(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/US02/ (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

PL 212117 B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 212117 (21) Numer zgłoszenia: 373958 (22) Data zgłoszenia: 23.04.2002 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: 23.04.2002, PCT/US02/012616 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: 31.10.2002, WO02/085411 (13) B1 (51) Int.Cl. A61K 39/285 (2006.01) C12N 7/00 (2006.01) Opis patentowy przedrukowano ze względu na zauważone błędy (54) Kompozycje farmaceutyczne (30) Pierwszeństwo: 23.04.2001, US, 09/840,751 (73) Uprawniony z patentu: Sanofi Pasteur Biologics Co., Cambridge, US (43) Zgłoszenie ogłoszono: 19.09.2005 BUP 19/05 (72) Twórca(y) wynalazku: RICHARD A. WELTZIN, Lunenburg, US THOMAS P. MONATH, Harvard, US (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 31.08.2012 WUP 08/12 (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Marta Kawczyńska

2 PL 212 117 B1 Opis wynalazku Przedmiotem niniejszego wynalazku są kompozycje farmaceutyczne, zawierające klonalny szczep atenuowanego wirusa krowianki lub jego wirusa potomnego, do stosowania przy szczepieniu przeciwko ospie prawdziwej. Stan techniki Wirus ospy, wywołujący ospę prawdziwą (ang. smallpox virus), należy do rodzaju Orthopoxvirus, do którego należą również wirusy ospy małpiej, ospy krowiej i krowianki. Choroba wywoływana przez główne szczepy wirusa ospy wielkiej (ang. viariola major) cechuje się małą dawką zakaźną (10-100 wirionów), długim okresem inkubacji (średnio 12 dni), gorączką, objawami konstytucjonalnymi, wysypką postępującą do stadium krost, zejściem śmiertelnym niemal 30% osób zakażonych, zaś u osób, które przeżyją pozostawia blizny na twarzy. Choroba szerzy się z człowieka na człowieka drogą oddechową przez kontakt (drogą kropelkową) i ewentualnie przez aerozol. Ospa prawdziwa była jedną z najważniejszych przyczyn chorobowości i umieralności na całym świecie w pierwszej połowie XX wieku. Jednakże, po części z uwagi na brak zwierzęcego rezerwuaru wirusa, systematyczne stosowanie szczepień (żywym, atenuowanym wirusem krowianki) okazało się bardzo skuteczne w zwalczaniu tej choroby. I tak, wdrożony w latach 1967-1977 globalny program eradykacji ospy prawdziwej spowodował wyeliminowanie choroby ze źródeł naturalnych (Fenner i wsp., WHO, Genewa, str. 1460, 1988). Ze względu na nieobecność ospy prawdziwej i ryzyko wystąpienia zdarzeń niepożądanych przy stosowaniu szczepionki zaprzestano rutynowego szczepienia dzieci, personelu szpitalnego i wojskowego, i obecnie immunizacji poddaje się tylko osoby pracujące z wirusami krowianki i wirusami pokrewnymi w laboratoriach. Znaczna część populacji świata nie ma zatem odporności na ospę prawdziwą. Pozostała część populacji ma niewielką odporność resztkową, ponieważ odporność przeciwko ospie utrzymuje się jedynie przez 5 lat po pierwszym szczepieniu i mniej niż przez 20 lat po szczepieniu ponownym. Eradykacja ospy prawdziwej i zaprzestanie szczepień spowodowały więc podatność populacji na skryty atak lub użycie broni biologicznej wykorzystującej wirusa ospy. W przypadku, gdyby wystąpiło takie zdarzenie, bariera immunologiczna populacji byłaby niewystarczająca do opanowania szerzenia się epidemii (Anon. (artykuł redakcyjny), Lancet 353:1539, 1999; Henderson, Science 283:1279-1282, 1999, Henderson i wsp., J.A.M.A. 281:2127-2137, 1999). Ze względu na niepewność w zakresie eradykacji ospy prawdziwej pozostawiono zapasy szczepionki do zastosowania w sytuacji zagrożenia. W Stanach Zjednoczonych, na przykład, początkowo zmagazynowano 155000 fiolek szczepionki (nominalnie 15,5 miliona dawek) produkcji Wyeth Laboratories, pod kontrolą Ośrodków kontroli i profilaktyki chorób (Centers for Disease Control and Prevention - CDC) w Atlancie w stanie Georgia (Stany Zjednoczone). Na spotkaniu Narodowej Komisji Doradczej ds. Szczepionek (National Vaccines Advisory Commitee) w styczniu 1999, CDC przedstawił raport ze stanu narodowego depozytu szczepionki przeciwko ospie prawdziwej. W tym czasie spośród 15,5 miliona dawek, przechowywanych przez firmę Wyeth, 3,4 miliona dawek nie przeszło testów kontroli jakości, natomiast 10,3 miliona przekroczyło termin ważności wyznaczony w ostatnim teście kontrolnym, służącym przedłużeniu terminu ważności, zaś pozostałe 1,7 miliona dawek spełniało wymogi specyfikacji produktu (LeDuc, prezentacja dla Narodowej Komisji Doradczej ds. Szczepionek, Waszyngton D.C., 11-12 stycznia 1999). Oprócz niedostatecznej podaży szczepionek, problemem jest to, że szczepionka pakowana jest w fiolki po 100 dawek, co ogranicza dystrybucję i zwiększa prawdopodobieństwo zmarnowania znacznej ilości produktu w sytuacji nagłej. Oprócz zasobów Stanów Zjednoczonych, pewien zapas szczepionki (Lister, szczep Elstree) przechowywany jest w Narodowym Instytucie Zdrowia Publicznego (National Institute of Public Health), w Bilthoven, w Holandii; również niektóre inne kraje mają zapasy szczepionki przeciwko ospie prawdziwej - w momencie eredykacji ospy zapasy te sięgały 300 milionów dawek. Jednakże problemy podobnej natury, związane ze stabilnością przy przechowywaniu, ograniczyły te zapasy do niespełna 50 milionów dawek (Henderson, Science 283: 1279-1282, 1999). Krótki opis wynalazku Przedmiotem niniejszego wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna, charakteryzująca się tym, że zawiera: (i) klonalny szczep atenuowanego wirusa krowianki, który wyizolowany jest z hodowli komórek, w której hodowano ACAM 1000 (nr depozytu ATCC PTA-3321) lub jego wirusa potomnego, i po podaniu człowiekowi w ilości skutecznej do wywoływania ochronnej lub terapeutycznej odpowiedzi

PL 212 117 B1 3 immunologicznej przeciwko wirusowi ospy prawdziwej u tego człowieka, wykazuje u tego człowieka odpowiednią atenuację, oraz (ii) farmaceutycznie dopuszczalny nośnik lub rozcieńczalnik, przy czym: - wspomniany wirus krowianki ma taką samą zjadliwość, jak szczep wirusa krowianki ACAM1000 (nr depozytu ATCC PTA-3321), - wspomniany wirus krowianki ma taką samą immunogenność, jak szczep wirusa krowianki ACAM1000 (nr depozytu ATCC PTA-3321), i - wspomniany wirus krowianki ma taki sam wzorzec trawienia jak szczep wirusa krowianki ACAM1000 (nr depozytu ATCC PTA-3321) po trawieniu endonukleazą restrykacyjną. Korzystnie wspomniany szczep wirusa krowianki ma taką samą zjadliwość jak Dryvax. Korzystnie wspomniany szczep wirusa krowianki ma taką samą immunogenność jak Dryvax. Korzystnie wspomniany szczep wirusa krowianki wytwarzany jest w ilości takiej samej lub większej niż Dryvax po inokulacji do hodowli komórkowych. Korzystnie wspomniany szczep wirusa krowianki ma taki sam wzorzec trawienia jak Dryvax po trawieniu endonukleazą restrykcyjną. Korzystnie wspomniany szczep wirusa krowianki wytwarzany jest w ilości takiej samej lub większej niż ACAM1000 (nr depozytu ATCC PTA-3321) po inokulacji do hodowli komórkowych Korzystnie wspomniany szczep wirusa krowianki stanowi ACAM 1000 (nr depozytu ATCC PTA-3321). Korzystnie kompozycja ta przeznaczona jest do leczenia zakażenia wirusem ospy prawdziwej u pacjenta. Przedmiotem wynalazku jest ponadto kompozycja farmaceutyczna, charakteryzująca się tym, że zawiera: (i) klonalny szczep atenuowanego wirusa krowianki, który wyizolowany jest z hodowli komórek, w której hodowano Dryvax albo ACAM 1000 (nr depozytu ATCC PTA-3321) lub jego wirusa potomnego i, po podaniu człowiekowi w ilości skutecznej do wywoływania ochronnej lub terapeutycznej odpowiedzi immunologicznej przeciwko wirusowi ospy prawdziwej u tego człowieka, wykazuje u tego człowieka odpowiednią atenuację, oraz, (ii) farmaceutycznie dopuszczalny nośnik lub rozcieńczalnik, przy czym wspomniana kompozycja przeznaczona jest do zastosowania w leczeniu lub profilaktyce zakażenia wirusem ospy prawdziwej u pacjenta, i przy czym - wspomniany wirus krowianki ma taką samą zjadliwość, jak szczep wirusa krowianki ACAM 1000 (nr depozytu ATCC PTA-3321), - wspomniany wirus krowianki ma taką samą immunogenność, jak szczep wirusa krowianki ACAM1000 (nr depozytu ATCC PTA-3321), i - wspomniany wirus krowianki ma taki sam wzorzec trawienia jak szczep wirusa krowianki ACAM1000 (nr depozytu ATCC PTA-3321) po trawieniu endonukleazą restrykacyjną. Korzystnie wspomniana kompozycja przeznaczona jest do podawania wspomnianemu pacjentowi przez skaryfikację. Korzystnie wspomniana kompozycja przeznaczona jest do podawania wspomnianemu pacjentowi w ilości w zakresie od 1x10 4 do 1x10 6 jednostek tworzących łysinki. Zgodnie z wynalazkiem dostarczono stabilne szczepy wirusa krowianki, izolowane z pochodzących z hodowli komórek, w których hodowano Dryvax, które to szczepy mają cechy umożliwiające ich zastosowanie, jako szczepionki przeciwko ospie prawdziwej do stosowania u człowieka. Zgodnie z niniejszym wynalazkiem opisano również sposoby wytwarzania tych szczepów oraz sposoby ich zastosowania do zapobiegania zakażeniom ospą prawdziwą i zachorowaniom na ospę prawdziwą. Zgodnie z tym, w pierwszym aspekcie dostarczono klonalny szczep atenuowanego wirusa krowianki, izolowany z komórek pochodzących z hodowli, w której hodowano Dryvax, i który po podaniu człowiekowi w ilości skutecznej do wywołania ochronnej lub terapeutycznej odpowiedzi immunologicznej przeciwko wirusowi ospy prawdziwej u człowieka, wykazuje dostateczną atenuację w organizmie człowieka. Szczepy klonalne mogą mieć, na przykład, w zasadzie taką samą zjadliwość (wirulencję) i/lub immunogenność jak Dryvax. Wirusa krowianki dogodnie wytwarza się w zasadzie w takiej samej lub większej ilości niż Dryvax po inokulacji do hodowli komórek i/lub wykazuje on w zasadzie taki sam wzorzec trawienia jak Dryvax po trawieniu endonukleazą restrykcyjną. Klonalny szczep może również wykazywać, na przykład, w zasadzie taką samą zjadliwość i/lub immunogenność, jak szczep wirusa krowianki ACAM 1000 (zdeponowany pod numerem ATCC

4 PL 212 117 B1 PTA-3321 19 kwietnia 2001; zob. klon 2, poniżej), przy badaniu w odpowiednich modelach zwierzęcych lub u człowieka. Korzystniej, taki wirus krowianki wytwarza się w zasadzie w takiej samej lub większej ilości niż szczep wirusa krowianki ACAM 1000 po inokulacji do hodowli komórek i/lub wykazuje w zasadzie taki sam wzorzec trawienia, jak szczep wirusa krowianki ACAM 1000 po trawieniu endonukleazą restrykcyjną. Jednym z przykładów opisanego tu wirusa krowianki jest ACAM 1000 (numer depozytu ATCC PTA-3321). W drugim aspekcie przedmiotem niniejszego wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna zawierająca klonalny szczep wirusa krowianki, jak to opisano powyżej i w dalszej części niniejszego opisu, i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik lub rozcieńczalnik. W trzecim aspekcie opisano tu sposób zapobiegania zakażeniu wirusem ospy prawdziwej lub leczenia zakażenia wirusem ospy prawdziwej u pacjenta poprzez podawanie pacjentowi takiej kompozycji farmaceutycznej, jak również zastosowanie takiej kompozycji do tego celu oraz zastosowanie takiej kompozycji do wytwarzania leku do tego celu. Kompozycję farmaceutyczną można podawać pacjentowi, na przykład, poprzez skaryfikację w ilości wynoszącej, na przykład, od 1x10 4 do 1x10 6 jednostek tworzących łysinki. W czwartym aspekcie opisano tu sposób wytwarzania klonalnego szczepu atenuowanego wirusa krowianki do zastosowania jako szczepionka. Sposób ten obejmuje: (i) namnażanie Dryvax w układzie hodowli komórkowej i, (ii) izolowanie z układu hodowli komórkowej klonalnego szczepu wirusa krowianki, wykazującego w zasadzie taką samą zjadliwość, immunogenność, charakterystykę wzrostu w hodowli lub wzorzec trawienia endonukleazą restrykcyjną jak Dryvax lub szczep wirusa krowianki ACAM 1000. Zjadliwość wirusa krowianki można badać tym sposobem, na przykład w teście na skórze królika lub w teście neurowirulencji osesków mysich. Charakterystykę wzrostu w hodowli można oznaczyć stosując, na przykład, ludzkie komórki diploidalne (MRC-5). Zidentyfikowany tym sposobem wirus krowianki po podaniu człowiekowi w ilości skutecznej do wywołania ochronnej lub terapeutycznej odpowiedzi immunologicznej przeciwko wirusowi ospy prawdziwej u człowieka, wykazuje dopuszczalną awirulencję (brak zjadliwości) u człowieka. Wynalazek ma kilka zalet. Na przykład, uprzednio szczepionkę przeciwko ospie prawdziwej wytwarzano poprzez inokulację wirusa krowianki do skóry cieląt i następnie przez zdrapywanie skóry cieląt, w celu zebrania żywego wirusa. Wytworzony nieoczyszczony preparat wirusa był poddawany minimalnemu oczyszczaniu przed zastosowaniem u szczepionych ludzi, przez co powstawała możliwość zanieczyszczenia patogenami. Opisane tu szczepionki wytwarza się w układzie hodowli komórkowej, który jest do przyjęcia według współczesnych standardów wytwarzania szczepionek, przez co szczepionki te są wysoko oczyszczone, co eliminuje ten problem. Dodatkową zaletą zastosowania klonalnych wirusów, takich jak opisane tu wirusy, jest to, że mało prawdopodobna jest zmiana charakterystyki takich wirusów w czasie ich namnażania i wytwarzania szczepionki, w porównaniu z mieszanymi populacjami wirusów. Istotnie twórcy niniejszego wynalazku wykazali, że opisany tu wirus utrzymuje swój fenotyp po wielokrotnych pasażach i namnażaniu w hodowli komórkowej, jest wolny od zanieczyszczeń i można go produkować w hodowlach komórkowych w ilościach odpowiednich do wytwarzania szczepionek na dużą skalę. Inne cechy i zalety niniejszego wynalazku staną się oczywiste po zapoznaniu się z poniższym szczegółowym opisem, rysunkami i zastrzeżeniami. Krótki opis rysunków Fig. 1A-1D, to seria wykresów przedstawiających wyniki doświadczeń, w których oseski mysie poddawano ekspozycji na działanie wskazanych klonów wirusa krowianki, preparatu poliklonalnego wirusa krowianki lub Dryvax. Przedstawiono liczbę myszy, które przeżyły i średni czas przeżycia po takiej ekspozycji. Fig. 2 przedstawia analizę trawienia enzymem restrykcyjnym Hindlll opisanych tu klonów szczepionkowych w porównaniu z poliklonalnym preparatem wirusa i Dryvax. Szczegółowy opis wynalazku Zgodnie z wynalazkiem dostarczono klonalne szczepy atenuowanych wirusów krowianki, które można stosować w sposobach szczepienia przeciwko ospie prawdziwej (to znaczy zakażeniu wirusem variola). Jak to opisano bardziej szczegółowo poniżej, opisane tu atenuowane szczepy wirusa krowianki wytwarza się poprzez izolowanie klonów krowianki z hodowli komórkowych, w których namnażano

PL 212 117 B1 5 Dryvax. Zgodnie z niniejszym wynalazkiem opisano również sposoby zastosowania szczepionek zawierających te wirusy krowianki w zapobieganiu ospie prawdziwej, jak również sposoby wytwarzania takich klonalnych szczepów wirusów krowianki. Opisane tu szczepionki pochodzą z Dryvax (szczep New York City Board of Health, Wyeth Laboratories), który obecnie uzyskał rejestrację w Agencji do Spraw Żywności i Leków Stanów Zjednoczonych (FDA) i składa się z mieszanej populacji wirusów krowianki, wytwarzanych w skórze cieląt i szczepionki te wykazują podobną charakterystykę co Dryvax. Szczepionki muszą wykazywać dostatecznie atenuowaną zjadliwość wobec organizmów ludzi, których szczepi się tymi szczepionkami. Odpowiedni poziom atenuacji może być na przykład poziomem podobnym do obserwowanego w przypadku Dryvax (na przykład takim, który nie różni się od niego w sposób statystycznie istotny), i można go oznaczać dowolnym opisanym poniżej testem in vitro lub in vivo. Cechą wirusa krowianki są jego właściwości neurotropowe lub zdolność do replikacji w komórkach ośrodkowego układu nerwowego i wywoływania stanu zapalnego (na przykład zapalenia mózgu). Opisane tu szczepionki dogodnie nie mają właściwości neurotropowych większych niż Dryvax i nie powodują poszczepiennego zapalenia mózgu u pacjentów, którzy je otrzymują. Takie szczepionki i sposoby opisano bardziej szczegółowo poniżej. Wskazania do zastosowania Podstawowym wskazaniem do zastosowania opisanych tu szczepionek jest zapobieganie ospie prawdziwej w populacjach narażonych lub potencjalnie narażonych na ospę prawdziwą po ataku bioterrorystycznym lub zastosowaniu broni biologicznej. Skuteczność opisanych tu szczepionek jest dogodnie duża (powyżej 95%) i szczepionki te chronią zarówno przed rozprzestrzenianiem się wirusa z człowieka na człowieka, jak i przed pierwotną ekspozycją na dużą dawkę w postaci aerozolu z broni biologicznej. Biorąc pod uwagę to podstawowe wskazanie, opisane tu szczepionki można stosować na przykład do stworzenia nowego narodowego depozytu szczepionki przeciwko ospie prawdziwej (wytworzonej z krowianki), przy czym produkcję można kontynuować co roku, w celu utrzymania ciągłego zapasu ważnej szczepionki przez długi czas. Szczepionki te nie są przeznaczone do rutynowego stosowania, z wyjątkiem pracowników laboratoryjnych poddanych ekspozycji na wirusa krowianki, ospy krowiej, ospy małpiej, ospy prawdziwej lub inne wirusy z rodzaju Orthopoxvirus. Poza tymi sytuacjami szczepionki są przeznaczone do wydania w warunkach nagłych, na polecenie władz właściwych do spraw bezpieczeństwa narodowego i zdrowia publicznego. W takich nagłych warunkach ryzyko wystąpienia zdarzeń niepożądanych związanych z zastosowaniem wirusa krowianki będzie mniej istotne niż potencjalne korzyści z ochrony ludzi przed ospą prawdziwą i ochrony społeczeństwa przed rozprzestrzenianiem się tej choroby. Należy rozumieć, że zastosowanie szczepionek w sytuacjach nagłych może być trudne do skontrolowania, że szczepionkę otrzymają niemowlęta, które narażone są na większe ryzyko poszczepiennego zapalenia mózgu i że może dojść do zignorowania środków ostrożności i przeciwwskazań do zastosowania szczepionki u osób z niektórymi chorobami (takimi jak na przykład wyprysk, ciąża i immunosupresja w wywiadzie). Dlatego też istotne jest, aby opisane tu szczepionki wytwarzane z hodowli komórkowej nie wykazywały zjadliwości większej niż produkt obecnie zarejestrowany. W zależności od wydarzeń, których nie można dokładnie przewidzieć, może zostać podjęta decyzja o rozpoczęciu działań profilaktycznych uprzedzających ewentualną ekspozycję pewnych grup, takich jak personel wojskowy, cywilny personel medyczny i tak zwane osoby pierwszej reakcji. Profil bezpieczeństwa szczepionek w tych grupach, jakkolwiek ma duże znaczenie, jest poprawiony poprzez to, że produkt podaje się rozmyślnie i unika się zastosowania go u osób narażonych na zdarzenia niepożądane. W takich warunkach głównym ryzykiem jest: autoinokulacja, krowianka oczu i przypadkowe zakażenie - wszystkie te zdarzenia niepożądane wykazują tendencję do samoograniczania się. Istnieje niewielkie ryzyko przypadkowego zakażenia innych osób, u których występują czynniki ryzyka. Oczywiście, jeżeli warunki w kraju lub na świecie zmienią się w taki sposób, że za pożądane uzna się rutynowe szczepienie dodatkowych członków populacji (na przykład dzieci) lub nawet całej populacji, opisane tu szczepionki mogą być stosowane również do tego celu. Sposoby podawania i podawane ilości Opisane tu szczepionki wytwarza się poprzez namnażanie pożądanego szczepu wirusa krowianki (na przykład szczepu ACAM 1000, nr depozytu ATCC PTA 3321, zob. niżej) w układzie hodowli komórkowej i oczyszczenie hodowanego szczepu z układu z zastosowaniem standardowych metod. Szczep taki można na przykład hodować w diploidalnych ludzkich komórkach fibroblastów płuc, takich jak komórki MRC-5, w pierwotnych komórkach fibroblastów zarodków kurzych lub dowolnym innym

6 PL 212 117 B1 odpowiednim typie komórek, który może określić specjalista. Hodowlę można prowadzić w dowolnym odpowiednim układzie, takim jak na przykład Nunc Celi Factory. Oczyszczonego wirusa można liofilizować do późniejszego zastosowania lub można wytwarzać z niego bezpośrednio preparat w roztworze farmaceutycznym. Ze stanu techniki znane są liczne farmaceutycznie dopuszczalne roztwory do zastosowania w wytwarzaniu szczepionek, które specjalista może łatwo zaadaptować do zastosowania w niniejszym wynalazku (zob. na przykład Remington's Pharmaceutical Sciences, wydanie 18, pod red. A. Gennaro, 1990, Mack Publishing Co., Easton, PA, Stany Zjednoczone). Wirusy można jednak po prostu rozcieńczać w fizjologicznie dopuszczalnym roztworze, takim jak jałowy roztwór soli fizjologicznej lub jałowy zbuforowany roztwór soli fizjologicznej, ewentualnie z dodatkiem adiuwantu lub nośnika. Roztwór farmaceutyczny może ewentualnie zawierać składnik zapewniający lepkość (glicerol) i/lub składnik o właściwościach bakteriobójczych (na przykład fenol). Szczepionki można przechowywać w stężeniu wynoszącym 10 7-10 9 jednostek tworzących łysinki (PFU)/ml, na przykład 10 8 PFU/ml. Opisane tu szczepionki, można podawać pacjentom, na przykład, poprzez skaryfikację standardowymi sposobami. W tej metodzie, można na przykład stosować rozdwojoną igłę. Zamiast tego szczepionkę można podawać dowolną inną standardową drogą, którą specjalista uzna za dopuszczalną. Na przykład szczepionkę można podawać poprzez wstrzyknięcie podskórne lub śródskórne lub inną drogą pozajelitową, na przykład przez wstrzyknięcie domięśniowe. Dorosłemu, o przeciętnych wymiarach ciała, szczepionkę można podawać w ilości na przykład 1x10 4-1x10 6 jednostek tworzących łysinki jako swoisty przykład można podać zastosowanie 2,5x10 5 jednostek tworzących łysinki. Szczepienie dogodnie prowadzi się przed ewentualną ekspozycją na ospę prawdziwą, lecz szczepienie można również przeprowadzić u pacjentów, którzy zostali już poddani ekspozycji na ospę prawdziwą, dogodnie w ciągu kilku dni od ekspozycji. Szczepienie można przeprowadzić tylko jeden raz w życiu danej osoby lub można powtarzać po pewnym czasie, takim jak kilka lat (na przykład po 5, 10 latach), według zaleceń specjalisty. Identyfikacja potencjalnych szczepów szczepionkowych Zgodnie z niniejszym wynalazkiem opisano również sposoby identyfikacji potencjalnych szczepów wirusa krowianki nadających się do wytwarzania szczepionki. Szczepy takie można identyfikować poprzez izolowanie szczepów klonalnych z hodowli komórkowych inokulowanych Dryvax i poprzez określenie charakterystyki tych klonów dowolną z opisanych poniżej metod in vivo lub in vitro. Potencjalny szczep można na przykład porównać z Dryvax pod względem wielkości łysinek, wydajności otrzymywania w hodowli komórkowej (na przykład z zastosowaniem komórek MRC-5), zjadliwości skórnej u królika, neurowirulencji u osesków mysich, neurowirulencji u małp lub ochrony w mysim modelu ekspozycji. Zalecanymi potencjalnymi szczepami są szczepy, których zjadliwość jest podobna lub mniejsza od zjadliwości Dryvax, i które wywołują ochronną odpowiedź immunologiczną podobną lub większą niż Dryvax i wykazują charakterystykę wzrostu podobną lub przewyższającą charakterystykę dla Dryvax. Przed dokonaniem niniejszego wynalazku izolowanie klonalnego szczepu o odpowiedniej charakterystyce, w przypadku oceny szczepu pod kątem możliwości wytwarzania z niego szczepionek, było nieprzewidywalne, ponieważ długa historia pasaży krowianki spowodowała wytworzenie wielu subpopulacji odmian (to znaczy rój (ang. swarm) genetyczny), o potencjalnie różnych właściwościach biologicznych. Nie było również pewne czy dana pojedyncza odmiana izolowana poprzez oczyszczenie z łysinki (to znaczy klonowanie biologiczne) będzie miała taką charakterystykę fenotypową, jak suma wielu odmian w oryginalnej, mieszanej populacji wirusa. Istotnie, przed dokonaniem niniejszego wynalazku byłoby nawet zadziwiające, gdyby tak właśnie było. Opracowanie i charakterystykę przedkliniczną opisanych tu szczepionek przedstawiono poniżej. Opracowanie i przedkliniczna charakterystyka szczepionek krowianki Jak to omówiono powyżej, Dryvax jest szczepionką krowianki, obecnie zarejestrowaną przez FDA, pochodzącą ze szczepu New York City Board of Health (NYCBH), która była produkowana przed rokiem 1982 przez Wyeth-Lederle metodą limfatyczną u cieląt (zob. również depozyt ATCC nr VR-325). Dryvax składa się z żywego, atenuowanego wirusa krowianki i nie występuje, jako produkt hodowli komórkowej. Twórcy niniejszego wynalazku zaadaptowali wykorzystywanego do szczepień przeciwko ospie prawdziwej wirusa krowianki do namnażania w kontrolowanych warunkach, w laboratoryjnych hodowlach ludzkich fibroblastów płuc tak, aby do wytwarzania szczepionki można było wykorzystać nowoczesne techniki. W celu opracowania szczepionki z hodowli komórkowej musieli oni oddzielić Dryvax od potencjalnych zanieczyszczeń wirusowych, poprzez pasaż

PL 212 117 B1 7 w ostatecznym rozcieńczeniu i przeprowadzili to z klonowaniem i bez klonowania, jak to omówiono bardziej szczegółowo poniżej. Z mieszaniny odmian ( roju genetycznego) w Dryvax, wybrali oni potencjalne szczepionki o podobnej charakterystyce biologicznej u zwierząt i wykazujące podobieństwo genomowe do szczepionki zarejestrowanej, co zapewniało w dużym stopniu pewność, że będą one wykazywały skuteczność kliniczną podobną jak oryginalny produkt z węzłów chłonnych cieląt. W jednym ze sposobów stosowanych do adaptacji, wirusa krowianki klonowano w celu oddzielenia wirusa od ewentualnych zanieczyszczających go drobnoustrojów pochodzących ze skóry cieląt. Tym sposobem wyizolowano 6 klonów. Sklonowane wirusy wykazywały wiele cech mniejszej lub większej zjadliwości w porównaniu z Dryvax. Niespodziewanie, biorąc pod uwagę oczekiwaną mieszaninę odmian w Dryvax stwierdzono, że 3 klony były podobne do Dryvax w testach zjadliwości u zwierząt i różniły się głównie szybkością wzrostu w hodowli komórkowej. W opisanym tu sposobie szczepienia przeciwko ospie prawdziwej można wykorzystać dowolny z tych szczepów, jak również inne szczepy o podobnej charakterystyce. W innym sposobie wirusa nie klonowano, oczekując, że wirus wytworzony tym sposobem będzie z większym prawdopodobieństwem zachowywać się tak jak szczep, z którego pochodzi. Niespodziewanie jednak stwierdzono, że szczep wyprodukowany bez klonowania, choć zachowywał się podobnie do Dryvax w testach in vitro, nie wykazywał charakterystyki szczepu szczepionkowego, jednak w istocie był bardziej zjadliwy w testach na zwierzętach laboratoryjnych. Skupiono zatem wysiłki w zakresie opracowania szczepionki na wirusach sklonowanych o charakterystyce podobnej do szczepu szczepionkowego Dryvax. Szczegółową charakterystykę przedstawiono poniżej. Dryvax inokulowano do hodowli komórek MRC-5 i uzyskano 6 klonów wirusa krowianki poprzez oczyszczenie z łysinek. Każdy klon ponownie klonowano - dwukrotnie - dla zapewnienia klonalności i braku zanieczyszczeń. Dryvax inokulowano również do hodowli komórek MRC-5 przy wielokrotności zakażania (MOI) 0,001 PFU na komórkę, w celu uzyskania nieklonowanego (poliklonalnego) preparatu wirusa. Wirus ten następnie pasażowano dwukrotnie jeszcze w komórkach MRC-5 przy niskim MOI. Wszystkie 6 klonów i preparat poliklonalny badano w szeroko zakrojonej serii analiz porównawczych wraz z Dryvax, w celu ustalenia charakterystyki in vitro i in vivo. W szczególności, każdy klon i preparat poliklonalny analizowano pod kątem morfologii łysinek, wydajności otrzymywania w komórkach MRC-5, wzorca mapowania endonukleazą restrykcyjną, tworzenia blizn skórnych u królików i neurowirulencji u myszy. Podgrupę klonów badano jeszcze pod kątem wywoływania ochronnej odpowiedzi immunologicznej u myszy. Celem było wybranie z puli Dryvax szczepu szczepionkowego wykazującego biologiczne podobieństwo do Dryvax. W tabeli 1 podsumowano wyniki tych badań. T a b e l a 1 Charakterystyka 7 wirusów krowianki potencjalnie nadających się do wytworzenia szczepionki Test Wyniki (w stosunku do testów jakościowych Dryvax ) Dryvax Klon 1 Klon 2 Klon 3 Klon 4 Klon 5 Klon 6 Preparat poliklonalny Wielkość płytki (średnia-mm) Wydajność w MRC-5* 0,42 0,43 0,49 0,36 0,65 0,25 0,27 0,46 4,0 13,5 7,0 10,6 15,6 4,7 1,5 7,0 Analiza RE Test skórny u królika Wysoka Wysoka Wysoka Wysoka Neurowirulencja u osesków mysich Wysoka Wysoka Wysoka Wysoka Immunogenność u myszy Nie badano Nie badano Nie badano Nie badano * pfu/ml x 10 6

8 PL 212 117 B1 Na podstawie tych badań stwierdzono, że klony 2 i 4 wykazują charakterystykę umożliwiającą ich wykorzystanie do wytwarzania nowej szczepionki przeciwko ospie prawdziwej. Klon 6 również wykazuje odpowiednią charakterystykę, jednak nie wykazuje tak dobrego wzrostu w hodowli jak klony 2 i 4. Neurowirulencja u osesków mysich Stwierdzono, że dorosłe myszy są niepodatne na wewnątrzczaszkową (IC) inokulację niezmodyfikowanego Dryvax. Opracowano zatem test u osesków mysich. Oseskom mysim (w wieku 3-4 dni) wstrzykiwano dziesięciokrotne rozcieńczenie wirusa i oznaczano czas przeżycia. Przeprowadzono 3 doświadczenia, przy czym w każdym z nich jako wzorzec testowano Dryvax. Stwierdzono, że u osesków mysich inokulowanych IC z użyciem Dryvax zawsze rozwijało się śmiertelne zapalenie mózgu, przy czym LD 50 wynosiło 1,0 log 10 PFU, natomiast średni czas do zgonu wynosił 7 dni. Test ten uznano zatem za użyteczny do porównywania neurowirulencji potencjalnych szczepionek z macierzystym Dryvax. Wyniki tych doświadczeń podsumowano w tabeli 2, natomiast liczbę myszy, które przeżyły i średni czas przeżycia, jakie stwierdzono w tej analizie przedstawiono na Fig. 1A-1D. T a b e l a 2 Neurowirulencja u osesków mysich, potencjalne szczepionkowe szczepy krowianki Parametr Doświadczenie Wirus LD 50 1 LD 90 1 AST 2 (SD) 1 Dryvax 1,68 3,03 7,78 (4,19) Preparat poliklonalny <1,3 1,94 6,09 (1,14) Klon 1 <2,3 <2,3 4,20 (1,03) 2 Dryvax 1,3 2,1 6,67 (0,71) Klon 2 1,55 2,25 6,80 (2,74) Klon 3 <1,3 <1,3 5,00 (1,16) Klon 4 2,59 3,16 6,11 (1,36) 3 Dryvax 2,4 4,15 8,64 (3,42) Klon 5 <1,3 <1,3 4,08 (1,08) Klon 6 1,57 2,47 7,73 (4,63) 1 1 2 50% domózgowej dawki letalnej na jedno wstrzyknięcie 0,02 ml w dniu 10 zakażeniu 90% domózgowej dawki letalnej na jedno wstrzyknięcie 0,02 ml w dniu 10 zakażeniu średni czas przeżycia w dniach (odchylenie standardowe) przy 10-100 LD 50 W celu zbadania zjadliwości potencjalnych szczepionek można zastosować dodatkowe testy. Twórcy niniejszego wynalazku opracowali sposób badania zjadliwości w teście skórnym u królików. Test ten udało się opracować z zastosowaniem śródskórnej inokulacji niepasażowanego Dryvax, co spowodowało wystąpienie zależnych od dawek zmian o typie blizn po ospie, cechujących się zaczerwienieniem, stwardnieniem i w niektórych przypadkach zmianą na środku. Jako inny przykład można wymienić test neurowirulencji u małp. W tym teście pochodzący ze sklonowanego Dryvax potencjalny szczep testuje się w porównaniu z Dryvax poprzez inokulację IC, stopniowanymi dawkami wirusa. Twórcy niniejszego wynalazku opracowali również mysi model ekspozycji do testów ochronnych. W tym modelu szczep WR krowianki zastosowano do ekspozycji myszy w wieku 6-8 tygodni drogą donosową (IN). LD 50 wynosi 4,5 log 10 PFU, natomiast średni czas do zgonu wynosi 6-7 dni po ekspozycji. Test ten ma dostatecznie dużą moc do zastosowania w badaniach przedklinicznych działania ochronnego potencjalnej nowej szczepionki. Można również stosować podobne modele z zastosowaniem innych wirusów z grupy Orthopoxvirus, takich jak na przykład wirus ospy krowiej. Badano zdolność Dryvax oraz klonów 2 i 4 do wywoływania ochronnej odpowiedzi immunologicznej przeciwko szczepowi WR krowianki. Badano również klon 3 w celu ustalenia, czy klon o większej zjadliwości, również wywołuje większą odpowiedź immunologiczną. Myszy w wieku 4 tygodni

PL 212 117 B1 9 uodparniano stopniowanymi dawkami każdego szczepu wirusa. Wirus wszczepiano do skóry poprzez skaryfikację rozdwojoną igłą, to znaczy taką samą metodą jak stosowana do szczepienia ludzi preparatem Dryvax. Trzy tygodnie po immunizacji myszy eksponowano na działanie 6,5 log10 PFU (100 LD 50 ) szczepu WR krowianki drogą IN. Ustalano współczynnik przeżycia po 14 dniach od ekspozycji. W przypadku wszystkich szczepów wirusa obserwowano zależne od dawki działanie ochronne i wszystkie klony chroniły myszy co najmniej równie dobrze jak Dryvax. Nie stwierdzono różnic w zakresie aktywności ochronnej pomiędzy poszczególnymi klonami. Średni czas przeżycia przy różnej dawce uodparniającej podano w tabeli 3, natomiast 50% dawki ochronne (PD 50 ) przedstawiono w tabeli 4. T a b e l a 3 Czas przeżycia myszy immunizowanych po ekspozycji na 100 LD 50 szczepu WR krowianki Dawka immunizująca (log 10 pfu/ml) Średni czas przeżycia w dniach Dryvax Klon 3 Klon 2 Klon 4 8 14,0 NT 14,0 NT 7 14,0 14,0 14,0 14,0 6 12,0 14,0 12,4 12,4 5 7,6 8,8 7,2 7,0 4 5,2 5,2 7,8 5,4 3 5,6 5,4 5,4 4,8 2 5,2 5,8 5,2 NT T a b e l a 4 50% dawki ochronne Dryvax i potencjalnych szczepionek PD 50 (log 10 pfu) Dryvax Klon 3 Klon 2 Klon 4 5,5 5,2 5,4 5,5 Analiza endonukleazami restrykcyjnymi Oczyszczono DNA z Dryvax oraz z każdej potencjalnej szczepionki i poddawano trawieniu endonukleazą restrykcyjną z użyciem Hindlll, w celu stwierdzenia czy istnieją genetyczne różnice między szczepami. Nie stwierdzono żadnych różnic, jak to wykazuje analiza elektroforetyczna strawionego genomowego DNA na Fig. 2. Dobór substratu komórkowego Podjęto badania nad replikacją Dryvax oraz wydajnością otrzymywania w komórkach MRC-5 oraz w pierwotnych fibroblastach zarodków kurzych (CEF) i wykazano, że wydajność otrzymywania jest mniejsza w komórkach CEF niż w komórkach MRC-5. Zatem jako substrat do produkcji szczepionki wybrano komórki MRC-5. Potencjalne szczepy szczepionkowe można badać w CEF lub innych komórkach w celu porównania wydajności otrzymywania szczepionki. Porównano również pożywki wzrostowe do namnażania komórek MRC-5. Uzyskano jednakowe wyniki dla pożywek Williams E, Minimal Essential Medium (MEM) i MEM w modyfikacji Dulbecco. Wzbogacanie pożywek dodatkiem płodowej surowicy bydlęcej (FBS), nie niezbędnych aminokwasów, witamin i pirogronianu sodu nie dostarczyło żadnych korzyści w stosunku do stosowania pożywki z 10% FBS, w odniesieniu do żywotności lub wzrostu komórek. Kinetyka wzrostu MRC-5 przy odpowiedniej gęstości posiewu komórek była dostateczna. Ustalono, że gęstość posiewu komórek powinna wynosić 2x10 4 komórek/cm 2. Stwierdzono, że czas do podziału wynosi 3-5 dni, natomiast stosunek podwojenia populacji do podziału wynosi 1-1,5. Zdefiniowano sposób wytwarzania banków komórek i namnażania komórek w celu uzyskania wzrostu wirusa. Wykazano, że do dysocjacji komórek nadaje się standardowa metoda trypsynizacji. Wykazano użyteczność metody alternatywnej z zastosowaniem pronazy bakteryjnej, która może mieć tę zaletę, że pozwoli na uniknięcie w produkcji produktów pochodzenia zwierzęcego. Inne wykonania wynalazku opisane są w załączonych zastrzeżeniach.

10 PL 212 117 B1 Zastrzeżenia patentowe 1. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera klonalny szczep atenuowanego wirusa krowianki, który wyizolowany jest z hodowli komórek, w której hodowano ACAM 1000 (nr depozytu ATCC PTA-3321) lub jego wirusa potomnego, i, po podaniu człowiekowi w ilości skutecznej do wywoływania ochronnej lub terapeutycznej odpowiedzi immunologicznej przeciwko wirusowi ospy prawdziwej u tego człowieka, wykazuje u tego człowieka odpowiednią atenuację, oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik lub rozcieńczalnik, przy czym: - wspomniany wirus krowianki ma taką samą zjadliwość jak szczep wirusa krowianki ACAM1000 (nr depozytu ATCC PTA-3321), - wspomniany wirus krowianki ma taką samą immunogenność jak szczep wirusa krowianki ACAM 1000 (nr depozytu ATCC PTA-3321) i, - wspomniany wirus krowianki ma taki sam wzorzec trawienia jak szczep wirusa krowianki ACAM 1000 (nr depozytu ATCC PTA-3321) po trawieniu endonukleazą restrykacyjną. 2. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że wspomniany szczep wirusa krowianki ma taką samą zjadliwość jak Dryvax. 3. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że wspomniany szczep wirusa krowianki ma taką samą immunogenność jak Dryvax. 4. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że wspomniany szczep wirusa krowianki wytwarzany jest w ilości takiej samej lub większej niż Dryvax po inokulacji do hodowli komórkowych. 5. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że wspomniany szczep wirusa krowianki ma taki sam wzorzec trawienia jak Dryvax po trawieniu endonukleazą restrykcyjną. 6. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że wspomniany szczep wirusa krowianki wytwarzany jest w ilości takiej samej lub większej niż ACAM1000 (nr depozytu ATCC PTA-3321) po inokulacji do hodowli komórkowych 7. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że wspomniany szczep wirusa krowianki stanowi ACAM 1000 (nr depozytu ATCC PTA-3321). 8. Kompozycja według jednego z zastrz. 1-7, znamienna tym, że przeznaczona jest do leczenia zakażenia wirusem ospy prawdziwej u pacjenta. 9. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera: (i) klonalny szczep atenuowanego wirusa krowianki, który wyizolowany jest z hodowli komórek, w której hodowano Drywax albo ACAM 1000 (nr depozytu ATCC PTA-3321) lub jego wirusa potomnego, i po podaniu człowiekowi w ilości skutecznej do wywoływania ochronnej lub terapeutycznej odpowiedzi immunologicznej przeciwko wirusowi ospy prawdziwej u tego człowieka, w y- kazuje u tego człowieka odpowiednią atenuację, oraz (ii) farmaceutycznie dopuszczalny nośnik lub rozcieńczalnik, przy czym wspomniana kompozycja przeznaczona jest do zastosowania w leczeniu lub profilaktyce zakażenia wirusem ospy prawdziwej u pacjenta, i przy czym: - wspomniany wirus krowianki ma taką samą zjadliwość jak szczep wirusa krowianki ACAM 1000 (nr depozytu ATCC PTA-3321), - wspomniany wirus krowianki ma taką samą immunogenność jak szczep wirusa krowianki ACAM 1000 (nr depozytu ATCC PTA-3321) i, - wspomniany wirus krowianki ma taki sam wzorzec trawienia jak szczep wirusa krowianki ACAM 1000 (nr depozytu ATCC PTA-3321) po trawieniu endonukleazą restrykacyjną. 10. Kompozycja według zastrz 8 albo 9, znamienna tym, że wspomniana kompozycja przeznaczona jest do podawania wspomnianemu pacjentowi przez skaryfikację. 11. Kompozycja według zastrz 8 albo 9, znamienna tym, że wspomniana kompozycja przeznaczona jest do podawania wspomnianemu pacjentowi w ilości w zakresie od 1x10 4 do 1x10 6 jednostek tworzących łysinki.

PL 212 117 B1 11 Rysunki

12 PL 212 117 B1

PL 212 117 B1 13

14 PL 212 117 B1

PL 212 117 B1 15

16 PL 212 117 B1 Departament Wydawnictw UP RP Cena 4,92 zł (w tym 23% VAT)