S ł u p s k i e P r a c e B i o l o g i c z n e 11 2014 ZMIANY BIOAKUMULACJI PIERWIASTKÓW I MARKERÓW STRESU OKSYDACYJNEGO W TKANCE MIĘŚNIOWEJ SMOLTÓW TROCI WĘDROWNEJ (SALMO TRUTTA L.) W LATACH 2009-2011 BIOACCUMULATION OF ELEMENTS AND OXIDATIVE STRESS MARKERS IN THE MUSCLE TISSUE OF SMOLTS OF SEA TROUT (SALMO TRUTTA L.) IN THE YEARS 2009-2011 Katarzyna Pałczyńska-Guguła Halyna Tkachenko Natalia Kurhaluk Akademia Pomorska w Słupsku Instytut Biologii i Ochrony Środowiska Zakład Zoologii i Fizjologii Zwierząt ul. Arciszewskigo 22b, 76-200 Słupsk e-mail: ka.palczynska@wp.pl ABSTRACT The aim of the study was to determine the ecophysiological response in a population of juvenile brown trout from Słupia basin and its drainage areas (Glaźna, Skotawa, Kamienna, Kwacza rivers) by analyzing bio-elements level (Mg, Ca, Zn, Mn, Cu, and Fe), as well as the contents of oxidative stress biomarkers (2-thiobarbituric acid reactive substances, TBARS) and the aldehyde and ketonic derivatives of the oxidative modified proteins). The study involved 175 sea trout smolts. In each fish, muscle tissue was sampled for chemical and biochemical assays. Our study showed that the bio-elements profile in the muscle tissue of juvenile sea trout from Słupia basin was as follows: Glaźna river: Mg, Ca, Fe, Zn, Cu, Mn; Skotawa river: Mg, Ca, Zn, Fe, Cu, Mn; Kamienna river: Mg, Fe, Ca, Zn, Cu, Mn; Kwacza river: Mg, Ca, Fe, Zn, Cu, Mn. In 2009, it has been noted a high levels of aldehyde and ketone derivatives of oxidatively modified proteins in the muscle tissue of sea trout smolts from Słupia basin. High levels of lipid peroxidation and ketone derivatives of oxidative modified proteins in the muscle tissue of sea trout smolts from Kwacza river may indicate about a certain degree of pollution of the river. Słowa kluczowe: pierwiastki, stres oksydacyjny, troć wędrowna, smolty, Słupia Key words: elements, oxidative stress, sea trout, smolts, Słupia basin 149
WPROWADZENIE Gwałtowny rozwój cywilizacji i techniki na świecie doprowadził do znacznej degradacji biosfery, zmieniając niekorzystnie naturalne środowisko bytowania organizmów żywych, zarówno lądowych, jak i wodnych. Różnorodność oddziaływania zanieczyszczeń na biocenozę ekosystemów wodnych przejawia się przede wszystkim znaczną śmiertelnością organizmów wodnych, występowaniem zmian w ich zachowaniu, wzroście, rozwoju i reprodukcji, a także obniżeniem odporności oraz podatnością organizmów na choroby zakaźne i nowotworowe (Jezierska-Madziar i Pińskwar 2008). Mianem bioindykatorów określamy organizmy o specyficznej wrażliwości na czynniki środowiska, których obecność lub brak w ekosystemie może być informacją o stanie środowiska i stopniu jego przekształcenia antropogenicznego. Ryby ze względu na długość życia (od kilku do kilkudziesięciu lat), skomplikowane procesy życiowe (sezonowość żywienia i rozrodu, rozdzielność przestrzenna miejsc żerowania i rozrodu, produkcja ogromnej ilości potomstwa kosztem bardzo niskiej przeżywalności itd.) oraz tendencje do wędrówek określić można mianem bioindykatorów wielkoobszarowych i wieloletnich (Kaleta 2007). Reakcję organizmu ryb na niezadowalający stan czystości środowiska stanowi przede wszystkim rozwój odpowiedzi stresowej, a w konsekwencji zmiany funkcjonowania narządów i tkanek (Barak i Mason 1990). Troć wędrowna należy do gatunków ryb bardzo wrażliwych na zmiany klimatyczne i antropogeniczne. Jest typową rybą dwuśrodowiskową. Rozród, rozwój i wzrost form młodocianych troci odbywa się w rzece, natomiast intensywny wzrost do momentu osiągnięcia dojrzałości płciowej w morzu, do którego ponownie wraca po odbytym tarle (Nyk 1997). Zaliczana jest do gatunków anadromicznych, a więc tych, które w celu rozrodu wędrują w górę rzek i strumieni, aby znaleźć najwłaściwsze warunki do złożenia ikry oraz rozwoju zarodków i narybku. Tarło najczęściej odbywa się w okresie od października do stycznia, gdy temperatura wody obniża się do 5-6 C. Samice składają ikrę w miejscach o kamienisto-żwirowym dnie i szybkim prądzie wody. Złożona w gnieździe ikra obmywana jest chłodną (8-10ºC) i bogatą w tlen wodą. Głównym zagrożeniem dla ikry w tym okresie jest niesiony przez wodę piach oraz zanieczyszczenia, ponieważ zamulają one przestrzenie międzyżwirowe i w ten sposób odcinają ikrę od dostępu tlenu. Konsekwencją tego może być jej obumarcie. Po zakończonym tarle ryby spływają do morza (Opuszyński 1983). W cyklu rozwojowym troci wędrownej wyróżnia się następujące stadia rozwojowe: wylęg, parr, smolt, srebrniak, tarlak oraz kelt. Wylęg, zależnie od temperatury wody, następuje od marca do kwietnia. Larwy mają duży woreczek żółtkowy, którym się odżywiają. Po wyjściu z gniazda młode rybki rozpoczynają samodzielne żerowanie. Narybek troci pozostaje w polskich rzekach przez około dwa lata. Parry intensywnie odżywiają się bezkręgową fauną denną i aktywnie bronią swego terytorium. Młodociane osobniki poddane są procesowi tzw. smoltyfikacji, czyli zespołowi zmian fizjologicznych i fizycznych pod wpływem hormonów umożliwiających im przejście z wody słodkiej do morskiej. W ciele smoltów następują fizyczne zmiany polegające na zaniku barwy i plam stadium parr, wystąpieniu srebrnego ubarwienia i wysmukleniu ciała (Utracka-Minko i in. 2006, Miller 2006). Troć wędrowna jest najcenniejszym gatunkiem ichtiofauny w Słupi, zarówno pod względem przyrodniczym, jak i gospodarczym. Słupia stanowi jedną z głównych rzek 150
Pomorza Środkowego, w których trocie odbywają swoje tarło. Cały obszar jej dorzecza znajduje się na terenie województwa pomorskiego, w jego północno-zachodniej części. Rzeka ta zaliczana jest do rzek małych, ma długość 138,6 km, natomiast obszar jej zlewni to 1310 km 2. Granice zlewni Słupi wyznaczają: od północy zlewnia Bałtyku, od zachodu Wieprzy, od południa Brdy oraz od wschodu zlewnie Łeby i Łupawy. Słupię charakteryzuje szybki, turbulencyjny prąd wody, kamienisto-żwirowe dno, chłodna woda latem, duże ilości źródlisk, dobre natlenienie oraz szybko znikające zmętnienie wód. Rzeka Słupia przyjmuje zanieczyszczenia pochodzące ze źródeł obszarowych, punktowych, liniowych i rozproszonych, których ilość oraz jakość ma istotny wpływ na stan czystości wód rzecznych (Dębowski i in. 2000). Głównymi przyczynami regresji ryb wędrownych w wodach śródlądowych są zabudowy hydrotechniczne rzek uniemożliwiające rybom dostęp do tarlisk oraz zmieniające się pod wpływem antropopresji warunki siedliskowe. Substancje toksyczne, metale ciężkie, zjawisko eutrofizacji oraz zakwaszenie wód to najbardziej niebezpieczne elementy przyczyniające się do degradacji ekosystemów wodnych (Utracka-Minko i in. 2006). Wody, do których uchodzą ścieki pochodzenia przemysłowego, chemicznego oraz metalurgicznego, mogą zawierać połączenia metali toksycznych dla ryb. Do takich należą głównie jony manganu, kobaltu, niklu, chromu, arsenu, kadmu, ołowiu, żelaza, cynku, cyny, złota, rtęci, miedzi i srebra. Mechanizm szkodliwego oddziaływania niektórych z nich na ryby, jak np. żelaza i manganu, związany jest z powstawaniem nierozpuszczalnych wodorotlenków osadzających się na skrzelach lub złożonej ikrze i powodujących zakłócenia w procesie oddychania (Łukjanienko 1974). Niektóre silnie hydrolizujące sole żelaza trójwartościowego, chromu i potasu mogą powodować spadek ph poniżej tolerowanego przez ryby poziomu, a w konsekwencji rozwój procesów chorobowych. Wiele połączeń metali w stanie jonowym wykazuje bezpośrednie, toksyczne oddziaływanie na organizm ryby. Najbardziej szkodliwe są jony metali ciężkich, znacznie mniej jony metali alkalicznych, takich jak potas czy sód oraz metali należących do grupy pierwiastków ziem alkalicznych, np. magnezu i wapnia (Prost 1980). Metale ciężkie po przedostaniu się do zbiorników podlegają kumulacji w osadach dennych w określonych warunkach hydrologicznych i fizykochemicznych, a następnie migrują z osadów do wody, co powoduje jej wtórne zanieczyszczenie. Związki te odkładają się w tkankach zwierząt, a przekroczenie ich optymalnego stężenia działa hamująco oraz toksycznie na wzrost i procesy metabolizmu organizmów żywych (Damek-Poprawa i Sawicka-Kapusta 2004). Objawy występujące u ryb poddawanych działaniu roztworów soli różnych metali polegają na zwiększeniu zapotrzebowania na tlen, a konsekwencją jest przyśpieszona częstotliwość ruchów oddechowych wieczek skrzelowych oraz wydzielanie śluzu na skórze i skrzelach. Wyrazem ogólnego osłabienia i niedotlenienia jest,,dzióbkowanie ryb, brak reakcji na bodźce zewnętrzne i zaburzenie równowagi. W letalnie działających roztworach soli metali dochodzi do coraz powolniejszych ruchów, zwolnionego i nieregularnego rytmu oddychania oraz śmierci ryb. W następstwie działania roztworów soli metali zmiany u ryb dotyczą głównie skóry i skrzeli. Komórki naskórka i nabłonka skrzelowego ulegają pęcznieniu oraz zmianom martwiczym. W grubej warstwie gęstego śluzu pokrywającego skórę i skrzela widoczne są pozostałości złuszczonych komórek (Prost 1980). 151
Zwracając uwagę na ważną rolę pierwiastków w regulacji funkcji fizjologicznych organizmu ryb, postanowiliśmy określić ekofizjologiczne reakcje w populacji młodocianych osobników troci wędrownej w dorzeczu Słupi i obszarów jej zlewni (rzeki: Glaźna, Skotawa, Kamienna, Kwacza) poprzez analizę poziomu biopierwiastków (Mg, Ca, Zn, Mn, Cu i Fe) i zawartości markerów stresu oksydacyjnego (produkty reagujące z kwasem 2-tiobarbiturowym, TBARS oraz aldehydowe i ketonowe pochodne oksydacyjnej modyfikacji białek). Markery stresu oksydacyjnego pomogą określić zmiany w kondycji fizjologicznej ryb w warunkach destabilizacji gospodarki pierwiastkowej. MATERIAŁ I METODY BADAŃ Materiał do badań pobrano od młodocianych osobników troci wędrownej zasiedlających cztery dopływy rzeki Słupi (środkowe Pomorze, Polska zachodnia) rzeki Glaźnę, Skotawę, Kamienną i Kwaczę (cztery stanowiska badawcze) (ryc. 1). Ryc. 1. Dorzecze rzeki Słupi. Dopływy, z których pobrano do badań młodociane osobniki troci wędrownej: Glaźna, Skotawa, Kamienna i Kwacza Fig. 1. Sample of juvenile sea trout were sampled to research from tributaries of Słupia Glaźna, Skotawa, Kamienna, Kwacza rivers Źródło: Miller M. 2006. Pakiet edukacyjny Słupia prezentacja 7. Program edukacyjny ekologii Słupia nasza rzeka. Wojewódzki Fundusz Ochrony Środowiska i Gospodarki Wodnej 152
Stanowisko 1 rzeka Glaźna, wchodzi w skład prawobrzeżnych dopływów Słupi. Długość 15 km, powierzchnia zlewni 86 km 2. Przepływa przez wieś Krępa Słupska i wpada do Słupi przy zachodniej granicy tej wsi, powyżej Słupska (Dębowski i in. 2000). Stanowisko 2 rzeka Skotawa, jest prawobrzeżnym, a zarazem największym dopływem Słupi. Jej długość 45 km, powierzchni zlewni 263 km 2. Swój początek ma w małym jeziorku koło osady Soczyca, a do rzeki Słupi wpływa na jej 75 kilometrze (Dębowski i in. 2000). Stanowisko 3 rzeka Kamienna, lewobrzeżny dopływ Słupi. Długość rzeki 9 km, a powierzchnia jej zlewni wynosi 26 km 2. Źródła tej rzeki znajdują się w pobliżu wsi Powilczyn, a do Słupi uchodzi naprzeciwko ujścia rzeki Skotawy (Dębowski i in. 2000). Stanowisko 4 rzeka Kwacza, jest lewobrzeżnym dopływem Słupi o długości 21 km, powierzchni zlewni 85 km 2. Przepływa przez wieś Kwakowo. Źródła Kwaczy znajdują się w miejscowości Sycewice, a ujście do Słupi na jej 83 kilometrze (Dębowski i in. 2000). Połowy ryb przeprowadzono w ścisłej współpracy z Parkiem Krajobrazowym Dolina Słupi oraz Zarządem Okręgu Polskiego Związku Wędkarskiego w Słupsku. Połowy młodocianych osobników troci wędrownej wykonano metodą elektropołowów agregatem prądotwórczym z przystawką na prąd stały. Z każdej ryby pobrano tkankę mięśniową do oznaczeń chemicznych i biochemicznych. Do przeprowadzenia analiz biochemicznych uzyskana tkanka mięśniowa została zhomogenizowana w schłodzonym buforze 0,1 M Tris-HCl (ph 7,2) w stosunku 1:10. Przygotowany homogenat stanowił właściwy materiał badawczy poddawany dalszym analizom biochemicznym. Intensywność procesów peroksydacji lipidów wyznaczono przez pomiar poziomu produktów reagujących z kwasem 2-tiobarbiturowym (TBARS), które są biomarkerami oksydacyjnych zmian lipidowych błon komórkowych (Kamyshnikov 2004). Produkty oksydacyjnej modyfikacji białek (OMB) oznaczono pomiarem poziomu aldehydowych i ketonowych pochodnych w związkach reszt aminokwasowych białek (Levine i in. 1990, Dubinina i in. 1995). Stopień OMB wyrażono w nmol na mg białka. Poziom białka oznaczono metodą Bradford (1976). W celu zbadania poziomu biopierwiastków próby tkanki mięśniowej każdorazowo pobierano na wysokości płetwy grzbietowej powyżej linii bocznej. Aby określić stężenie Mg, Ca, Zn, Mn, Cu i Fe w tkance mięśniowej, poddano je mineralizacji w mieszaninie 10 ml kwasu azotowego (HNO 3 ) i 5 ml nadtlenku wodoru H 2 O 2 (Matusiewicz 1996, 1999). Oznaczenia zawartości mikro- i makroelementów dokonano metodą płomieniowej spektrofotometrii absorpcji atomowej (płomień powietrze i acetylen), stosując spektrometr AAnalyst 300 PerkinElmer. Poszczególne pierwiastki oznaczano, wykorzystując następujące długości fali: 285,2 nm, 422,7 nm, 213,9 nm, 279,5 nm, 324,8 nm i 248,3 nm. Oznaczając wapń i magnez, w celu wyeliminowania oddziaływania fosforu, do wszystkich próbek dodawano roztwór chlorku lantanu w ilości, która zapewniałaby 0,5-procentowe stężenie La 3+ w badanych roztworach. Powyższe pierwiastki oznaczono według instrukcji dołączonej do spektrometru AAnalyst 300 PerkinElmer. Wyniki zawartości Mn, Cu, Zn, Fe wyrażono w mg na kg świeżej masy, natomiast wyniki zawartości Ca, Mg, Na w mg na 100 g świeżej masy (Analytical Methods for Atomic Absorption Spectroscopy 1996). 153
Otrzymane wyniki badań poddano analizie statystycznej programem STATISTICA 10.0 (StatSoft, Polska). Testu Kołmogorowa-Smirnowa z poprawką Lilleforsa użyto w celu sprawdzenia normalności rozkładu danych. Wszystkie uzyskane dane znajdowały się poza rozkładem normalnym. Do określenia istotności różnic pomiędzy stężeniem metali i biomarkerami stresu oksydacyjnego w grupach ryb w różnych latach i z różnych stanowisk badawczych wykorzystano rangowy test statystyczny Kruskala-Wallisa (p < 0,05) (Zar 1999). WYNIKI BADAŃ I ICH OMÓWIENIE Dynamikę zmian stężenia metali w tkance mięśniowej młodocianych osobników troci wędrownej bytujących w czterech dopływach Słupi (rzeki: Glaźna, Skotawa, Kamienna, Kwacza) przedstawiono na ryc. 2-7. W tkance mięśniowej smoltów pochodzących z Glaźny najwyższe stężenie żelaza odnotowano w roku 2011 (9,06 ± 1,11 mg/kg), a najniższe w 2010 (4,92 ± 0,96 mg/kg) (ryc. 2). Różnice statystycznie istotne dla Glaźny odnotowano pomiędzy rokiem 2009 a 2011 oraz 2010 a 2011. W tkance mięśniowej młodocianych osobników Ryc. 2. Dynamika zmian stężenia żelaza w tkance mięśniowej smoltów troci wędrownej (Salmo trutta L.) bytujących w wytypowanych do badań dopływach Słupi (rzeki: Glaźna, Skotawa, Kamienna, Kwacza) b zmiany statystycznie istotne (p < 0,05) między wartościami z 2010 i 2011 roku c zmiany statystycznie istotne (p < 0,05) między wartościami z 2009 i 2011 roku Fig. 2. Dynamics of changes in the iron concentration in the muscle tissue of sea trout smolts (Salmo trutta L.) inhabiting Słupia basin (Glaźna, Skotawa, Kwacza, Kamienna rivers) b changes statistically significant (p < 0.05) between the values of 2010 and 2011 c changes statistically significant (p < 0.05) between the values of 2009 and 2011 Źródło: opracowanie własne 154
troci wędrownej w latach 2009-2011 oraz 2010-2011 zaobserwowano wzrost stężenia żelaza odpowiednio o 66% (p < 0,05) i 84% (p < 0,05). Najwyższe stężenie żelaza w tkance mięśniowej badanych smoltów zasiedlających Skotawę odnotowano w roku 2011 (7,47 ± 1,03 mg/kg), a najniższe w 2010 (2,84 ± 0,53 mg/kg). Różnice statystycznie istotne odnotowano pomiędzy rokiem 2010 a 2011. Od roku 2010 do 2011 nastąpił u smoltów wyraźny wzrost stężenia żelaza o 163% (p < 0,05). W grupie młodocianych osobników pochodzących z Kamiennej najwyższe stężenie żelaza 12,70 ± 1,71 mg/kg stwierdzono w roku 2011. Natomiast w latach 2009-2010 utrzymywało się na zbliżonym poziomie (ryc. 2). Różnice statystycznie istotne odnotowano pomiędzy rokiem 2009 a 2011 oraz 2010 a 2011. W Kamiennej wysoki wzrost stężenia żelaza w tkance mięśniowej badanych ryb nastąpił w latach 2009-2011 o 237% (p < 0,05). Najniższe stężenie żelaza w tkance mięśniowej młodocianych osobników (3,56 ± 0,34 mg/kg) zanotowano w roku 2010. W roku 2011 stężenie żelaza w tkance mięśniowej wzrosło o 257% (p < 0,05) w porównaniu z rokiem 2010. W grupie smoltów pochodzących z Kwaczy wystąpiła stała tendencja wzrostowa stężenia żelaza w latach 2009-2011. Najwyższe stężenie tego metalu w tkance mięśniowej badanych ryb stwierdzono w 2011 roku 6,53 ± 0,98 mg/kg. Różnice statystycznie istotne odnotowano pomiędzy rokiem 2010 a rokiem 2011. Stężenie żelaza w tkance mięśniowej smoltów w okresie od 2009 do 2011 roku utrzymywało się na zbliżonym poziomie, natomiast w latach 2010-2011 nastąpił wzrost stężenia tego pierwiastka o 145% (p < 0,05). Podsumowując dynamikę zmian stężenia żelaza w tkance mięśniowej smoltów troci wędrownej bytujących w czterech wytypowanych do badań dopływach Słupi, stwierdzamy najwyższy poziom tego metalu w roku 2011 (ryc. 2). Żelazo jest ważnym kofaktorem wielu enzymów regulujących m.in. transport tlenu, oddychanie komórkowe, metabolizm lipidów. Wykazuje ono także właściwości toksyczne, które związane są z tlenem cząsteczkowym (O 2 ). O 2 jest metabolizowany z udziałem dysmutazy ponadtlenkowej do formy nadtlenku wodoru (H 2 O 2 ), który w reakcji Habera-Weissa katalizowanej przez jony (Fe 3+, Fe 2+ ) metali przejściowych uczestniczy w tworzeniu rodnika hydroksylowego (OH. ). Rodnik ten jest wysoce reaktywny, może reagować z DNA oraz lipidami, a w konsekwencji być przyczyną wielu chorób. Dla ryb toksyczne są zarówno trójdodatnie, jak i dwudodatnie jony żelaza (Bańkowski 2006). Spośród połączeń żelaza trójwartościowego o toksycznym oddziaływaniu na ryby wymienić należy chlorek żelazowy FeCl 3, siarczan żelazowy Fe 2 (SO 4 ) 3 oraz wodorotlenek żelazowy Fe(OH) 3. Chlorek żelazowy powoduje obniżenie ph wody (zwłaszcza w wodzie miękkiej), co jest bardzo szkodliwe dla ryb. Natomiast wodorotlenek żelazowy tworzy nierozpuszczalny rdzawy osad na skrzelach, co może być przyczyną śnięcia i uduszenia. Wykazuje on także działanie żrące na tkanki skrzeli, powodując często ich stan zapalny (Prost 1980). Jak podają Kabata-Pendias i Pendias (1999), nadmiar żelaza zakłóca metabolizm innych metali śladowych, np. unieczynnia mangan. 155
W Glaźnie najwyższe stężenie wapnia w tkance mięśniowej smoltów (13,15 ± 2,11 mg/100 g) odnotowano w 2010 roku. Natomiast w latach 2009 i 2011 poziom wapnia w badanej grupie ryb utrzymywał się na zbliżonym poziomie (ryc. 3). Ryc. 3. Dynamika zmian stężenia wapnia w tkance mięśniowej smoltów troci wędrownej (Salmo trutta L.) bytujących w wytypowanych do badań dopływach Słupi (rzeki: Glaźna, Skotawa, Kamienna i Kwacza) b zmiany statystycznie istotne (p < 0,05) między wartościami z 2010 i 2011 roku Fig. 3. Dynamics of changes in the calcium concentration in the muscle tissue of sea trout smolts (Salmo trutta L.) inhabiting Słupia basin (Glaźna, Skotawa, Kwacza, Kamienna rivers) b changes statistically significant (p < 0.05) between the values of 2010 and 2011 Źródło: jak pod ryc. 2 W grupie młodocianych osobników pochodzących ze Skotawy najwyższy poziom wapnia (13,79 ± 1,32 mg/100 g) odnotowano w 2010 roku. W latach 2009 i 2011 stężenie wapnia w tkance mięśniowej badanych osobników utrzymywało się na zbliżonym poziomie (ryc. 3). W grupie smoltów pochodzących ze Skotawy odnotowano różnice statystycznie istotne pomiędzy rokiem 2010 a 2011. Stężenie wapnia w tkance mięśniowej ryb zbadanych w roku 2011 obniżyło się o 72% (p < 0,05) w porównaniu z rokiem 2010. W grupie ryb pochodzących z Kamiennej stężenie wapnia w tkance mięśniowej smoltów zarówno w roku 2009 (9,58 ± 0,52 mg/100 g), jak i w 2010 (9,51 ± 1,04 mg/100 g) utrzymywało się na zbliżonym poziomie. Natomiast w roku 2011 nastąpił spadek stężenia tego pierwiastka o 11% (p < 0,05) w stosunku do roku 2010. W grupie ryb pochodzących z Kwaczy najwyższe stężenie wapnia (12,06 ± 1,19 mg/100 g) odnotowano w roku 2010, a najniższe (8,20 ± 2,43 mg/100 g) w roku 2009. W okresie od 2009 do 2011 roku nie odnotowano zmian statystycznie istotnych dla grup smoltów pochodzących z Glaźny, Kamiennej i Kwaczy. W 2009 roku stężenie wapnia było porównywalne w grupach młodocianych osobników pochodzących z Glaźny (9,82 ± 2,83 mg/100 g), Kamiennej (9,58 ± 0,52 mg/100 g), Skotawy (8,63 ± 0,86 mg/100 g) i Kwaczy (8,20 ± 2,43 mg/100 g). W 2010 roku poziom wapnia był zbliżony w grupach smoltów zasiedlających Glaźnę (13,15 ± 2,11 156
mg/100 g), Skotawę (13,79 ± 1,32 mg/100 g) i Kwaczę (12,06 ± 1,19 mg/100 g). Natomiast w tkance mięśniowej smoltów pochodzących z Kamiennej występował znacznie niższy poziom wapnia (9,51 ± 1,04 mg/100 g) w porównaniu z osobnikami z pozostałych rzek. W roku 2011 bioakumulacja wapnia w tkance mięśniowej młodocianych osobników troci wędrownej była zbliżona w grupach ryb ze Skotawy (8,02 ± 1,01 mg/100 g), Kamiennej (8,55 ± 0,61 mg/100 g), Glaźny (9,77 ± 1,40 mg/100 g) i Kwaczy (10,99 ± 1,6 mg/100 g). Uzyskane wyniki są porównywalne z danymi innych autorów (Łuczyńska i in. 2000a, b, 2011). Jak podaje Łuczyńska (2000a, b, 2011), stężenie wapnia w tkance mięśniowej pstrąga kształtowało się na poziomie 7,6-10,3 mg/100 g, a u łososia na poziomie 10,0-16,5 mg/100 g. Magnez jest składnikiem wielu enzymów biorących udział w reakcjach biochemicznych dostarczających energii i redukujących stres oksydacyjny (Kabata-Pendias i Pendias 1999). Według danych Łuczyńskiej i in. (2011) stężenie magnezu w tkance mięśniowej pstrąga kształtowało się na poziomie 21,9-26,4 mg/100 g, a u łososia na poziomie 22,1-24,5 mg/100 g. Z przeprowadzonych badań wynika, że we wszystkich czterech rzekach wytypowanych do badań Glaźnie, Skotawie, Kamiennej i Kwaczy w tkance mięśniowej smoltów w roku 2010 nastąpił wzrost poziomu magnezu w stosunku do poziomu z roku 2009, natomiast w roku 2011 stężenie tego pierwiastka obniżyło się w porównaniu z rokiem 2010 (ryc. 4). Ryc. 4. Dynamika zmian stężenia magnezu w tkance mięśniowej smoltów troci wędrownej (Salmo trutta L.) butujących w wytypowanych do badań dopływach Słupi (rzeki Glaźna, Skotawa, Kamienna i Kwacza) a zmiany statystycznie istotne (p < 0,05) między wartościami z 2009 i 2010 roku b zmiany statystycznie istotne (p < 0,05) między wartościami z 2010 i 2011 roku c zmiany statystycznie istotne (p < 0,05) między wartościami z 2009 i 2011 roku Fig. 4. Dynamics of changes in the magnesium concentration in the muscle tissue of sea trout smolts (Salmo trutta L.) inhabiting Słupia basin (Glaźna, Skotawa, Kwacza, Kamienna rivers) a changes statistically significant (p < 0.05) between the values of 2009 and 2010 b changes statistically significant (p < 0.05) between the values of 2010 and 2011 c changes statistically significant (p < 0.05) between the values of 2009 and 2011 Źródło: jak pod ryc. 2 157
W Glaźnie najwyższe stężenie magnezu w tkance mięśniowej młodocianych osobników troci wędrownej odnotowano w 2010 roku (32,46 ± 3,77 mg/100 g). W roku 2011 poziom tego pierwiastka był porównywalny do roku 2010. Zmiany statystycznie istotne dla Glaźny odnotowano pomiędzy latami 2009 i 2010 oraz 2009 i 2011. W roku 2010 nastąpił znaczny wzrost stężenia magnezu w tkance mięśniowej smoltów w porównaniu z rokiem 2009 (wzrost o 154%, p < 0,05), natomiast w roku 2011 stężenie tego pierwiastka obniżyło się w porównaniu z rokiem 2010 o 3%. W Skotawie najwyższy poziom magnezu w tkance mięśniowej smoltów odnotowano w 2010 roku (35,94 ± 3,12 mg/100 g). Zmiany statystycznie istotne wystąpiły pomiędzy latami 2009 i 2010 oraz 2010 i 2011. W roku 2010 stężenie magnezu wzrosło o 142% (p < 0,05) w stosunku do roku 2009, natomiast w roku 2011 poziom tego pierwiastka w stosunku do roku 2010 obniżył się o 43%. W Kamiennej najwyższy poziom magnezu (30,23 ± 3,99 mg/100 g) w tkance mięśniowej młodocianych osobników troci wędrownej uzyskano w 2010 roku. W latach 2009 i 2011 stężenie omawianego pierwiastka utrzymywało się na porównywalnym poziomie (ryc. 4). W Kwaczy najwyższe stężenie magnezu (32,30 ± 3,86 mg/100 g) wystąpiło w 2010 roku. U ryb przebywających w rzekach Kamienna oraz Kwacza nie odnotowano zmian statystycznie istotnych. Przeprowadzone badania wykazały, że najwyższy poziom magnezu w tkance mięśniowej smoltów pochodzących z Glaźny, Skotawy, Kamiennej i Kwaczy wystąpił w 2010 roku. Dynamikę zmian stężenia miedzi w tkance mięśniowej smoltów troci wędrownej w czterech wytypowanych do badań dopływach Słupi (rzeki: Glaźna, Skotawa, Kamienna i Kwacza) przedstawiono na ryc. 5. Głównym źródłem zanieczyszczenia wód związkami miedzi są ścieki przemysłowe oraz środki stosowane w rolnictwie, hodowli ryb oraz przeciwgrzybiczne. Najczęstszymi solami miedzi powodującymi zanieczyszczenia środowiska wodnego są chlorki, azotany i siarczany. Toksyczność związków miedzi dla ryb zależy w dużym stopniu od twardości wody. Najbardziej toksyczne są roztwory soli miedziowych w wodach miękkich. Natomiast w wodach twardych powstają nierozpuszczalne węglany i wodorotlenki miedzi o znacznie mniejszej szkodliwości dla ryb. Toksyczność zanieczyszczeń zawierających miedź zwiększa się znacznie przy równoczesnej obecności związków innych metali, np. kadmu i cynku. Wodorotlenek miedzi Cu(OH) 2 tworzy nierozpuszczalny osad, który może pokrywać skrzela, a także powodować śnięcie ryb (Liebmann 1960). Miedź jest elementem składowym wielu metaloenzymów. Enzymy zawierające miedź katalizują reakcje z udziałem tlenu cząsteczkowego lub pochodnych tlenu. Około 60% miedzi zawartej w osoczu występuje w kompleksie z białkiem zwanym ceruloplazminą, która jest potrzebna do utleniania jonów żelaza dwuwartościowego Fe(II) do trójwartościowego Fe(III) i wbudowywania żelaza w cząsteczkę hemoglobiny. Miedź w najwyższych stężeniach jest pierwiastkiem bardzo toksycznym dla komórek. Pierwiastek ten katalizuje reakcję powstawania rodnika hydroksylowego, powodując peroksydację lipidów (Skrajnowska i in. 2010). 158
Ryc. 5. Dynamika zmian stężenia miedzi w tkance mięśniowej smoltów troci wędrownej (Salmo trutta L.) w wytypowanych do badań dopływach Słupi (rzeki Glaźna, Skotawa, Kamienna i Kwacza) a zmiany statystycznie istotne (p < 0,05) między wartościami z 2009 i 2010 roku b zmiany statystycznie istotne (p < 0,05) między wartościami z 2010 i 2011 roku c zmiany statystycznie istotne (p < 0,05) między wartościami z 2009 i 2011 roku Fig. 5. Dynamics of changes in the copper concentration in the muscle tissue of sea trout smolts (Salmo trutta L.) inhabiting Słupia basin (Glaźna, Skotawa, Kwacza, Kamienna rivers) a changes statistically significant (p < 0.05) between the values of 2009 and 2010 b changes statistically significant (p < 0.05) between the values of 2010 and 2011 c changes statistically significant (p < 0.05) between the values of 2009 and 2011 Źródło: jak pod ryc. 2 W grupie ryb pochodzących z Glaźny miedź w najwyższych stężeniach bioakumulowała się w tkance mięśniowej w roku 2011 (0,92 ± 0,09 mg/kg). Różnice statystycznie istotne odnotowano pomiędzy latami 2009 i 2010, 2009 i 2011 oraz 2010 i 2011. Od roku 2009 do roku 2011 następował w tkance mięśniowej ryb systematyczny wzrost stężenia tego pierwiastka. W roku 2010 stężenie miedzi w tkance mięśniowej smoltów było wyższe o 49% (p < 0,05) w stosunku do roku 2009 oraz o 59% w stosunku do roku 2011. Jednak najwyższy wzrost (o 136%, p < 0,05) odnotowano w grupie smoltów z roku 2011 w stosunku do ryb z roku 2009 (ryc. 5). Podobną tendencję wzrostową zaobserwowano w latach 2009-2011 u ryb z Kamiennej i Kwaczy (ryc. 5). U ryb pochodzących z Kamiennej odnotowano różnice statystycznie istotne pomiędzy latami 2009 i 2011 oraz 2010 i 2011. Stwierdzono wzrost stężenia tego pierwiastka o 106% (p < 0,05) w grupie z roku 2011 w stosunku do grupy z roku 2009 oraz o 48% (p < 0,05) u ryb z roku 2010 w stosunku do smoltów z roku 2011 (ryc. 5). U smoltów z Kwaczy najniższa bioakumulacja miedzi wystąpiła w roku 2009 (0,30 ± 0,07 mg/kg), a najwyższa (0,71 ± 0,09 mg/kg) w 2011 roku. Różnice statystycznie istotne odnotowano pomiędzy latami 2009 i 2010. Zaobserwowano wzrost poziomu miedzi w tkance mięśniowej młodocianych troci o 120% (p < 0,05). W grupie młodocianych osobników zasiedlających Skotawę najwyższy poziom miedzi odnotowano w roku 2010 (0,70 ± 0,098 mg/kg). Jednak nie stwierdzono róż- 159
nic statystycznie istotnych w stężeniu miedzi w tkance mięśniowej młodocianych osobników bytujących w tej rzece w latach 2009-2011. Jak wynika z przeprowadzonych badań, najwyższy poziom miedzi w tkance mięśniowej młodocianych osobników pochodzących z Glaźny, Kamiennej i Kwaczy wystąpił w 2011 roku (ryc. 5). Uzyskane wyniki są porównywalne z danymi innych autorów (Drąg-Kozak i in. 2011, Řehulka 2002). Według danych Řehulki (2002) w mięśniach pstrąga tęczowego zawartość miedzi wynosiła 0,54 mg/kg. Podobne wyniki uzyskała Drąg-Kozak i in. (2011). W mięśniach pstrąga tęczowego stężenie miedzi wynosiło 0,54 mg/kg. Dynamikę zmian stężenia manganu w tkance mięśniowej smoltów troci wędrownej bytujących w wytypowanych do badań dopływach Słupi (rzeki: Glaźna, Skotawa, Kamienna i Kwacza) przedstawiono na rycinie 6. Ryc. 6. Dynamika zmian stężenia manganu w tkance mięśniowej smoltów troci wędrownej (Salmo trutta L.) bytujących w wytypowanych do badań dopływach Słupi (rzeki: Glaźna, Skotawa, Kamienna i Kwacza) a zmiany statystycznie istotne (p < 0,05) między wartościami z 2009 i 2010 roku b zmiany statystycznie istotne (p < 0,05) między wartościami z 2010 i 2011 roku c zmiany statystycznie istotne (p < 0,05) między wartościami z 2009 i 2011 roku Fig. 6. Dynamics of changes in the manganese concentration in the muscle tissue of sea trout smolts (Salmo trutta L.) inhabiting Słupia basin (Glaźna, Skotawa, Kwacza, Kamienna rivers) a changes statistically significant (p < 0.05) between the values of 2009 and 2010 b changes statistically significant (p < 0.05) between the values of 2010 and 2011 c changes statistically significant (p < 0.05) between the values of 2009 and 2011 Źródło: jak pod ryc. 2 Mangan aktywuje wiele enzymów, m.in. enzymy oddechowe. Współdziała z witaminami B 1 oraz B 6, a także cytochromami. Pełni on także funkcję przenośnika tlenu w procesach oksydoredukcyjnych tkanek. Jest aktywatorem enzymów regulujących metabolizm białek, lipidów oraz węglowodanów. Jony manganu Mn 2+ stanowią kofaktor wewnątrzmitochondrialnej dysmutazy ponadtlenkowej (Mn-SOD), która bierze udział w zmniejszaniu reaktywnych form tlenu w organizmie (Bańkowski 2006). 160
W grupie ryb pochodzących z Glaźny najwyższe stężenie manganu w stosunku do pozostałych lat odnotowano w roku 2010 (0,031 ± 0,004 mg/kg), a różnice statystycznie istotne pomiędzy rokiem 2010 a 2011. W okresie tym zaobserwowano spadek stężenia manganu w tkance mięśniowej smoltów o 72% (p < 0,05) (ryc. 6). W Skotawie najwyższy poziom bioakumulacji manganu w grupie młodocianych osobników troci wędrownej wystąpił w roku 2010 (0,035 ± 0,002 mg/kg). Różnice statystycznie istotne odnotowano pomiędzy rokiem 2009 a 2010. W roku 2010 w porównaniu z rokiem 2009 nastąpił wzrost stężenia manganu w tkance mięśniowej badanych ryb o 84% (p < 0,05). Natomiast na przełomie lat 2010-2011 poziom tego pierwiastka był porównywalny (ryc. 6). W Kamiennej w latach 2009-2011 poziom manganu systematycznie wzrastał. Najwyższe jego stężenie w grupie badanych smoltów stwierdzono w roku 2011 (0,068 ± 0,006 mg/kg). Różnice statystycznie istotne dla Kamiennej wykazano pomiędzy latami 2009 i 2011 oraz 2010 i 2011. Od 2009 do 2011 roku nastąpił wzrost stężenia omawianego pierwiastka o 209% (p < 0,05), a od 2010 do 2011 roku o 152% (p < 0,05). W grupie ryb pochodzących z Kwaczy poziom manganu w latach 2009-2010 zmieniał się w niewielkim zakresie (ryc. 6), osiągając najwyższe stężenie w roku 2009 (0,028 ± 0,0009 mg/kg). Jednak dla Kwaczy nie odnotowano różnic statystycznie istotnych. Ryc. 7. Dynamika zmian stężenia cynku w tkance mięśniowej smoltów troci wędrownej (Salmo trutta L.) bytujących w wytypowanych do badań dopływach Słupi (rzeki: Glaźna, Skotawa, Kamienna i Kwacza) a zmiany statystycznie istotne (p < 0,05) między wartościami z 2009 i 2010 roku b zmiany statystycznie istotne (p < 0,05) między wartościami z 2010 i 2011 roku c zmiany statystycznie istotne (p < 0,05) między wartościami z 2009 i 2011 roku Fig. 7. Dynamics of changes in the zinc concentration in the muscle tissue of sea trout smolts (Salmo trutta L.) inhabiting Słupia basin (Glaźna, Skotawa, Kwacza, Kamienna rivers) a changes statistically significant (p < 0.05) between the values of 2009 and 2010 b changes statistically significant (p < 0.05) between the values of 2010 and 2011 c changes statistically significant (p < 0.05) between the values of 2009 and 2011 Źródło: jak pod ryc. 2 161
Jak wynika z przeprowadzonych badań, najwyższy poziom manganu w tkance mięśniowej młodocianych osobników troci wędrownej w roku 2009 wystąpił u ryb odłowionych w Kwaczy, w roku 2010 z Glaźny i Skotawy, a w 2011 roku zasiedlających Kamienną. Dynamikę zmian stężenia cynku w tkance mięśniowej smoltów troci wędrownej bytujących w wytypowanych do badań dopływach Słupi (rzeki: Glaźna, Skotawa, Kamienna i Kwacza) przedstawiono na rycinie 7. Cynk jest kofaktorem wielu enzymów proteolitycznych zwanych metaloproteinazami oraz innych enzymów, m.in. dysmutazy ponadtlenkowej (Puzanowska- -Tarasiewicz 2009). Cynk magazynowany jest w komórkach w postaci metaloproteidy zwanej metalotioneiną, która wiąże miedź i inne metale ciężkie. Metalotineina jest obecna w wielu tkankach, a jej synteza zostaje indukowana przez Zn, Cu, Cd, a także bizmut oraz arsen. Białko to chroni komórkę przed toksycznym oddziaływaniem jonów wymienionych metali. Cynk wchodzi w skład dysmutazy ponadtlenkowej (Zn-SOD) oraz uczestniczy w eliminacji wolnych rodników ponadtllenkowych. Zanieczyszczenia naturalnych wód cynkiem pochodzą przede wszystkim ze ścieków fabrycznych. W zbiornikach wodnych najczęściej obecne są chlorki (ZnCl 2 ) i siarczany cynku (ZnSO 4 ) (Bańkowski 2006). Ryby (zwłaszcza narybek) są bardzo wrażliwe na działanie soli cynku. W wodach miękkich i lekko kwaśnych rozpuszczalność, a co się z tym wiąże, toksyczność cynku znacznie wzrasta. Oprócz soli toksyczne oddziaływanie na ryby wykazuje również wodorotlenek cynku Zn(OH) 2. Przy znacznym stężeniu może się osadzać jako nierozpuszczalny osad na skrzelach i powodować śnięcie ryb na skutek upośledzenia oddychania. Ryby wchłaniają związki cynku przez przewód pokarmowy, a następnie kumulują je w wątrobie (Liebmann 1960). W Glaźnie zaobserwowano rosnącą dynamikę zmian stężenia cynku w tkance mięśniowej smoltów troci wędrownej w latach 2009-2011. Różnice statystycznie istotne odnotowano między latami 2009 i 2010 oraz 2009 i 2011. Od roku 2009 do 2010 stężenie tego metalu w rybach wzrosło o 172% (p < 0,05), a od roku 2010 do 2011 o 23% (p < 0,05). W grupie ryb zasiedlających Skotawę najwyższa bioakumulacja cynku nastąpiła w 2010 roku (8,86 ± 0,50 mg/kg). Różnice statystycznie istotne w Skotawie odnotowano pomiędzy latami 2009 i 2010 oraz 2010 i 2011. W roku 2010 wykazano bardzo wysoki wzrost stężenia cynku w tkance mięśniowej młodocianych osobników troci wędrownej (o 310%, p < 0,05) w porównaniu z rokiem 2009 i znaczny spadek stężenie tego pierwiastka (o 268%, p < 0,05) w roku 2011 w porównaniu z rokiem 2010. W grupie ryb pochodzących z Kamiennej w latach 2009-2011 stężenie cynku wykazywało systematyczną tendencję wzrostową. Najwyższy poziom tego metalu odnotowano w roku 2011 (7,94 ± 0,6) mg/kg), a najniższy w roku 2009 (2,58 ± 0,20 mg/kg). Różnice statystycznie istotne w Kamiennej uzyskano między latami 2009 i 2010 oraz 2009 i 2011. W stosunku do roku 2009 stężenie cynku w tkance mięśniowej badanych ryb wzrosło o 169% (p < 0,05) w roku 2010, a bardzo wysoki wzrost stężenia (o 208%, p < 0,05) nastąpił w roku 2011. W grupie młodocianych osobników troci wędrownej pochodzących z Kwaczy poziom cynku w tkance mięśniowej w latach 2010 i 2011 był na zbliżonym pozio- 162
mie (ryc. 7). W całym cyklu badań najwyższy jego poziom odnotowano w 2010 roku 6,51 ± 0,57 mg/kg. Różnice statystycznie istotne wykazano między latami 2009 i 2010 oraz 2009 i 2011. W stosunku do roku 2009 w latach 2010 i 2011 nastąpił bardzo wysoki wzrost stężenia omawianego metalu w rybach odpowiednio: o 299% (p < 0,05) i 272% (p < 0,05). W roku 2009 poziom cynku w tkance mięśniowej młodocianych osobników troci wędrownej zasiedlających Glaźnę, Skotawę oraz Kamienną utrzymywał się na zbliżonym poziomie, uzyskując odpowiednio wartości: 2,31 ± 0,32 mg/kg, 2,16 ± 0,23 mg/kg i 2,58 ± 0,20 mg/kg, natomiast znacznie niższy był u ryb z Kwaczy (1,63 ± 1,34 mg/kg). Niewielkie wahania zawartości cynku stwierdzono dla lat 2010 i 2011 u ryb z Glaźny, Kamiennej i Kwaczy. Stężenie tego metalu w latach 2010 i 2011 wynosiło odpowiednio: w Glaźnie 6,29 ± 0,60 mg/kg i 7,72 ± 0,55 mg/kg, w Kamiennej 6,94 ± 0,650 mg/kg i 7,94 ± 0,61 mg/kg, a w Kwaczy 6,51 ± 0,57 mg/kg i 6,07 ± 0,55 mg/kg. Jedynie w grupie ryb pochodzących ze Skotawy odnotowano nieznaczny wzrost zawartości cynku w 2010 roku do wartości 8,86 ± 0,50 mg/kg i spadek jego poziomu w 2011 roku do 2,41 ± 0,43 mg/kg w porównaniu z pozostałymi rzekami. Łuczyńska i in. (2000a, b, 2011) wykazali, że stężenie cynku w tkance mięśniowej łososia waha się od 2,80 do 4,02 mg/kg, natomiast u pstrąga od 3,34 do 4,99 mg/kg. Reaktywne formy tlenu (RFT) biorą udział w wielu procesach biologicznych, zachodzących w organizmach żywych, takich jak: inaktywacja wirusów i bakterii, aktywacja genów, regulowanie wzrostu komórki, sygnalizacja międzykomórkowa i wewnątrzkomórkowa (Błochowiak i Witmanowski 2010). Niekontrolowany wzrost ilości RFT, spowodowany ich nadprodukcją lub niewydolnością mechanizmów obronnych ustroju, jest określany mianem stresu oksydacyjnego, który leży u podstaw wielu procesów patologicznych zachodzących w organizmach żywych (Pędzik i in. 2010). W wyniku działania RFT z elementami komórkowymi może dochodzić do zmian w strukturze białek, lipidów cukrów czy kwasów nukleinowych (Świderska- -Kołacz i in. 2012). W procesie peroksydacji lipidów nienasycone kwasy tłuszczowe i inne lipidy są utleniane z wytworzeniem nadtlenków. Rodniki kwasów tłuszczowych i nadtlenki lipidów zaburzają czynność i przepuszczalność błon komórkowych, co w konsekwencji doprowadza do utraty ich integralności. Stężenie MDA i nadtlenków lipidów w osoczu krwi i w innych tkankach wzrasta w warunkach zwiększonego wytwarzania RFT. Produkty końcowe peroksydacji lipidów odgrywają w komórkach rolę wtórnych przekaźników. Mogą one reagować z grupami tiolowymi białek. Wykazują działanie mutagenne, kancerogenne i cytotoksyczne. Zmieniają właściwości antygenowe białek, hamują aktywność enzymów oddechowych, replikacyjnych i transkrypcyjnych (Esterbauer i in. 1991). Do oceny zaawansowania procesów wolnorodnikowych w organizmie wykorzystuje się m.in. ocenę stężeń produktów reagujących z kwasem 2-tiobarbiturowym (TBARS) dialdehydu malonowego (MDA) i nadtlenków lipidów (Fitak i Jaźwińska-Grzegorczyk 1999, Król i Konopka 2003). Dynamikę zmian poziomu TBARS oraz aldehydowych i ketonowych pochodnych w tkance mięśniowej młodocianych osobników troci wędrownej bytujących 163
w wytypowanych do badań dopływach Słupi (rzeki: Glaźna, Skotawa, Kamienna, Kwacza) przedstawiono na rycinach 8-10. Ryc. 8. Dynamika zmian poziomu TBARS w tkance mięśniowej smoltów troci wędrownej (Salmo trutta L.) bytujących w wytypowanych do badań dopływach Słupi (rzeki: Glaźna, Skotawa, Kamienna, Kwacza) a zmiany statystycznie istotne (p < 0,05) między wartościami z 2009 i 2010 roku b zmiany statystycznie istotne (p < 0,05) między wartościami z 2010 i 2011 roku c zmiany statystycznie istotne (p < 0,05) między wartościami z 2009 i 2011 roku Fig. 8. Dynamics of changes in the TBARS level in the muscle tissue of sea trout smolts (Salmo trutta L.) inhabiting Słupia basin (Glaźna, Skotawa, Kwacza, Kamienna rivers) a changes statistically significant (p < 0.05) between the values of 2009 and 2010 b changes statistically significant (p < 0.05) between the values of 2010 and 2011 c changes statistically significant (p < 0.05) between the values of 2009 and 2011 Źródło: jak pod ryc. 2 W tkance mięśniowej grupy ryb bytującej w rzece Glaźna najwyższy poziom TBARS odnotowano w 2009 roku 54,71 ± 3,25 nmol MDA/mg białka. Różnice statystycznie istotne wykazano dla lat 2009 i 2010. Zaobserwowano spadek poziomu dialdehydu malonowego o 38% (p < 0,05). U ryb bytujących w Skotawie poziom TBARS w latach 2009-2010 utrzymywał się na zbliżonym poziomie (ryc. 8). Różnice statystycznie istotne uzyskano dla lat 2009 i 2011 oraz 2010 i 2011. Od roku 2010 do 2011 u ryb z tej rzeki nastąpił znaczny spadek TBARS o 39% (p < 0,05). W Kamiennej odnotowano zbliżony poziom TBARS w roku 2009 (31,39 ± 2,76 nmol MDA/mg białka) i w roku 2011 (36,12 ± 4,41 nmol MDA/mg białka). Różnice statystycznie istotne wykazano dla lat 2009 i 2010 oraz 2010 i 2011. Zaobserwowano znaczny spadek poziomu MDA w roku 2010 w stosunku do roku 2009 (o 125%, p < 0,05) oraz spadek poziomu TBARS w tkance mięśniowej młodocianych osobników troci wędrownej w roku 2011 w porównaniu z rokiem 2010 (o 95%, p < 0,05). W tkance mięśniowej młodocianych osobników troci wędrownej bytujących w Kwaczy najwyższe stężenie TBARS odnotowano w roku 2011 (62,78 ± 4,41 nmol 164
MDA/mg białka). Różnice statystycznie istotne odnotowano między latami 2009 i 2010 oraz 2010 i 2011. Jak wynika z przeprowadzonych badań, w roku 2010 nastąpiło zmniejszenie poziomu stresu oksydacyjnego (spadek stężenia TBARS o 55%) w stosunku do roku 2009, natomiast w roku 2011 stres oksydacyjny nasilił się (wzrost stężenia TBARS o 90%) w stosunku do roku 2010. Dynamikę zmian poziomu aldehydowych pochodnych oksydacyjnie modyfikowanych białek (OMP 370 ) w tkance mięśniowej smoltów troci wędrownej bytujących w wytypowanych do badań dopływach Słupi (rzeki: Glaźna, Skotawa, Kamienna, Kwacza) przedstawiono na rycinie 9. Ryc. 9. Dynamika zmian poziomu aldehydowych pochodnych oksydacyjnie modyfikowanych białek (OMB 370 ) w tkance mięśniowej smoltów troci wędrownej (Salmo trutta L.) bytujących w wytypowanych do badań dopływach Słupi (rzeki: Glaźna, Skotawa, Kamienna, Kwacza) a zmiany statystycznie istotne (p < 0,05) między wartościami z 2009 i 2010 roku b zmiany statystycznie istotne (p < 0,05) między wartościami z 2010 i 2011 roku c zmiany statystycznie istotne (p < 0,05) między wartościami z 2009 i 2011 roku Fig. 9. Dynamics of changes in the aldehyde derivates of oxidatively modified protein level (OMP 370 ) in the muscle tissue of sea trout smolts (Salmo trutta L.) inhabiting Słupia basin (Glaźna, Skotawa, Kwacza, Kamienna rivers) a changes statistically significant (p < 0.05) between the values of 2009 and 2010 b changes statistically significant (p < 0.05) between the values of 2010 and 2011 c changes statistically significant (p < 0.05) between the values of 2009 and 2011 Źródło: jak pod ryc. 2 Za oksydacyjne modyfikacje reszt aminokwasowych, grup prostetycznych enzymów, fragmentację czy agregację białek odpowiedzialne są przede wszystkim RFT HO, H 2 O 2 i O 2 (Stadtman i Levine 2000, Naskalski i Bartosz 2000). Prowadzą one do utraty aktywności biologicznej białek. Ze względu na liczne ważne funkcje pełnione przez białka (m.in. strukturalne, katalityczne, ochronne, regulatorowe oraz transportowe) wszelkie modyfikacje, którym one podlegają, w konsekwencji mogą stać się niebezpieczne dla organizmu i być przyczyną wielu chorób. Oksydacyjne uszkodzenia powodują utratę aktywności biologicznej białek, prowadzą do 165
zaburzeń działania wielu transporterów i enzymów oraz naruszają homeostazę wapniową (Ponczek i Wachowicz 2005). Znacznikiem mówiącym o poziomie oksydacyjnych uszkodzeń białek jest stężenie białkowych grup karbonylkowych obecnych w pochodnych aminokwasów o charakterze aldehydów lub ketonów. Powstają one na skutek utlenienia reszt aminokwasowych zawierających wolną grupę aminową, amidową lub hydroksylową reszt tryptofanu oraz proliny (Stadtman i Levine 2000). W grupie badanych ryb pochodzących z Glaźny poziom aldehydowych pochodnych OMB był porównywalny w latach 2009 i 2011 (ryc. 9). Najwyższy poziom aldehydowych pochodnych w tkance mięśniowej młodocianych osobników troci wędrownej uzyskano w roku 2009 (27,57 ± 0,59 nmol/mg białka). Różnice statystycznie istotne dla Glaźny uzyskano między latami 2009 i 2010 oraz 2010 i 2011. Zaobserwowano obniżenie poziomu OMB 370 w tkance mięśniowej grupy smoltów z 2010 roku o 30% (p < 0,05) oraz wzrost badanego parametru o 25% (p < 0,05) (ryc. 9). Podobną dynamikę zmian wykazano w Skotawie oraz Kamiennej. W Skotawie najwyższy poziom aldehydowych pochodnych OMB w tkance mięśniowej badanej grupy ryb odnotowano w roku 2009 (42,24 ± 2,58 nmol/mg białka). Różnice statystycznie istotne w Skotawie wykazano między latami 2009 i 2010, 2009 i 2011 oraz 2010 i 2011. Zaobserwowano znaczny spadek poziomu aldehydowych pochodnych w grupie ryb z roku 2010 w stosunku do roku 2009 (o 103%, p < 0,05) oraz ich wzrost od roku 2010 do 2011 o 39% (p < 0,05). Od roku 2009 do 2011 poziom aldehydowych pochodnych w tkance mięśniowej smoltów obniżył się o 47% (p < 0,05). W Kamiennej różnice statystycznie istotne odnotowano między latami 2009 i 2010, 2009 i 2011 oraz 2010 i 2011. Najwyższy poziom aldehydowych pochodnych w tkance mięśniowej młodocianych osobników troci wędrownej wystąpił w roku 2009 (46,73 ± 2,10 nmol/mg białka). W roku 2010 poziom OMB 370 był najniższy w całym cyklu badań: o 129% (p < 0,05) niższy niż w roku 2009 i o 68% (p < 0,05) niższy niż w 2011. Odnotowano także wzrost poziomu OMB 370 o 36% (p < 0,05) w grupie smoltów z 2011 roku w stosunku do grupy ryb z 2010 roku. W Kwaczy w latach 2009 i 2010 w tkance mięśniowej młodocianych osobników troci wędrownej zaobserwowano zbliżony poziom aldehydowych pochodnych OMB (ryc. 9). Różnice statystycznie istotne odnotowano między latami 2009 i 2011 oraz 2010 i 2011. Jak wynika z przeprowadzonych badań, pomiędzy rokiem 2009 a 2011 nastąpił wzrost poziomu aldehydowych pochodnych w tkance mięśniowej ryb o 24% (p < 0,05) oraz w roku 2011 w stosunku do roku 2010 o 31% (p < 0,05), co świadczy o aktywacji procesów stresu oksydacyjnego w tkance mięśniowej ryb. Dynamika zmian poziomu aldehydowych pochodnych oksydacyjnie modyfikowanych białek (OMP 430 ) w tkance mięśniowej smoltów troci wędrownej bytujących w wytypowanych do badań dopływach Słupi (rzeki: Glaźna, Skotawa, Kamienna, Kwacza) przedstawiono na rycinie 10. Jak wykazały przeprowadzone badania, w grupach ryb pochodzących z czterech rzek najwyższy poziom ketonowych pochodnych oksydacyjnej modyfikacji białek w tkance mięśniowej smoltów troci wędrownej w okresie trzech lat odnotowano w 2009 roku w Kwaczy 53,04 ± 2,35 nmol/mg białka, w Kamiennej 50,12 ± 2,94 nmol/mg białka, w Glaźnie 44,18 ± 1,05 nmol/mg białka i w Skotawie 42,15 ± 2,58 nmol/mg białka. 166
Ryc. 10. Dynamika zmian poziomu ketonowych pochodnych oksydacyjnie modyfikowanych białek (OMB 430 ) w tkance mięśniowej smoltów troci wędrownej (Salmo trutta L.) bytujących w wytypowanych do badań dopływach Słupi (rzeki: Glaźna, Skotawa, Kamienna, Kwacza) a zmiany statystycznie istotne (p < 0,05) między wartościami z 2009 i 2010 roku b zmiany statystycznie istotne (p < 0,05) między wartościami z 2010 i 2011 roku c zmiany statystycznie istotne (p < 0,05) między wartościami z 2009 i 2011 roku Fig. 10. Dynamics of changes in the ketonic derivates of oxidatively modified protein level (OMP 430 ) in the muscle tissue of sea trout smolts (Salmo trutta L.) inhabiting Słupia basin (Glaźna, Skotawa, Kwacza, Kamienna rivers) a changes statistically significant (p < 0.05) between the values of 2009 and 2010 b changes statistically significant (p < 0.05) between the values of 2010 and 2011 c changes statistically significant (p < 0.05) between the values of 2009 and 2011 Źródło: jak pod ryc. 2 Zaobserwowano identyczną dynamikę zmian ketonowych pochodnych pomiędzy latami 2009 i 2010 oraz 2010 i 2011 (ryc. 10). W Glaźnie różnice statystycznie istotne odnotowano między latami 2009 i 2010, 2009 i 2011 oraz 2010 i 2011. Zaobserwowano niższy poziom ketonowych pochodnych w tkance mięśniowej młodocianych osobników troci wędrownej o 51% (p < 0,05) w roku 2010 w stosunku do roku 2009 oraz o 22% (p < 0,05) w stosunku do roku 2011. Natomiast w roku 2011 stwierdzono wzrost poziomu ketonowych pochodnych OMB w grupie badanych ryb o 24% (p < 0,05) w stosunku do roku 2010 (ryc. 10). W grupie ryb pochodzących ze Skotawy zmiany statystycznie istotne odnotowano między rokiem 2009 i 2010 oraz 2010 i 2011. Ketonowe pochodne uzyskały najniższy poziom w roku 2010 o 40% niższy niż w 2009 i o 24% (p < 0,05) niższy niż w 2011. Wśród grupy smoltów bytujących w Kamiennej zmiany statystycznie istotne odnotowano między latami 2009 i 2010, 2009 i 2011 oraz 2010 i 2011. Poziom OMB 430 w tkance mięśniowej badanych ryb w 2010 roku był niższy o 72% (p < 0,05) w stosunku do 2009 roku oraz o 35% (p < 0,05) w stosunku do roku 2011. Zaobser- 167
wowano także wzrost poziomu oksydacyjnej modyfikacji białek dla ketonowych pochodnych w tkance mięśniowej badanych smoltów o 27% (p < 0,05) w roku 2011 w porównaniu z rokiem 2010. W Kwaczy najwyższy poziom ketonowych pochodnych OMB odnotowano w grupie młodocianych osobników troci wędrownej w 2009 roku (53,04 ± 2,35), natomiast w latach 2010-2011 ich poziom był porównywalny. Różnice statystycznie istotne odnotowano między latami 2009 i 2010, 2009 i 2011 oraz 2010 i 2011. W roku 2010 nastąpiło obniżenie poziomu OMB 430 w tkance mięśniowej badanych ryb o 70% (p < 0,05) w stosunku do roku 2009. Odnotowano także obniżenie poziomu ketonowych pochodnych w grupie smoltów zasiedlających Kwaczę o 38% (p < 0,05) w roku 2011 w stosunku do roku 2009. Podsumowując wyniki trzyletnich badań pochodnych oksydacyjnej modyfikacji białek prezentowanych w niniejszej pracy, należy podkreślić, że najwyższy poziom aldehydowych pochodnych OMB w tkance mięśniowej młodocianych osobników troci wędrownej zasiedlających rzeki: Glaźna, Skotawa, Kamienna i Kwacza wystąpił w roku 2009. Analogiczną sytuację zanotowano dla ketonowych pochodnych OMB w grupach badanych ryb pochodzących z Glaźny, Skotawy oraz Kamiennej. Bardzo wysoki poziom zarówno aldehydowych, jak i ketonowych pochodnych OMB może świadczyć o wzmożonym stresie oksydacyjnym w tkance mięśniowej ryb w 2009 roku. W roku tym w tkance mięśniowej badanej grupy smoltów zasiedlających Glaźnę wystąpiła także wysoka intensywność procesów peroksydacji lipidów (wysokie stężenie TBARS). Podobne tendencje mogą świadczyć o wzmożonej antropopresji oraz o zanieczyszczeniu środowiska poprzez kumulację pollutantów. Jak wynika z literatury (Utracka-Minko i in. 2006), na jakość wody w górnym biegu Słupi wpływają zanieczyszczenia dopływające z osiedli i obszarów użytkowanych rolniczo, zagospodarowanie turystyczne jezior oraz zanieczyszczenia z lewobrzeżnych dopływów rzeki. Z kolei czystość środkowego biegu Słupi determinują uchodzące tu dopływy rzek: Bytowa, Kamienica i Brodek. Odpowiednio dolny bieg rzeki przyjmuje zanieczyszczenia niesione przez Skotawę i Kwaczą oraz zanieczyszczenia rolnicze z pobliskich terenów. Zbyt duże zmiany zewnętrznych warunków środowiska powodują śmierć poszczególnych komórek, a w konsekwencji całego organizmu. Żywy organizm broni się przed skutkami tych zmian, dążąc do utrzymania środowiska wewnętrznego komórek w stanie niezmienionym. Ta tendencja do stałości określana jest mianem homeostazy, a stan organizmu wywołany każdym bodźcem zewnętrznym nosi nazwę stresu. Pierwszym objawem stresu jest reakcja alarmowa równoznaczna z uruchomieniem sił obronnych organizmu. Po tym następuje okres oporu, kiedy szkodliwy bodziec jest równoważony odpowiednim działaniem układu wewnątrzwydzielniczego oraz swoistymi procesami zachodzącymi w układach enzymatycznych komórek (Opuszyński 1983). Wpływ zanieczyszczeń antropogenicznych na kondycję fizjologiczną ryb wykazano również w naszych badaniach. Zanotowany przez nas w 2009 roku wysoki poziom aldehydowych i ketonowych pochodnych oksydacyjnie zmienionych reszt aminokwasowych białek oraz markerów peroksydacji lipidów aktywuje mechanizmy funkcjonowania zrównoważonego systemu obrony przed wolnymi rodnikami. W wyniku podobnej aktywacji w roku 2010 stwierdzono wzrost poziomu Ca, Mg, 168