie, a nasiona rozprzestrzeniają się barochorycznie i hydrohorycznie (Kaźmierczakowa 2010; Cieślak i in. 2010). Warzucha polska preferuje piaszczyste podłoże w źródliskach z zimną wodą (8-15 o C) o dużej zawartości węglanów, kolonizując miejsca z wolno przepływającą wodą o głębokości do kilku centymetrów (Fröhlich 1937; Cieślak i in. 2010). Pochodzenie tego endemitu szacuje się na plejstocen, co obok Galium cracoviense nadaje mu status jednego z najstarszych polskich endemitów (Piękoś Mirkowa i Mirek 2010). Inwentaryzacja stanowisk przeprowadzona przez Kwiatkowską (1948 1952) wykazała 5 pierwotnych stanowisk o wysokiej liczebności warzuchy polskiej na obszarze położonym między Pustynią Błędowską i Starym Olkuszem (Wyżyna Śląsko-Krakowska) (Kwiatkowska 1957). Jednak te naturalne siedliska i stanowiska zostały zniszczone w wyniku dewastacji lokalnej sieci wodnej (Baryła 2005). Jeszcze w 1970 roku, na skutek postępującej degradacji naturalnego środowiska C. polonica, w celach ocalenia gatunku podjęto próbę introdukcji roślin na nowe miejsca, odpowiadające ich wymaganiom, przy źródłach rzeki Centurii pod Błędowem z okolic źródliskowych rzeki Białki. Ostatnie obserwacje gatunku na pierwotnych stanowiskach naturalnych datuje się na 1994 rok (Kaźmierczakowa 2010). Obecnie gatunek występuje tylko na nielicznych stanowiskach zastępczych, z głównym u źródlisk rzeki Centurii (Ryc. 11). Inne to Rajecznica i Złoty Potok, gdzie stwierdza się tylko pojedyncze rośliny. 22

Gatunek endemiczny we florze Polski Wymarły w warunkach naturalnych (EW) (Zarzycki i Szeląg 2006) Zagrożony (EN) na liście IUCN (Melnyk i Bilz 2011) Objęty Konwencją Berneńską Umieszczony w Aneksach do Europejskiej Dyrektywy Siedliskowej A B Ryc. 10. Warzucha polska (Cochlearia polonica) w fazie kwitnienia (A) oraz w fazie juwienilnej (B). W 1979 roku do Ogrodu Botanicznego w Powsinie sprowadzono kilka okazów warzuchy polskiej, zapewniono im odpowiednie, podobne do naturalnych, warunki do wzrostu i rozwoju, zakładając tym samym populację ex situ C. polonica (Ryc. 12). Populacja ta powstała z 5 osobników i liczyła około 100 osobników w 1994 roku (Burska 1995). Od tego czasu obserwuje się spadek liczebności tej populacji. W latach 2005 2007 liczyła ona tylko około 30 osobników. Nasiona warzuchy polskiej zabezpieczono także w Banku Nasion Gatunków Rzadkich i Chronionych Flory Polski w Ogrodzie Botanicznym w Powsinie w ramach programu FlorNaturOB (Puchalski i in. 2010). Jednym z cenniejszych obiektów flory Polski jest złocień Zawadzkiego Dendranthema zawadzkii (Asteraceae) (Ryc. 13), będący reliktem plejstoceńskim, choć określany jako element karpacko-eurosyberyjski ze względu na występowanie na Płycie Środkoworosyjskiej od Kurska, przez Syberię po Ural, na Dalekim Wschodzie (Pawłowska 1953). W Polsce w Pieninach rośnie wyłącznie na podłożu wapiennym, podczas gdy na wschód od Uralu spotyka się tę roślinę zarówno na glebach bezwapiennych, wykształconych ze skał granitowych, jak i na zasobnych w węglan wapnia (Pawłowska 1953; Wróbel 2008). Złocień Zawadzkiego jest obiektem specjalnego zainteresowania Pienińskiego Parku Narodowego, podlegającym stałemu monitoringowi przyrodniczemu. Dendranthema zawadzkii (Herbich) Tzvelev Ryc. 11. Populacja warzuchy polskiej (Cochlearia polonica) na stanowisku u źródeł rzeki Centurii. A. w fazie kwitnienia roślin; B. w fazie juwienilnej roślin. Ryc. 12. Warzucha polska (Cochlearia polonica) na stanowisku w Ogrodzie Botanicznym w Powsinie 23

Występuje pospolicie w Pieninach Centralnych, sięgając od brzegów Dunajca po szczyt Trzech Koron (Piękoś 1971). Zwartym zasięgiem rośnie też w Wąwozie Sobczańskim oraz od Bystrzyka po Zawiesy, gdzie jest najliczniej reprezentowany (około 200 roślin kwitnących). Niewiele uboższe w kwitnące osobniki jest oderwane stanowisko na Macelowej Górze. Stanowiska na Sokolicy i na Czerteziku liczą po około 30 40 roślin kwitnących (Ryc. 14). Wszystkie populacje złocienia Zawadzkiego występujące na terenie Pienińskiego PN wydają się być stabilne. W latach 2000 2001 utworzono stanowisko zastępcze tego gatunku w PAN Ogrodzie Botanicznym CZRB w Powsinie z nasion pozyskanych ze stanowiska na Macelowej Górze i Zawiesów. Ostatnio prowadzone obserwacje wskazują, że populacja ta skupiała 12 osobników (Ryc. 15). Nasiona złocienia Zawadzkiego zabezpieczono także w Banku Nasion Gatunków Rzadkich i Chronionych Flory Polski w Ogrodzie Botanicznym w Powsinie (Puchalski i Muranyi 2002). Relikt plejstoceński Gatunek objęty ścisłą ochroną gatunkową Gatunek niższego ryzyka (LR) Ryc. 13. Złocień Zawadzkiego Dendranthema zawadzkii Ryc. 14. Fragment populacji złocienia Zawadzkiego (Dendranthema zawadzkii) na stanowisku na Sokolicy. Ryc. 15. Populacja ex situ złocienia Zawadzkiego (Dendranthema zawadzkii) na stanowisku w Ogrodzie Botanicznym w Powsinie. Erysimum pieninicum (Zapał.) Pawł. Endemitem flory Polski, ograniczonym zasięgiem wyłącznie do polskiej części Pienin, jest pszonak pieniński Erysimum pieninicum (Zapał.) Pawł. (Pawłowski 1946; Korzeniak 2001) ze stanowiskami rozmieszczonymi na wysokościach od 500 do około 800 m n.p.m., zlokalizowanymi na rędzinach i pararędzinach bogatych w węglan wapnia, preferujący siedliska półcieniste i ocienione (Pawłowski 1946; Korzeniak 2001; Vončina i Wróbel 2004) (Ryc. 16). Pszonak pieniński jest rośliną dwuletnią i w pierwszym roku wytwarza zimującą rozetę liściową, a w drugim kwitnącą łodygę. W każdym sezonie kwitnącym pędom towarzyszą liczne płone rozety. Jest to roślina owadopylna, kwitnąca od czerwca do lipca, o generatywnym sposobie rozmnażania (Pawłowska 1953). Nasiona posiadają wysoką zdolność kiełkowania, utrzymującą się przez wiele lat (Csontos i in. 2010). Po raz pierwszy opisany w 1913 roku przez Zapałowicza jako Erysimum wahlenbergii (Asch. & Engl.) Borbas var. pieninicum. Po szczegółowych badaniach morfologicznych pszonaków karpackich Pawłowski (1946) nadał mu rangę gatunku. 24

Większość populacji pszonaka pienińskiego opisywana jest z terenu Pienińskiego PN, w tym najstarsza, mająca charakter locus classicus ze Wzgórza Zamkowego w Czorsztynie, które przez wiele lat stanowiło jedyne znane miejsce występowania tego taksonu Gatunek endemiczny dla flory Polski Gatunek narażony (VU) w Polsce (Każmierczakowa i Zarzycki 2001) Posiada status gatunku rzadkiego (R) (Mirek i in. 2006) Gatunek narażony (VU) na liście IUCN (Piękoś - Mirkowa i Mirek 2011) Objęty Konwencją Berneńską Ujęty w Aneksach (II i IV) do Dyrektywy Siedliskowej Ryc. 16. Pszonak pieniński (Erysimum pieninicum) w fazie kwitnienia. (Zarzycki 1976, 1981, 1982). Od końca lat 1990- tych uzaobserwowano także pojawienie się mniej liczebnych populacji w obrębie pienińskiego pasa skałkowego, między innymi w Wąwozie Macelowym (Gorczyńskim), w Dolinie Kotłowego Potoku i nieopodal wzgórza Flaki (Długa Grapa) oraz w Wąwozie Homole i Wąwozie Międzyskały (Dolina Białej Wody) w Małych Pieninach (Vončina i Wróbel 2004; Wróbel 2010). Klasyczne stanowisko pszonaka pienińskiego odkryte na Wzgórzu Zamkowym w Czorsztynie zostało znacznie zubożone pod koniec lat 1990-tych. na skutek budowy Zespołu Zbiorników Wodnych Czorsztyn-Niedzica-Sromowce Wyżne na Dunajcu. Pszonak rósł wcześniej prawie na każdej ze skał pod zamkiem, które w czasie napełniania zbiornika znalazły się pod wodą. Mimo ograniczenia areału występowania, populacja ta nadal stanowi centrum występowania tego gatunku (Wróbel 2010; Wróbel i Zarzycki 2010) (Ryc.17). W 2001 roku w Ogrodzie Botanicznym w Powsinie założono na nasłonecznionym zboczu w kolekcji roślin górskich populację ex situ pszonaka pienińskiego. (Ryc. 18). Populacja ta liczy około 60 osobników. Nasiona tego gatunku zabezpieczono także w Banku Nasion Gatunków Rzadkich i Chronionych Flory Polski w Ogrodzie Botanicznym w Powsinie (Puchalski i Muranyi 2002; Puchalski i in. 2010). Ryc. 17. Populacja in situ pszonaka pienińskiego (Erysimum pieninicum) na Wzgórzu Zamkowym w Czorsztynie. Ryc. 18. Populacja ex situ pszonaka pienińskiego (Erysimum pieninicum) na stanowisku w Ogrodzie Botanicznym w Powsinie. 25

Ocena zabezpieczenia zmienności genetycznej populacji in situ w populacjach ex situ w formie kolekcji żywych roślin w latach 1980-tych z pozyskanych kilku osobników ze stanowiska u źródlisk rzeki Centurii. Populacje ex situ pszonaka pienińskiego i złocienia Zawadzkiego powstały z siewek wyprowadzonych z nasion tych gatunków zebranych z ich stanowisk naturalnych ze Wzgórza Zamkowego w Czorsztynie w przypadku pszonaka pienińskiego oraz z Zawiesów i Macelowej Góry w przypadku złocienia Zawadzkiego. W celu oceny skuteczności ochrony ex situ w formie kolekcji żywych roślin dla zachowania różnorodności genetycznej populacji naturalnych dokonano molekularnej porównawczej charakterystyki populacji ex situ i odpowiadających im populacji in situ trzech gatunków flory Polski o wysokim statusie konserwatorskim: warzuchy polskiej (Cochlearia polonica), pszonaka pienińskiego (Erysimum pieninicum) i złocienia Zawadzkiego (Dendtranthema zawadzkii) przy zastosowaniu technik markerów mikrosatelitarnych ISSR (Inter Simple Sequence Repeat) oraz SAMPL (Selective Amplification of Microsatellite Polymorphic Loci). Populacja ex situ warzuchy polskiej została założona Zastosowane techniki molekularne ISSR i SAMPL wykazały niższe wartości wskaźników zmienności genetycznej w populacjach ex situ w odniesieniu do odpowiadających im populacji in situ każdego z analizowanych gatunków. Liczba polimorficznych produktów markerów ISSR i SAMPL w populacjach ex situ stanowiła około połowy ich liczby obserwowanej w naturalnych populacjach (Tab. 1). Zaledwie w odniesieniu do markerów SAMPL u Dendranthema zawadzkii i Erysimum pieninicum wartości tego parametru nie odbiegały bardzo znacząco od siebie (42.8% i 45.4% w populacji ex situ odpowienio dla D. zawadzkii i E. pieninicum w stosunku do populacji in situ: 60.6% i 50.6%). Także wskaźniki różnorodności genetycznej, oszacowane na podstawie markerów ISSR i SAMPL, charakteryzowały się wyższymi wartościami dla populacji in situ w porównaniu z populacjami ex situ wszystkich analizowanych gatunków. Tab. 1. Parametry zmienności genetycznej populacji in situ i ex situ (kolekcji żywych roślin z Ogrodu Botanicznego w Powsinie) warzuchy polskiej (Cochlearia polonica), złocienia Zawadzkiego (Dendranthema zawadzkii) i pszonaka pienińskiego (Erysimum pieninicum). N a M b PP c h N d PU e Gatunek Populacja ISSR SAMPL ISSR SAMPL ISSR SAMPL ISSR SAMPL ISSR SAMPL Cochlearia polonica ex situ 26 24 in situ 85 70 17 (235) 12 (248) 68 (28.9) 65 (26.2) 104 (44.2) 127 (51.2) 0.1007 (0.1764) 0.1558 (0.1957) 0.0761 (0.1506) 0.1674 (0.1916) 3 2 11 28 Dendranthema zawadzkii ex situ 12 in situ 32 14 (241) 10 (236) 45 (18.7) 101 (42.8) 219 (90.9) 143 (42.8) 0.0461 (0.1184) 0.2976 (0.1789) 0.1214 (0.1698) 0.1894 (0.2001) 1 0 65 29 Erysimum pieninicum ex situ 33 12 (180) 5 (247) 34 (18.89) 112 (45.4) in situ 47 65 (36.1) 125 (50.6) 0.0508 (0.1280) 0.0921 (0.1630) 0.1656 (0.2054) 0.2044 (0.2172) 1 1 8 5 26 a N liczba osobników b M liczba zastosowanych starterów/kombinacji starterów (liczba uzyskanych amplikonów) c PP liczba produktów polimorficznych (%) różnorodność genetyczna wg Nei a (odchylenie standardowe) d h N e PU liczba produktów unikatowych

Dla dokładniejszego opisu relacji genetycznych między osobnikami populacji in situ i ex situ badanych gatunków zastosowano test analizy wariancji molekularnej (Analysis of Molecular Variance - AMOVA). Jego wyniki wykazały większy udział zmienności genetycznej w procentowym jej rozkładzie w obrębie populacji in situ i ex situ niż między nimi (Ryc. 19). Również wskaźniki zróżnicowania genetycznego między populacjami in situ i ex situ przyjęły wartości średnie (Tab. 2). Interpretując te wyniki należy uwzględnić jednak fakt bezpośredniego pochodzenia populacji ex situ z populacji naturalnych, co nasuwa traktowanie tych wartości jako stosunkowo wysokie. Wydaje się wysoce prawdopodobne, że rozbieżności w wartościach oszacowanych wskaźników różnorodności genetycznej były pochodną różnic w składzie genetycznym pul genowych populacji ex situ w odniesieniu do populacji in situ, sugerujące zubożenie genetyczne populacji ex situ. Taki stan genetycznej struktury populacji ex situ mógł być związany z niepełną reprezentacją zmienności genetycznej na poziomie gatunku przez osobniki lub okazy traktowane jako pula wyjściowa do założenia populacji ex situ w ogrodzie botanicznym. Tego typu sytuacja opisywana jest jako efekt założyciela, stanowiący szczególną odmianę efektu wąskiego gardła (Hamilton 1994) i była niejednokrotnie opisywana w przypadku populacji ex situ roślin uprawnych jako czynnik redukujący ich poziom zmienności genetycznej (Negri i Tiranti 2010). Należy także nadmienić, że typowym skutkiem efektu założyciela na poziomie genotypów i populacji jest nie tylko z redukcja poziomu jej zmienności genetycznej, ale również utrata unikatowych alleli (Tribsch i in. 2002). Fakt zubożenia populacji ex situ w unikatowe amplikony ISSR i SAMPL został odnotowany w każdym z trzech analizowanych gatunków, co można traktować jako symptom efektu założyciela. Ponadto, charakterystyczny dla zjawiska wąskiego gardła jest szybki wzrost liczebności populacji w pierwszych kilku pokoleniach, po czym postępujący stopniowy jej spadek wraz z utratą heterozygotyczności osobników (Nei i Li 1975). Takie fluktuacje liczebności populacji zaobserwowano i opisano dla populacji ogrodowej warzuchy polskiej. Z danych literaturowych wynika, że osobniki tej populacji, po jej założeniu z 5 osobników w optymalnych dla gatunku warunkach siedliskowych, zasiedliły dany teren, kwitły i rozmnażały się. Populacja ogrodowa liczyła około 100 okazów w połowie lat 1990-tych (Burska 1995). Obserwacje przeprowadzone w przeciągu ostatnich lat wskazują na znaczne zmniejszenie jej liczebności, a dane molekularne jednoznacznie opisały spadek różnorodności genetycznej w tej populacji. Tego typu obserwacji nie odnotowano w przypadku populacji ex situ pszonaka pienińskiego i złocienia Zawadzkiego, gdyż, jak można przypuszczać, liczba osobników założycieli populacji ex situ była znacznie większa (kilkadziesiąt siewek), co mogło zniwelować lub nawet zapobiec ewentualnym niepożądanym skutkom na poziomie genetycznym związanym z efektem założyciela. Wszystkie opisane wyżej wyniki sugerowały zmiany w genetycznej strukturze populacji ex situ w stosunku do populacji naturalnych. Charakter tych różnic został wyraźniej zobrazowany na wykresach (Ryc. 20). Zależność wartości poziomu zmienności genetycznej od frekwencji produktów ISSR i SAMPL przedstawione na wykresach wskazują, że produkty o częstościach średnich i niskich w populacjach in situ pojawiały się z frekwencjami wysokimi w populacjach ex situ. Takie wahania frekwencji amplikonów, mające tendencję jednokierunkową, prowadzące do ich utrwalenia lub eliminacji, są charakterystyczne dla dryfu genetycz- Tab. 2. Wartości wskaźników zróżnicowania genetycznego między populacjami in situ i ex situ analizowanych gatunków roślin. Populacja in situ versus ex situ G st ISSR SAMPL ISSR SAMPL Φ st Cochlearia polonica 0.2015 0.1286 0.308 0.2072 Dendranthema zawadzkii 0.3654 0.1263 0.3784 0.18180 Erysimum pieninicum 0.1044 0.0702 0.1505 0.1366 G st Φ st współczynnik zróżnicowania genetycznego wg Nei a analog indeksu utrwalenia Fst wg Wright a 27

Cochlearia polonica Dendranthema zawadzkii Erysimum pieninicum ISSR 30,89% ISSR 37,85% ISSR 15,05% 69,11% 62,15% 84,95% SAMPL 20,72% SAMPL 18,18% SAMPL 13,66% 79,28% 81,82% 86,34% Zmienność genetyczna wewnątrzpopulacyjna (in situ versus ex situ) Zmienność genetyczna międzypopulacyjna (in situ versus ex situ) Ryc. 19. Analiza wariancji molekularnej populacji in situ i ex situ analizowanych gatunków roślin. nego. W konsekwencji prowadzi on do ujednolicenia struktury genetycznej populacji i dalszego spłaszczenia w niej rozkładu zmienności genetycznej (Gòmez i in. 2005). Efekt taki zaobserwowano w analizowanych populacjach ogrodowych w odniesieniu do ich populacji naturalnych. Potwierdza to założenia teoretyczne traktujące o siłach determinujących skład genetyczny populacji ex situ, jako mało liczebnych, zwłaszcza odnośnie istoty problemu dryfu genetycznego (Ellstrand i Elam 1993). Ujednolicenie genetycznej struktury populacji ex situ oraz obniżony poziom ich zmienności genetycznej może być także efektem wzrostu wsobności na skutek zwiększonego prawdopodobieństwa kojarzenia między blisko spokrewnionymi osobnikami (Fernández i González Martínez 2010), co jest szczególnie niebezpieczne w przypadku gatunków krótkowiecznych i obcopylnych, gdyż może doprowadzić do depresji wsobnej (Husband i Schemske 1996; Kolehmainen i in. 2010). Tym samym wykazano empirycznie, że u niektórych gatunków w mało liczebnych populacjach o niskim poziomie zmienności genetycznej zachodzą procesy związane ze wzrostem wsobności, które mogą przejawiać się ujednoliceniem ich genetycznej struktury i obniżają jednocześnie ich wartość przystosowawczą (Oakley i Winn 2012). W przypadku kolekcji botanicznych, przy zapewnieniu roślinom optymalnych warunków wzrostu, objawy wsobności mogą być niewielkie lub niezauważalne fenotypowo. Natomiast przy ewentualnym wykorzystaniu takich roślin jako materiał odtworzeniowy, przeniesienie ich na stanowisko naturalne może wiązać się z nagłym spadkiem ich potencjału adaptacyjnego. Analizując poziom zmienności genetycznej w populacjach ex situ należy również wziąć pod uwagę ewentualny sukcesywny spadek różnorodności genetycznej związany z założeniem i prowadzeniem kolekcji żywych roślin. Pierwszy etap selekcji, gdzie wpływ czynnika ludzkiego wydaje się być największy, ma miejsce przy wyborze materiału roślinnego (pojedyncze okazy, różne postacie diaspor) do założenia populacji ex situ. Następne etapy, jak np. kiełkowanie nasion czy wzrost siewek oraz późniejsze fluktuacje wielkości populacji związane z efektem założyciela czy typowymi pracami pielęgnacyjnymi, a także selekcja adaptacyjna, powodują spadek zmienności genetycznej populacji. Ponadto wyższe prawdopodobieństwo działania dryfu genetycznego i wzrostu wsobności ujednolicają jej genetyczną strukturę. Najprawdopodobniej w analizowanych populacjach ex situ wszystkich trzech gatunków każdy z opisanych powyżej czynników miał wpływ na kształt ich struktury genetycznej, co 28

ISSR Cochlearia polonica SAMPL 250 300 0,200 200 224 221 232 229 250 220 214 246 238 0,180 0,160 150 200 0,140 0,120 150 0,100 100 100 0,080 0,060 50 3 11 50 2 28 0,040 0,020 0 ex situ in situ 0 ex situ in situ 0,000 ISSR Dendrathema zawadzkii SAMPL 300 300 0,200 250 240 234 250 220 214 246 238 0,180 0,160 200 176 176 200 0,140 0,120 150 150 0,100 100 100 0,080 0,060 50 1 65 50 2 28 0,040 0,020 0 ex situ in situ 0 ex situ in situ 0,000 ISSR Erysimum pieninicum SAMPL 200 300 0,200 180 160 158 154 177 163 250 242 235 246 245 0,180 0,160 140 120 200 0,140 0,120 100 150 0,100 80 60 100 0,080 0,060 40 20 1 8 50 1 5 0,040 0,020 0 ex situ in situ 0 ex situ in situ 0,000 Ogólna liczba produktów Liczba produktów o frekwencji p.>0.05 Liczba unikatowych produktów Wartość zmienności genetycznej Liczba produktów Zmienność genetyczna Ryc. 20. Rozkład frekwencji produktów ISSR i SAMPL w populacjach in situ i ex situ analizowanych gatunków roślin. odzwierciedlone zostało obniżonymi wartościami wskaźników różnorodności genetycznej w odniesieniu do ich populacji naturalnych. Interesującego zestawienia w zakresie porównawczej charakterystyki genetycznej struktury populacji kolekcji botanicznych i populacji na stanowiskach naturalnych dla pięciu różnych gatunków, w tym także rzadkich i zagrożonych flory niemieckiej, dokonali Brütting i in. (2013). Ich badania potwierdziły istnienie większych różnic w wartościach wskaźników zróżnicowania genetycznego między populacjami ogrodowymi, a naturalnymi w obrębie taksonów zielnych niż w odniesieniu do taksonów wieloletnich. Wydaje się być prawdopodobne, że populacje ex situ gatunków drzew i krzewów są mniej narażone na niekorzystne zmiany w ich genetycznej strukturze, powodujące spadek zmienności genetycznej, związane z mniejszą liczbą cykli życiowych (reprodukcyjnych) w porównaniu z gatunkami jednorocznymi czy zielnymi. Mało liczebne populacje takich gatunków wydają się być szczególnie wrażliwe na losowe odchylenia frekwencji alleli związane z dryfem genetycznym, jakie mają miejsce podczas długoletniego prowadzenia kolekcji botanicznych. Fluktuacje częstości alleli są bardziej niebezpieczne w skutkach dla populacji gatunków zielnych i jednorocznych, rozmnażających się głównie generatywnie, do jakich należy warzucha polska czy pszonak pieniński, gdyż następowanie po sobie kolejnych pokoleń odbywa się w stosunkowo krótkim czasie. Prowadzenie kolekcji żywych roślin gatunku jednorocznego przez 10 lat wiąże się z 10 cyklami następowania po sobie kolejnych pokoleń, natomiast 29

ten sam czas uprawy dla gatunku wieloletniego czy dwuletniego będzie okresem wzrostu jednego, dwóch lub trzech pokoleń. W tym samym czasie w populacjach ex situ u gatunków krótkowiecznych i wieloletnich zmiany na poziomie genetycznym będą zachodziły w różnym tempie (Duminil i in. 2009). Na przykład w populacji ex situ krytycznie zagrożonej cykady Encephalartos latifrans odnotowano poziom zmienności genetycznej porównywalny z charakterystycznym dla populacji naturalnych. Jednak analiza genetycznej struktury pokolenia potomnego jednej z populacji ex situ, wykazała znaczący spadek jej zmienności genetycznej, sugerując zmiany we frekwencji alleli, będące skutkiem działania dryfu genetycznego (Da Silva i in. 2012). Podobne wyniki opisano dla gatunku Grevillea scapigera, gdzie Krauss i in. (2002) oszacowali poziom zmienności genetycznej w populacji odtworzeniowej, która powstała dzięki zakończonej sukcesem translokacji kilku osobników. Autorzy porównali zmienność genetyczną tej populacji oraz jej pokolenia F 1, odnotowując wśród jego genotypów znaczący spadek zmienności genetycznej, mimo 10 krotnie większej liczebności prób populacji pokolenia F 1. Wyniki tych prac oraz wyniki uwzględnione w ramach tego opracowania, potwierdziły istnienie w populacjach ex situ kolekcji botanicznych procesów, prowadzących do ujednolicenia ich genetycznej struktury i redukcji poziomu zmienności genetycznej oraz udowodniły, że nawet populacje gatunków wieloletnich są w wysokim stopniu narażone na ich działanie. Zasadniczą kwestią w realizacji strategii ochrony ex situ jest określenie jej skuteczności w aspekcie zabezpieczenia pierwotnej różnorodności genetycznej populacji naturalnych. Jak wskazują wyniki analizy trzech omawianych gatunków, poziom pierwotnej różnorodności genetycznej w populacjach ogrodowych był reprezentowany najpełniej przez populację ex situ Erysimum pieninicum 98.7% dla markerów wygenerowanych metodą ISSR i 89.8% dla markerów SAMPL. Nieco niższe wartości ogólnej zmienności genetycznej, charakterystycznej dla populacji in situ, odnotowano w populacji Cochlearia polonica zabezpieczono 97.8% dla markerów ISSR i 89.7% dla markerów SAMPL pierwotnej zmienności genetycznej. W populacji ex situ Dendranthema zawadzkii parametr ten wskazywał najniższe wartości 73.7% dla ISSR oraz 87.7% dla SAMPL (Tab. 3). Według założeń GSPC ogrody botaniczne są zobligowane do zgromadzenia do 2020 roku w swoich kolekcjach 75% gatunków zagrożonych flory poszczególnych krajów wraz z charakterystycznym dla nich poziomem naturalnej zmienności genetycznej. Sukces realizacji tego zadania decyduje o przydatności zabezpieczonego materiału do planów reintrodukcji, którym ma podlegać 20% spośród zachowanych w warunkach ex situ taksonów (Secretariat CBD 2010). W istocie podstawowym atrybutem prawidłowo zabezpieczonej populacji ex situ powinien być reprezentatywny gatunkowo poziom zmienności genetycznej (SBSTTA 2010) i jedną z głównych potrzeb jest jej ocena w celu określenia wartości zachowawczej populacji ( conservation value ) (Sharrock i in. 2010). Wartość ta powinna być określana na podstawie poziomu zmienności genetycznej populacji ex situ oraz zabezpieczenia w niej pierwotnej zmienności genetycznej reprezen- Tab. 3. Uogólniony stan zabezpieczenia zmienności genetycznej populacji in situ w populacjach ex situ analizowanych gatunków. Cochlearia polonica Dendranthema zawadzkii Erysimum pieninicum Metoda Gd % Gd%>0.05 1>Gd%>0.05 Gd %<0.05 ISSR 97.8 97.3 65.7 100 SAMPL 89.7 89.4 50.4 75 ISSR 73.7 74.8 22.1 20 SAMPL 87.7 96.7 72.2 0 ISSR 89.8 95.0 62.0 28.7 SAMPL 98.7 95.9 85.2 50 Gd % -zmienność genetyczna odzwierciedlona w populacji ex situ Gd %>0.05 -zmienność genetyczna odzwierciedlona w populacji ex situ reprezentowana przez produkty o frekwencji p>0.05 1>Gd%>0.05 -zmienność genetyczna odzwierciedlona w populacji ex situ reprezentowana przez produkty o frekwencji 1>p>0.05 Gd%<0.05 -zmienność genetyczna odzwierciedlona w populacji ex situ reprezentowana przez produkty o frekwencji p<0.05 30

towanej przede wszystkim przez produkty o średnich frekwencjach (Marshall i Brown 1975). Spośród analizowanych populacji ogrodowych, populacja E. pieninicum wydaje się najlepiej spełniać te wymagania (62% dla markerów uzyskanych metodą ISSR, 85.2% dla markerów uzyskanych metodą SAMPL) (Tab. 3). Porównywalne wartości dla markerów ISSR i SAMPL, odzwierciedlających zabezpieczony poziom zmienności genetycznej reprezentowanej przez produkty o średnich frekwencjach, zaobserwowano w populacji zastępczej C. polonica (odpowiednio wartości 65.7% i 50.42%). Rozbieżne wyniki w tym przypadku odnotowano w populacji ex situ D. zawadzkii (22.1% dla markerów uzyskanych metodą ISSR i 72.2% dla markerów uzyskanych metodą SAMPL). Mając na uwadze długość okresu uprawy poszczególnych populacji ex situ oraz okoliczności ich zakładania, należy uwzględnić także genezę powstania populacji ex situ poszczególnych analizowanych gatunków w odniesieniu do zróżnicowania genetycznego między populacjami ogrodowymi a populacjami naturalnymi. Najniższe wartości wskaźników zróżnicowania genetycznego zaobserwowano dla pary populacji pszonaka pienińskiego, natomiast najwyższe odnotowano dla pary populacji warzuchy polskiej w przypadku analizy ISSR oraz dla pary populacji złocienia Zawadzkiego dla markerów SAMPL. Zatem, pod względem konserwatorskim, najbardziej wartościowa wydaje się być populacja ex situ pszonaka pienińskiego. Do jej założenia wykorzystano nasiona zebrane z osobników pokrywających całą populację źródłową (Wróbel informacja ustna). Ponadto liczba siewek wykorzystana do tego celu również była liczna (około 250; Gasek informacja ustna). W przypadku zakładania populacji zastępczej D. zawadzkii także zebrano nasiona z reprezentatywnej grupy osobników populacji z Macelowej Góry i Zawiesów, lecz liczba siewek wykorzystana w tym celu była nieco mniejsza ze względu na niską ich przeżywalność w czasie kiełkowania (Puchalski i Muranyi 2002). Populacja warzuchy polskiej została założona z 5 osobników pochodzących ze źródlisk rzeki Centurii. W świetle tych danych można było przypuszczać, że znaczący wpływ na strukturę genetyczną populacji ex situ analizowanych gatunków, a tym samym na stopień zabezpieczenia pierwotnej zmienności genetycznej, miały takie czynniki jak liczba osobników założycielskich i sposób ich pozyskania. Ponadto zmiany w strukturze genetycznej populacji ex situ warzuchy polskiej wydają się być najbardziej zaawansowane w zestawieniu z pozostałymi analizowanymi gatunkami. Wydaje się, że fakt ten można powiązać z długoletnią jej uprawą oraz niską liczebnością materiału wyjściowego (5 osobników), przez co efekt działania dryfu mógł być bardziej wyraźny. Mimo że w przypadku dwóch pozostałych gatunków współczynniki zróżnicowania genetycznego osiągały średnie wartości, a frekwencje markerów zmienności genetycznej odbiegały w pewnym stopniu od schematu reprezentowanego w populacjach naturalnych, struktura genetyczna populacji ex situ nie była na tyle ujednolicona, a utrata poszczególnych produktów na tyle wysoka, aby wnioskować o zaawansowanym wpływie dryfu genetycznego na profil genetyczny tych populacji. Według założeń Celu Nr 9 GSPC do 2020 roku w formie ex situ powinno zostać zabezpieczone 70% zmienności genetycznej gatunków roślin o wysokiej wartości gospodarczej, ekonomicznej i kulturowej (Secretariat CBD 2010). W badanych kolekcjach żywych roślin warzuchy polskiej, pszonaka pienińskiego i złocienia Zawadzkiego zabezpieczono ponad 70% ogólnej zmienności genetycznej populacji pierwotnej, co zostało w każdym przypadku potwierdzone dwiema technikami molekularnymi (ISSR i SAMPL). Fakt ten sugeruje, że kolekcje ex situ żywych roślin rozpatrywanych gatunków spełniają wymogi Celu Nr 9 GSPC. Jednak dokładniejsza analiza genetycznej struktury populacji ex situ w odniesieniu do populacji in situ wskazała na ich zubożenie i ujednolicenie, które w konsekwencji może prowadzić do erozji genetycznej tak mało liczebnych populacji jak omawiane, jeśli nie zostaną one wzbogacone o nowe genotypy z populacji naturalnych. 31

Skuteczność ochrony ex situ dla zabezpieczenia różnorodności genetycznej pszonaka pienińskiego Erysimum pieninicum (Zapał.) Pawł. Pszonak pieniński jednym z najcenniejszych elementów flory Polski. Zasięg jego występowania ograniczony do pienińskiego pasa skałkowego decyduje o jego endemicznym charakterze. Jako gatunek priorytetowy wymaga szczególnego zainteresowania i podejmowania wszelkich środków w celu zachowania jego puli genowej. Plan ochrony różnorodności genetycznej tego gatunku odbywa się dwutorowo. Jako obiektowi szczególnego zainteresowania Pienińskiego Parku Narodowego zapewniono jego ochronę in situ, ale pula genowa tego gatunku została zabezpieczona także w formie ex situ w postaci kolekcji żywych roślin, między innymi w Arboretum w Bolestraszycach i w Ogrodzie Botanicznym w Powsinie, w którym także materiał nasienny pszonaka pienińskiego został wprowadzony do kriogenicznego Banku Nasion (Puchalski i Muranyi 2002; Puchalski i in. 2010). Dla każdej z wymienionych wyżej populacji ex situ pszonaka pienińskiego populacją wyjściową była populacja ze stanowiska locus classicus ze Wzgórza Zamkowego w Czorsztynie. Dzięki posiadaniu dobrze udokumentowanych kolekcji ex situ pszonaka pienińskiego możliwa była molekularna ocena skuteczności dwóch form ochrony ex situ (w postaci kolekcji żywych roślin i kriokonserwacji) dla zabezpieczenia różnorodności genetycznej Erysimum pieninicum przy wykorzystaniu techniki ISSR. Wyjątkowo cenny materiał badawczy stanowiła także populacja ex situ z Arboretum w Bolestraszycach, która została założona w 1986 roku. Opisanie struktury genetycznej tej populacji oraz o piętnaście lat młodszej populacji roślin z kolekcji Ogrodu Botanicznego w Powsinie, umożliwiło molekularną ocenę wpływu długości prowadzenia tego typu ochrony ex situ roślin Erysimum pieninicum na stan zachowania zmienności genetycznej populacji in situ. Najbardziej zbliżonym poziomem różnorodności genetycznej do reprezentowanego przez populację in situ ze Wzgórza Zamkowego pszonaka pienińskiego (Tab. 4), charakteryzowała się populacja z Arboretum w Bolestraszycach (kolekcja żywych roślin) oraz populacja w formie nasion przechowywana kriogenicznie w Banku Nasion w Powsinie. Kolekcja żywych roślin z Ogrodu Botanicznego w Powsinie odznaczała się najniższym poziomem zmienności genetycznej spośród analizowanych populacji pszonaka pienińskiego. Wyniki te sugerowały istnienia największych różnic w genetycznej strukturze między populacją naturalną a populacją ogrodową oraz największego podobieństwa genetycznego między populacją ze Wzgórza Zamkowego (in situ) a populacją z Arboretum w Bolestraszycach. Obie te populacje ex situ różniły się okresem uprawy w ogrodach. Populacja bolestraszycka została założona w 1986 roku i prezentowała wyższy poziom zmienności genetycznej niż założona 15 lat później populacja ogrodowa. Próbując zinterpretować te wyniki, należy uwzględnić genezę powstania i historię obu populacji. Populacja ex situ z Powsina powstała w 2001 roku z siewek wyprowadzonych z nasion zebranych z populacji ze Wzgórza Zamkowego w Czorsztynie. Natomiast populacja ex situ z Bolestraszyc została założona w 1986 roku z nasion pozyskanych z tej samej populacji in situ (http://www.bolestraszyce.com) i w miarę upływu czasu była wzbogacana o nowe osobniki, zwłaszcza w latach 1990-tych, kiedy podczas budowy zespołu zbiorników wodnych na Dunajcu w Nidzicy, na obszarze, gdzie pszonak pieniński ówcześnie obficie występował, zarówno nasiona, jak i dorosłe i juwenilne okazy, były przenoszone do arboretum (Piórecki informacja ustna). Można przypuszczać, że skutki efektu założyciela w przypadku tej populacji 32

Tab. 4. Parametry zmienności genetycznej populacji in situ i ex situ Erysimum pieninicum ex situ in situ parametr Ogród Botaniczny w Powsinie Arboretum w Bolestraszycach Bank Nasion w Powsinie Wzgórze Zamkowe w Czorsztynie N a 33 28 33 47 PP b 34 (18.89) 57 (29.53) 48 (24.87) 65 (36.1) h c N 0.0508 (0.1280) 0.0745 (0.1448) 0.0659 (0.1417) 0.0921 (0.1630) PU d 1 11 1 8 a N liczba badanych osobników b PP liczba produktów polimorficznych (%) c h N d PU różnorodność genetyczna wg Nei a (odchylenie standardowe) liczba produktów unikatowych były niwelowane, lub nawet eliminowane dzięki dużej liczbie osobników założycielskich oraz wzbogaceniu jej o nowe osobniki ze stanowiska naturalnego. Dlatego też pula genowa tej populacji posiada unikatowe genotypy, które decydują o jej stosunkowo wysokim poziomie zmienności genetycznej, a także o jej wyjątkowej wartości konserwatorskiej. Analiza skuteczności różnych form ochrony ex situ oparta na uogólnionym stanie zabezpieczenia zmienności genetycznej populacji in situ Erysimum pieninicum również wskazała na populację bolestraszycką jako najpełniej reprezentującą pierwotną różnorodność genetyczną (Tab. 5). Mimo że populacja ta została założona prawie 30 lat temu, jej struktura genetyczna została ujednolicona w niewielkim stopniu. Populacja z Ogrodu Botanicznego w Powsinie dobrze odzwierciedliła poziom zmienności genetycznej charakterystyczny dla populacji nasion zebranych z reprezentatywnej liczby osobników, pokrywających możliwie największą część naturalnego stanowiska (Wróbel informacja ustna). Jednak charakteryzowała się nieco zawężoną zmiennością genetyczną, co najprawdopodobniej było pochodną efektu wąskiego gardła oraz prowadzenia jej uprawy w przez 9 lat bez wzbogacania jej o nowe osobniki z populacji in Ogród Botaniczny w Powsinie Wzgórze Zamkowe w Czorsztynie Arboretum w Bolestraszycach Wzgórze Zamkowe w Czorsztynie Bank Nasion w Powsinie Wzgórze Zamkowe w Czorsztynie 15,05% 9,81% 6,53% 84,95% 90,19% 93,47% Zmienność genetyczna międzypopulacyjna (in situ versus ex situ) Zmienność genetyczna wewnątrzpopulacyjna (in situ versus ex situ) Ryc. 21. Analiza wariancji molekularnej populacji in situ i ex situ pszonaka pienińskiego (Erysimum pieninicum). situ. Przedstawione powyżej wyniki dowiodły, że ochrona ex situ w postaci kolekcji żywych roślin jest w stanie spełniać wymogi konserwatorskie dla możliwie pełnego zabezpieczenia różnorodności genetycznej wybranego gatunku. Przykład zachowania populacji ex situ pszonaka pienińskiego w Arboretum w Bolestraszycach wydaje się zasługiwać na 33

Tab. 5. Uogólniony stan zabezpieczenia zmienności genetycznej populacji in situ w populacjach ex situ Erysimum pieninicum. Populacja Gd % Gd %>0.05 1>Gd%>0.05 Gd %<0.05 Ogród Botaniczny w Powsinie 89.8 95.0 62.0 28.7 Arboretum w Bolestraszycach 99.4 103.6 96.1 50.0 Bank Nasion w Powsinie 93.7 98.1 80.7 42.8 Gd % Gd %>0.05 1>Gd%>0.05 Gd %<0.05 zmienność genetyczna odzwierciedlona w populacji ex situ zmienność genetyczna odzwierciedlona w populacji ex situ reprezentowana przez produkty o frekwencji p>0.05 zmienność genetyczna odzwierciedlona w populacji ex situ reprezentowana przez produkty o frekwencji 1>p>0.05 zmienność genetyczna odzwierciedlona w populacji ex situ reprezentowana przez produkty o frekwencji p<0.05 szczególną uwagę jako wzór dobrej praktyki konserwatorskiej. Teoretycznie, na podstawie powyższych wyników, można byłoby wnioskować, że profil genetyczny populacji z arboretum jest najbardziej zbliżony do reprezentowanego przez populację naturalną. Dokładniejsze relacje genetyczne między analizowanymi populacjami zostały przedstawione testem AMOVA, gdzie wykazano najmniejsze różnice w genetycznej strukturze między populacją ze Wzgórza Zamkowego, a materiałem zabezpieczonym w Banku Nasion w Powsinie. Przy ocenie skuteczności obu metod ochrony ex situ kriokonserwacji nasion i kolekcji żywych roślin, należy dokonać porównania bezpośrednio populacji in situ z populacją ex situ z ogrodu botanicznego i banku nasion, ponieważ materiał roślinny wykorzystany do ich założenia pochodził z tej samej puli nasion. Nasiona zebrane z populacji ze Wzgórza Zamkowego (populacja in situ), po przeprowadzeniu testów kiełkowania, posłużyły jako materiał wyjściowy do utworzenia populacji żywych roślin. Rozważając efektywność obu metod ochrony ex situ wyrażoną procentowo, populacja żywych roślin reprezentowała 89.8%, natomiast populacja bankowa 93.7% gatunkowej zmienności genetycznej (Tab. 5), co predestynuje kriokonserwację do powszechniejszego stosowania w celu zabezpieczenia różnorodności genetycznej pul genowych taksonów zagrożonych. Mimo że dla około 60% gatunków zagrożonych w skali europejskiej, próbki zachowane w bankach nasion nie reprezentują adekwatnego dla różnorodności genetycznej wybranych gatunków poziomu zmienności genetycznej (Godefroid i in. 2011), zabezpieczenie materiału genetycznego pszonaka pienińskiego w warunkach kriogenicznych wystarczająco pod względem genetycznym reprezentuje zmienność genetyczną populacji naturalnej, dzięki zminimalizowaniu zmian zachodzących na poziomie DNA oraz prawidłowemu pozyskaniu nasion z populacji naturalnej. Nowo wydawane poradniki metodyczne dotyczące zbioru nasion taksonów roślin o wysokich priorytetach konserwatorskich (EN- SCONET 2009) wraz z coraz obszerniejszą wiedzą na temat przechowywania materiału genetycznego w warunkach kriogenicznych, w tym także nasion typu recalcitrant (Walters i in. 2013) oraz kultur in vitro (Keller i in. 2013), stwarzają możliwości realizowania bardzo szeroko zakrojonych działań mających na celu zabezpieczenie różnorodności najcenniejszych elementów flory określonego regionu (Li i Pritchard 2009; Mattana i in. 2012). Poddaje się także w wątpliwość jakość zabezpieczonego w warunkach ex situ materiału roślinnego jako wyjściowego do celów odtworzeniowych gatunków zagrożonych występujących na stanowiskach naturalnych ze względu na zbyt małe zabezpieczenie różnorodności genetycznej (Hogbin i Peakall 1999; Maunder i in. 2004). Jak obrazuje przykład populacji ex situ pszonaka pienińskiego, przy prawidłowo prowadzonej tego typu ochronie, która jest w stanie zagwarantować zachowanie znacznej części puli genowej, istnieją duże szanse na powodzenie programów zachowawczych i odtworzeniowych gatunków zagrożonych. 34

Literatura Agarwal M., Shrivastava Ć. N., Padh Ć. H. 2008. Advances in molecular marker techniques and their applications in plant science. Plant Cell Rep 27: 617 631. Arif I. A., Bakir M. A., Haseeb A. Khan H. A., Al Farhan A. H., Al Homaidan A. A., Bahkali A. H., Al Sadoon M. and Shobrak M. 2010. A brief review of molecular techniques to assess plant diversity. Int Mol Sci 11(5): 2079 2096. Arnaud-Haond S., Alberto F., Teixeira S., Procaccini G., Serrão E. A., Duarte C. M. 2005. Assessing genetic diversity in clonal organisms: low diversity or low resolution? Combining power and cost efficiency in selecting markers. J Hered 96: 434 440. Baryła J. 2005. Warzucha polska Cochlearia polonica E. Fröhlich, uwagi taksonomiczne, siedliska i problemy ochrony. W: Partyka J. (red.). Zróżnicowanie i przemiany środowiska przyrodniczo-kulturowego Wyżyny Krakowsko-Częstochowskiej. Tom 3 Suplement, OPN, Ojców, ss. 35 40. Boczkowska M., Niedzielski M., Puchalski J., 2007. Molecular studies on seed ageing effects in relation to long-term storage of rye seeds. Vorträge für Pflanzenzüchtung, 71: 270-272. BGCI. 2012. International Agenda for Botanic Gardens in Conservation: 2nd edition. Botanic Gardens Conservation International, Richmond, UK, pp. 50 Bramwell D. 2007. The response of botanic gardens to climate change. BGCI. BGjournal 4 (2): 3 8. Brütting C., Hensen I. and Wesche K. 2013. Ex situ cultivation affects genetic structure and diversity in arable plants. Plant Biol 15 (3): 505 513. Booy G., Hendriks R. J. J., Smulders M. J. M., Van Groenendael J. M., Vosman B. 2000. Genetic diversity and the survival of populations. Plant Biol 2: 379 395. Burska A. 1995. Uprawa Cochlearia polonica Fröhlich w Ogrodzie Botanicznym Polskiej Akademii Nauk w Powsinie. Biul Ogr Bot Muz Zbior 4: 3 5. Cieślak E. and Ronikier M. 2006. Zastosowanie analiz DNA w ustaleniu endemicznego statusu Cochlearia polonica i C. tatrae (Brassicaceae). Fragm Flor Geobot Pol 13: 317-325. Cieślak E., Korbecka G., Ronikier M. 2007. Genetic structure of the critically endangered endemic Cochlearia polonica (Brassicaceae): efficiency of the last-chance transplantation. Bot J Linn Soc 155: 527 532. Cieślak E., Kaźmierczakowa R., Ronikier M. 2010. Cochlearia polonica Fröhl. (Brassicaceae), a narrow endemic species of Southern Poland: history of conservation efforts, overview of current population resources and genetic structure of populations. Acta Soc Bot Pol 79 (3): 255 261. Cochrane J.A., Crawford A. D., Monks L. T. 2007. The significance of ex situ seed conservation to reintroduction of threatened plants. Aust J Bot 55: 356 361. Cole C. T. 2003. Genetic variation in rare and common plants. Annu Rev Ecol Evol S 34: 213 237. Csontos P., Rucińska A, Puchalski J. T. 2010. Germination of Erysimum pieninicum and Erysimum odoratum seeds after various storage conditions. Tájökológiai Lapok 8 (4): 1 6. Da Silva J., Donaldson J. S., Reeves G and Hedderson T. A. 2012. Population genetics and conservation of critically small cycad populations: a case study of the Albany Cycad, Encephalartos latifrons (Lehmann). Biol J Linn Soc 105: 293 308. Donaldson J. S. 2009. Botanic gardens science for conservation and global change. Trends Plant Sci 14: 608 613. Dulloo M. E., Hunter D., Borelli T. 2010 Ex situ and in situ conservation of agricultural biodiversity: major advances and research needs. Not Bot Hort Agrobot Cluj 38 (2): 123 135. Dulloo M. E., Nagamura Y. and Ryder O. 2006. DNA storage as a complementary conservation strategy In: de Vicente M. C. and Andersson M. S. (eds.) DNA banks providing novel options for genebanks? Topical Reviews in Agricultural Biodiversity. IPGRI, Rome, Italy, pp. 11 25. Duminil J., Hardy O. J. and Petit R. J. 2009. Plant traits correlated with generation time directly affect inbreeding depression and mating system and indirectly genetic structure. BMC Evol Biol 9: 177 190. Ellstrand N. C. and Elam D. R. 1993. Population genetic consequences of small population size: implications for plant conservation. Annu Rev Ecol Syst 24: 217 242. ENSCONET 2009. ENSCONET Curation Protocols & Recommendations. Zalecenia i protokoły banku nasion. Royal Botanic Gardens, Kew (UK) & Universidad Politécnica de Madrid (Spain). Tłum. K. Łoskot. Leśny Bank Genów Kostrzyca, Miłków, s. 46. Enßlin A., Sandner T.M., Matthies D. 2011. Consequences of ex situ cultivation of plants: genetic diversity, fitness and adaptation of the monocarpic Cynoglossum officinale L. in botanic gardens. Biol Conserv 144: 272 278. European Commission. 2011. The EU Biodiversity Strategy to 2020. Publications Office of the European Union, Luxembourg, pp. 28. Fernández J. and González Martínez S. C. 2010. SOFSOG: a suite of programs to avoid inbreeding in plantation designs. Mol Ecol Res 10: 393 396. Fröhlich E. 1937. Systematische Studien über polnische Esslöffel Cochlearia L. unter Berücksichtung der verwandten Europëischen Arten. Bull Acad Pol Sci Lettr Cl Mat-Nat, Ser B 1: 129 146. Galej K., Matynia D. 2013. Realizacja projektu Ocena stanu populacji oraz ochrona ex situ wybranych, dziko rosnących gatunków roślin rzadkich i zagrożonych na terenie Polski. 47-48. [w:] Kierunki i możliwości rozwoju ogrodów botanicznych i arboretów w Polsce XXI w. Materiały konferencyjne. XLII Zjazd Ogrodów Bot i Arboretów w Polsce, Kraków, 19-21 września 2013 r. ss. 50. Godefroid S., Riviére S., Waldren S., Boretos N., Eastwood R., Vanderborght T. 2011. To what extent are threatened European plant species conserved in seed banks? Biol Conserv 144: 1494 1498. Gòmez O. J., Blair M. W., Frankow-Lindberg B. E., Gullberg U. 2005. Comparative study of common bean (Phaseolus vulgaris L.) landraces conserved ex situ in genebanks and in situ by farmers. Genet Resour Crop Evol 52: 371 380. Guerrant E. O. and Kaye T. N. 2007. Reintroduction of rare and endangered plants: common factors, questions and approaches. Aust J Bot 55: 362 370. Guisan A. and Thuiller W. 2005. Predicting species distribution: offering more than simple habitat models. Ecol Lett 8: 993 1009. Hamilton M. B. 1994. Ex situ conservation of wild plant species: time to reassess the genetic assumptions and implications of seed banks. Conserv Biol 8: 39 49. Hamrick J. L. 1989. Isozymes and the analysis of genetic structure in plant populations. In: Soltis D. E., Soltis P. S. (eds.) Isozymes in Plant Biology. Dioscorides Press, Portland, Oregon, pp. 87-105. Hamrick J. L., Godt M. J. W., Murawski D. A., Loveless M. D. 1991. Correlations between species traits and allozyme diversity: Implications for conservation biology. In: Falk D. A. and Holsinger K. (eds.) Genetics and Conservation of Rare Plants. New York: Oxford University Press, pp. 75 86. Hawkins B., Sharrock S., Havens K. 2008. Plants and climate change: which future? Botanic Gardens Conservation International, Richmond, UK, pp. 40 46. Heywood D. H. and Dulloo M. E. 2005. In situ conservation of wild plant species: a critical global review of best practices. IPGRI Technical Bulletin 11. IPGRI, Rome, Italy, pp. 69 73. Heywood V. H. and Iriondo J. M. 2003. Plant conservation: old problems, new perspectives. Biol Conserv 113: 321 335. Hogbin P. M. and Peakall R. 1999. Evaluation of the contribution of genetic research to the management of the endangered plant Zieria prostata. Conserv Biol 13 (3): 514 522. Husband B. C. and Campbell L. G. 2004. Population responses to novel environmental: implications for ex-situ plant conservation. In: Guerrant E.O., Havens K., Maunder M. (eds.) Ex situ Plant Conservation: Supporting Species Survival in the Wild. Washington: Island Press, pp. 231 266. Husband B. C. and Schemske D. W. 1996. Evolution of the magnitude and timing of inbreeding depression in plants. Evolution 50: 54 70. Kashi Y. and King D. 2006. Simple sequence repeats as advantageous mutators in evolution. Trends Genet 22: 253 259. Kaźmierczakowa R. i Zarzycki K. 2001. Polska Czerwona Księga Roślin. Paprotniki i rośliny kwiatowe. Instytut Botaniki im. W. Szafera PAN, Instytut Ochrony Przyrody PAN, Kraków, ss. 664. Kaźmierczakowa R. 2010. Warzucha polska Cochlearia polonica E. Fröhlich. W: J. Perzanowska (red.) Monitoring gatunków roślin. Przewodnik metodyczny część pierwsza. Inspekcja Ochrony Środowiska, Warszawa, ss. 121 131. Keller E. R. J., Zanke C. D., Senula A., Breuing A., Hardeweg B., Winkelmann T. 2013. Comparing costs for different conservation strategies of garlic (Allium sativum L.) germplasm in genebanks. Genet Resour Crop Evol 60: 913 926. Kolehmainen J., Korpelainen H., Mutikainen P. 2010. Inbreeding and inbreeding depression in a threatened endemic plant, the African violet (Saintpaulia ionantha ssp. grotei), of the East Usambara Mountains, Tanzania. Afr J Ecol 48: 576 587. Korzeniak U. 2001. Erysimum pieninicum (Zapał.) Pawł. Pszonak pieniński. W: Kaźmierczakowa R. i Zarzycki K. (red.) Polska Czerwona Księga Roślin, Paprotniki Rośliny Kwiatowe. Instytut Botaniki im. W. Szafera PAN, Instytut Ochrony Przyrody PAN, Kraków ss. 154 156. Krauss S., Dixon B., Dixon K. W. 2002. Rapid genetic decline in a translocated population of the endangered plant Grevillea scapigera. Conserv Biol 16 (4): 986 994. Kwiatkowska A. 1957. Rozmieszczenie warzuchy polskiej (Cochlearia polonica E. Fröhlich) w okolicy Olkusza. Fragm Flor Geobot 3 (1): 11 15. Laikre L. 2010. Genetic diversity is overlooked in international conservation policy implementation. Conserv Genet 11: 349 354. Lauterbach D., Burkart M., Gemeinholzer B. 2012. Rapid genetic differentiation between ex situ and their in situ source populations: an example of the endangered Silene otites (Caryophyllaceae). Bot J Linn Soc 168: 64 75. Li D. Z., Pritchard H. W. 2009. The science and economics of ex situ plant conservation. Trends Plant Sci 14: 614 621. Linington S. H. 2009. The future of seed banking. Ensconews: The European Native Seed Conservation Newsletter 5: 3 4. Mattana E., Fenu G., Bacchetta G. 2012. Regional responsibility for plant conservation: The 2010 GSPC Target 8 in Sardinia. Plant Biosystems 146 (3): 649 653. Marshall D. R. and Brown A. H. D. 1975. Optimum sampling strategies in genetic conservation. In: Frankel O. H. J. and Hawkes G. (eds.) Crop Genetic Resource for Today and Tomorrow. Cambridge University Press, Cambridge, UK, pp. 53 80. Maunder M., Havens K., Guerrant E.O., Falk D.A. 2004. Ex situ methods: a vital but underused set of conservation resources. In: Guerrant E.O., Havens K., Maunder M. (eds.) Ex situ Plant Conservation: Supporting Species Survival in the Wild. Island Press, Washington DC, pp. 3 20. Melnyk V. and Bilz M. 2011. Cochlearia polonica. In: IUCN 2012. IUCN Red List of Threatened Species. Version 2012.2. dostępne na: www.iucnredlist.org, data pozyskania: 18.06.2013. Menges E. S., Guerrant E.O., Hamzé S., 2004. Effects of seed collection on the extinction risk of perennial plants. In: Guerrant E.O., Havens K., Maunder M. (eds.) Ex situ plant conservation: supporting species survival in the wild. Island Press, Washington DC, pp. 305 324. Michalik S. 1974. Wyżyna Krakowsko-Wieluńska. Wiedza Powszechna, Warszawa. ss. 253 Mikuła A., Makowski D., Walters C., Rybczyński J. 2011. Exploration of cryo-methods to preserve fern gamatophytes. In: Kumar A., Helena Fernandes H., Bahillo A. R. (eds.) Working with Ferns. Issues and Application, Springer, pp: 173-192. Mirek Z. i Piękoś-Mirkowa H. (red.) 2008. Czerwona Księga Karpat Polskich. Instytut Botaniki im. W. Szafera, Instytut Ochrony Przyrody PAN, Kraków, ss. 614. Mirek Z., Zarzycki K., Wojewoda W., Szeląg Z. (red.). 2006. Czerwona Lista Roślin i Grzybów Polski. Instytut Botaniki im. W. Szafera PAN, Kraków, ss. 99. Monder M. 2011. Evaluation of growth and flowering of cultivars derived from the Pimpinellifolia (Rosa pimpinellifolia L.) growing in the Collection of Rose Cultivars in the Botanical Garden of the PAS in Powsin. J Fruit Ornam Plant Res 19 (1): 195-207. Morgante M. and Vogel J. 1994. Compound microsatellite primers for the detection of genetic polymorphism, U.S. Patent Appl. 08/326456. Negri V. and Tiranti B. 2010. Effectiveness of in situ and ex situ conservation of crop diversity. 35

What a Phaseolus vulgaris L. landrace case study can tell us. Genetica 138: 985 998. Nei M. and Li W. H. 1975. Probability of identical monomorphism in related species. Genet Res 26: 31 43. Niedzielski M., Łuczak W., Puchalski J., Gozdowski D.; Kubicka H., 2010. Zmienność fenotypowa form lokalnych żyta ozimego (Secale cereale L.) o zróżnicowanym pochodzeniu geograficznym. Zeszyty Problemowe Postępy Nauk Rolniczych, 555: 269-279. Nybom H. 2004. Comparison of different nuclear DNA markers for estimating intraspecific genetic diversity in plants. Mol Ecol 13:1143 1155. Nybom H. and Bartish I. V. 2000. Effects of life history traits and sampling strategies on genetic diversity estimates obtained with RAPD markers in plants. Perspectives Plant Ecol 3 (2): 93 114. Nyka J. 2006. Pieniny. Przewodnik. Wyd. IX. Wyd. Trawers, Latchorzew ss. 88. Oakley C. G. and Winn A. A. 2012. Effects of population size and isolation on heterosis, mean fitness, and inbreeding depression in a perennial plant. New Phytol 196: 261 270. Oldfield S. F. 2009. Botanic gardens and the conservation of tree species. Trends Plant Sci 14: 581 583. Parga I. C., Saiz J. C. M., Humphries C. J., Williams P. H. 1996. Strengthening the natural and national park system of Iberia to conserve vascular plants. Bot J Linn Soc 121: 189 206. Pavlick B. M. 1997. Perspectives, tools, and institutions for conserving rare plants. Southwestern Nat 42: 375 383. Pawłowska S. 1953. Rośliny endemiczne w Polsce i ich ochrona. Ochr Przyr 21: 1 33. Pawłowski B. 1946. De Erysimis carpaticis, Erysimo hieraciifolio L. affinibus. Acta Soc Bot Pol XVII: 1 23. Pawłowski B. 1972. Szata roślinna gór polskich. Podprowincja karpacka. Dział: Karpaty Zachodnie. Okręg: Pieniny. [W:] Szafer W., Zarzycki K. (red.) Szata roślinna Polski. Tom II. PWN, Warszawa. ss. 215-224. Pence V. C. 2005. In vitro collecting (IVC). I. The effect of collecting method and antimicrobial agents on contamination in temperate and tropical collections. In Vitro Cell Dev Pl 41: 324 332. Piękoś H. 1971. Dendranthema (DC.) Des Moul., Dendranthema (Chryznatema) W: Pawłowski B. i Jasiewicz A. (Red.). Flora Polska Rośliny Naczyniowe Polski i Ziem Osciennych Vol. XII. PWN, Warszawa Kraków, ss. 286 288. Piękoś Mirkowa H. 2006. Zagrożenie różnorodności biologicznej flory Polski w świetle regionalnych czerwonych list W: Mirek Z., Cieślak E., Paszko B., Paul W., Ronikier M. (red.) Rzadkie, ginące i reliktowe gatunki roślin i grzybów. Problemy zagrożenia i ochrony różnorodności flory Polski. Materiały ogólnopolskiej konferencji naukowej. Instytut Botaniki im. W. Szafera PAN, Akademia Rolnicza w Krakowie im. Hugona Kołłątaja, Kraków, 30-31.05.2006, ss. 25 26. Piękoś Mirkowa H. and Mirek Z. 2010. Zagrożenie i ochrona endemicznych roślin naczyniowych występujących w Polsce. Chrońmy Przyr Ojcz 66 (1): 15 26. Pitman N. C. A. and Jørgensen P. M. 2002. Estimating the size of the world s threatened flora. Science 298: 989. Poczai P., Varga I., Laos M., Cseh A., Bell N., Valkonen J. P. T. and Hyvönen J. 2013. Advances in plant gene-targeted and functional markers: a review. Plant Methods 9: 6. Pritchard D. J and Harrop S. R. 2010. A re-evaluation of the role of ex situ conservation in the face of climate change. BGCI. BGJournal 7 (1): 03 06. Puchalski J. T. 1998. Naukowa i społeczna rola ogrodów botanicznych w kraju i na świecie. Materiały ze Zjazdu Ogrodów Botanicznych w Polsce (streszczenia), Cieszyn, 1 5.07.1998., s. 123. Puchalski J. 2000. Banki genów w zachowaniu roślin rzadkich i zagrożonych. Biul Ogr Bot 9: 91 97. Puchalski J. 2004. International programmes for seed preservation of European native plants. Biul Ogr Bot 13: 11-18. Puchalski J. 2006. Rola banków nasion w zachowaniu różnorodności flory europejskiej. W: Mirek Z., Cieślak E., Paszko B., Paul W., Ronikier M. (Red.). Rzadkie, ginące i reliktowe gatunki roślin i grzybów. Problemy zagrożenia i ochrony różnorodności flory Polski. Materiały ogólnopolskiej konferencji naukowej. Instytut Botaniki im. W. Szafera PAN, Akademia Rolnicza w Krakowie im. Hugona Kołłątaja, Kraków, 30-31.05.2006, ss. 29 31. Puchalski J. i Muranyi R. 2002. Opracowywanie metod kiełkowania i kriogenicznego przechowywania nasion roślin zagrożonych i chronionych. Sprawozdanie z działalności statutowej. Ogród Botaniczny CZRB, Warszawa Powsin, ss. 18. Puchalski J. i Gawryś W. 2007. Kolekcje roślin chronionych i zagrożonych oraz gatunków objętych Konwencją Berneńską w polskich ogrodach botanicznych. Biul Ogr Bot 16: 47 184. Puchalski J., Kapler A., Niemczyk M. 2010. Ex situ conservation of Polish endangered plant species in botanical gardens. In: Botanic Gardens and Biodiversity. 200th Anniversary of University Botanic Gardens Ljubljana, European Botanic Gardens Consortium Meeting. University of Ljubljana, Ljubljana, 12-16.05.2010, pp. 94 122. Puchalski J., Kapler A., Niemczyk M., Smieja A., Walerowski P., Krzyżewski A., Podyma W. 2013. Zachowanie ex situ w kriogenicznym banku nasion rzadkich, zagrożonych i chronionych gatunków flory polskiej jako efekt projektu FlorNaturOB. W: Kierunki i możliwości rozwoju ogrodów botanicznych i arboretów w Polsce XXI w. Materiały konferencyjne. XLII Zjazd Ogrodów Botanicznych i Arboretów w Polsce, Kraków, 19-21 września 2013 r. ss. 50. Santana Q. C., Coetzee M. P. A., Steenkamp E. T., Mlonyeni O. X., Hammond G. N. A., Wingfield M. J. and Wingfield B. D. 2009. Microsatellite discovery by deep sequencing of enriched genomic libraries. Biotechniques 46: 217 223. SBSTTA (Subsidiary Body on Scientific, Technical and Technological Advice of CBD). 2010. Progress in the implementation of Global Strategy for Plant Conservation and development of a consolidated update beyond 2010. UNEP/CBD/SBSTTA/14/INF/16. Schemske D. W., Husband B. C., Ruckelshaus M. H., Goodwillie C., Parker I. M. and Bishop J. G.. 1994. Evaluating approaches to the conservation of rare and endangered plants. Ecology 75: 584 606. Secretariat CBD. 2002. Global Strategy for Plant Conservation. Decision No. VI\9. Decisions adopted by the Conference of the Parties to the Convention on Biological Diversity at its six meeting. The Hague, 7-19 April 2002. UNEP/CBD/COP/6/20 pp. 142-155. Secretariat CBD. 2010. Consolidated update of the Global Strategy for Plant Conservation 2011-2020. Decisions adopted by the Conference of the Parties to the Convention on Biological Diversity at its tenth meeting. Nagoya, Japan, 18-29 October 2010. UNEP/CBD/ COP/10/27. pp. 169 177. Sharrock S., Hird A., Kramer A. and Oldfield S. 2010. Saving plants, saving the planet: Botanic Gardens and the implementation of GSPC Target 8. BGCI, Richmond, UK, pp. 14. Sharrock S. and Jones M. 2011. Saving Europe s threatened flora: progress towards GSPC Target 8 in Europe. Biodivers Conserv 20: 325 333. Shulman A., Gupta P., Varshney R. 2004. Organization of retrotransposons and microsatellites in cereal genomes. In: Gupta K.and Varshney R. K. (eds.) Cereal Genomics, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands, pp. 83 118. Strojny W. 1987. Pieniny. Wiedza Powszechna, Warszawa. ss. 185 Tilman D. and Lehman C. 2001. Human-caused environmental change: impacts on plant diversity and evolution. Proc Natl Acad Sci USA 98: 5433 5440. Tribsch A., Schönswetter P., Stuessy T. F. 2002. Saponaria pumila (Caryophyllaceae) and the Ice Age in the European Alps. Am J Bot 89: 2024 2033. Vončina G. i Wróbel I., 2004. Materiały do występowania pszonaka pienińskiego Erysimum pieninicum (Zapał.) Pawł. w Pieninach. Chrońmy Przyr 60 (6): 30 41. Vos P., Hogers R., Bleeker M., Reijans M., van de Lee T., Hornes M, Friters A., Pot J., Paleman J., Kuiper M., Zabeau M. 1995. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Res 23: 4407 4414. Walters C., Berjak P., Pammenter N., 2 Kennedy K., 3 Raven P. 2013. Preservation of recalcitrant seeds. Science 339: 915 916. Wiliams J. G. K., Kubelik A. R., Livak K. J., Rafalski J. A., Tingey S. V. 1990. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Res 18: 6531 6535. Wöhrmann T., de Barros Pinangé D. S., Krapp F., Benko-Iseppon A. M., Huettel B., Weising K. 2013. Development of 15 nuclear microsatellite markers in the genus Dyckia (Pitcairnioideae; Bromeliaceae) using 454 pyrosequencing. Conservation Genet Resour 5: 81 84. Wróbel I 2008. Chryzantema (Złocień) Zawadzkiego. Dendranthema zawadzkii (Herbich) Tzvelev. W: Mirek Z. i Piękoś Mirkowa H. (eds.) Czerwona Księga Karpat Polskich. Instytut Botaniki im. W. Szafera PAN i Instytut Ochrony Przyrody PAN, Kraków, ss. 376 377. Wróbel I. 2010. Pszonak pieniński Erysimum pieninicum (Zapał.) Pawł.W: J. Perzanowska (red.) Monitoring gatunków roślin. Przewodnik metodyczny część pierwsza. Inspekcja Ochrony Środowiska, Warszawa, ss. 132 143. Wróbel I. i Zarzycki K. 2010. Oddziaływanie zespołu zbiorników wodnych Czorsztyn-Niedzica i Sromowce Wyżne na florę i roślinność Pienin. W: Soja R., Knutelski S., Bodziarczyk J. (red.) Pieniny Zapora Zmiany. Monografie Pienińskie, PPN, 2: 185 193. Wyse Jackson P. S. and Sharrock S. 2011. The context and development of a global framework for plant conservation. Bot J Linn Soc 166: 227 232. Zarzycki K. 1976. Małe populacje pienińskich roślin reliktowych i endemicznych, ich zagrożenie i problemy ochrony. Ochr Przyr 41: 7 70. Zarzycki K. 1981. Rośliny naczyniowe Pienin. PWN, Warszawa Kraków, ss. 257. Zarzycki K. 1982. Rośliny wyższe (kwiatowe i paprotniki). Rośliny rodzime. W: K. Zarzycki (red.) Przyroda Pienin w obliczu zmian. Studia Naturae, Ser. B, 30: 127-142. Zarzycki K. i Szeląg Z. 2006. Czerwona lista roślin naczyniowych Polski. W: Z. Mirek, K. Zarzycki, W. Wojewoda, Z. Szeląg (red.) Czerwona lista roślin i grzybów Polski. Instytut Botaniki im. W. Szafera PAN, Kraków, ss. 9 20. Zarzycki K. i Wróbel I. 2012. Przemiany pienińskiej flory roślin naczyniowych w XX wieku. Pieniny Przyroda i Człowiek 12: 43-56. Ziętkiewicz E., Rafalski A., Labuda D. 1994. Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification. Genomics 20: 176 183. Rakoczy Trojanowska M. and Bolibok H. 2004. Characteristics and comparison of three classes of microsatellite-based markers and their application in plants. Cell Mol Biol Lett 9: 221 238. Rice B. E., Smith M. E., Mitchell S. E., Kresovitch S. 2006. Conservation and change: a comparison of in situ and ex situ conservation of Jala maize germplasm. Crop Sci 46: 428 436. Roos E. E., Towill L. E., Walters C. W., Blackman S. A., Stanwood P. C. 1996. Preservation techniques for extending the longevity of plants tissues. In: Stuess T. F. and Sohmer (eds.) Sampling the green world, innovative concepts of collection, preservation, and storage of plant diversity. Columbia Univ. Press, New York, pp. 157 204. Rosetto M., Waver P. K., Dixon K. W. 1995. Use of RAPD analysis in devising conservation strategies for the rare and endangered Grevillea scapigera (Proteaceae). Mol Ecol 4: 321 330. 36

ISBN 978-83-938900-1-9. 2