PRACA ORYGINALNA Original Article Acta Haematologica Polonica 2009, 40, Nr 1, str. 81 87 JADWIGA FABIJAŃSKA-MITEK 1, ANNA WALASZCZYK 2, ELśBIETA SOBCZAK 2, BARBARA PIĄTOSA 3 Reakcje przeciwciał anty-hla z krwinkami czerwonymi Anti-HLA antibody reactions with red blood cells 1 Zakład Biofizyki, Centrum Medyczne Kształcenia Podyplomowego 2 Dział Immunologii, Regionalne Centrum Krwiodawstwa i Krwiolecznictwa 3 Pracownia Zgodności Tkankowej, Centrum Zdrowia Dziecka, Warszawa STRESZCZENIE ZałoŜenia: W surowicach niektórych wielokrotnych biorców krwi oraz kobiet, które były w ciąŝy wykrywa się przeciwciała anty-hla w teście limfocytotoksycznym (LCT). Antygeny HLA znajdują się na leukocytach i innych komórkach jądrzastych. Na dojrzałych erytrocytach nie występują, ale ich pozostałości, oznaczane jako antygeny Bg, mogą być obecne. Celem pracy była ocena aktywności przeciwciał anty-hla w kolumnowych, Ŝelowych testach wykonywanych przed przetaczaniem krwinek czerwonych. Materiał i metody: Surowice 114 chorych (23 płci męskiej i 91 Ŝeńskiej; 14 dzieci od 2 do 17 lat oraz 100 dorosłych) z dodatnim LCT zbadano pośrednim testem antyglobulinowym (PTA). UŜyto 21 zestawów krwinek wzorcowych do wykrywania i identyfikacji przeciwciał. KaŜda surowica była badana z co najmniej 7 zestawami. Wyniki: U 14 chorych (12,3%) zidentyfikowano swoiste przeciwciała do krwinek czerwonych. U 30 (26,3%) stwierdzono wyłącznie nieswoiste reakcje. Zazwyczaj zachodziły one z tymi samymi krwinkami wzorcowymi i często były to krwinki Bg(a+). Reakcje z krwinkami gotowymi do uŝycia były częściej ujemne niŝ reakcje z krwinkami, których zawiesiny sporządzano w laboratorium. Wnioski: Surowice dające dodatnie wyniki w LCT i PTA powinny być badane z kilkoma zestawami wzorcowych krwinek czerwonych, w tym z zawiesinami gotowymi do uŝycia dla techniki kolumnowej. Postępowanie takie moŝe być pomocne w róŝnicowaniu nieswoistych reakcji przeciwciał od reakcji ze swoistymi antygenami krwinek czerwonych, które są odpowiedzialne za hemolityczne odczyny poprzetoczeniowe. SŁOWA KLUCZOWE: Przeciwciała anty-hla Antygeny Bg Nieswoiste reakcje z krwinkami czerwonymi Pośredni test antyglobulinowy Technika kolumnowa Test limfocytotoksyczny SUMMARY Background: In sera from some multi-transfused patients and women who have been pregnant, we can detect anti-hla antibodies by lymphocytotoxicity test (LCT). Human leukocyte antigens (HLA) are present on leukocytes and other nuclear cells. They are absent on mature erythrocytes however, their remnants sometimes are present as so-called Bg antigens. The aim of this study was to evaluate reactivity of anti-hla antibodies with RBCs in the pretransfusion column gel tests. Sera from 114 LCT positive patients (23 males, 91 females; 14 children: 2 17 years old and 100 adults) were tested by the column gel indirect antiglobulin test (IAT). Materials and methods: twenty one red blood cell panels were used for antibody detection and identification.
82 J. FABIJAŃSKA-MITEK i wsp. Each serum was tested usually with 7 RBC panels. Results: In 14 of the patients (12.3%) we identified specific RBC alloantibodies. In 30 (26.3%) only non-specific reactions were noted, usually with the same RBCs, which were often Bg(a+). Reactions with ready-to-use RBC panels were more often negative than reactions with RBC suspensions prepared in the laboratory. Conclusions: LCT and IAT positive sera should be investigated with several different RBC panels, especially with ready-to-use suspensions for the appropriate column technique. It can be helpful to distinguish non-specific reactions and specific RBC antigen-antibody reactions potentially responsible for haemolytic post-transfusion reactions. KEY WORDS: Anti-HLA antibodies Bg antigen Non-specific reactions with red blood cells Indirect antiglobulin test Column technique Lymphocytotoxicity test WPROWADZENIE Antygeny HLA (Human Leucocyte Antigen), czyli swoiste antygeny leukocytów i innych komórek jądrzastych, są obecne na erytroblastach i retykulocytach. Większość z nich zanika na dojrzałych krwinkach czerwonych, ale niektóre pozostają jako antygeny nazywane Bg (Bennett Goodspeed): Bg a, Bg b, Bg c, odpowiadające HLA: B7, B17, A28/A2 [1, 5, 6]. Ekspresję Bg na krwince czerwonej ocenia się na 40 550 miejsc antygenowych, podczas gdy na limfocytach B jest 260000 miejsc antygenowych HLA, a na limfocytach T 100000 [8]. Podczas próby zgodności serologicznej, poprzedzającej dobór koncentratów krwinek czerwonych (KKCz) do transfuzji, przeciwciała anty-hla w surowicy biorcy mogą reagować z krwinkami czerwonymi. Zazwyczaj przeciwciała te, w stosunku do erytrocytów, są traktowane jako nieistotne klinicznie, jednak dodatnie wyniki w pośrednim teście antyglobulinowym (PTA) i problemy z ich interpretacją komplikują i przedłuŝają dobór KKCz do transfuzji, zwłaszcza gdy technikę probówkową zastępuje się techniką kolumnową. Jedną z zalet komercyjnych testów kolumnowych jest ich duŝa czułość, dzięki której zwiększa się moŝliwość wykrycia przeciwciał potencjalnie odpowiedzialnych za hemolityczną reakcję potransfuzyjną. Z drugiej strony, w testach tych częściej moŝna wykryć reakcje nieswoiste i uzyskać wyniki fałszywie dodatnie, wśród których wymieniano reakcje przeciwciał anty-hla z krwinkami czerwonymi [7]. Celem obecnych badań była ocena częstości występowania dodatnich reakcji przeciwciał anty-hla z krwinkami czerwonymi w testach kolumnowych oraz znalezienie sposobu postępowania, który ułatwi róŝnicowanie tych przeciwciał od przeciwciał skierowanych do swoistych antygenów krwinek czerwonych. MATERIAŁ I METODY Zbadano 139 kolejnych, nie selekcjonowanych surowic od 114 chorych z dodatnim wynikiem testu limfocytotoksycznego (LCT): 100 dorosłych pacjentów (18 84 lat) i 14 dzieci (2 17 lat), u których wykryto przeciwciała anty-hla w następujących sytuacjach klinicznych: 74 analiza niehemolitycznych odczynów poprzetoczeniowych, 12 dobór koncentratów krwinek płytkowych (KKP) do transfuzji, 6 ocena nieswoistych reakcji serologicznych przed przetoczeniem KKCz, 22 badania związane z transplantacją nerki. Surowice przechowywano w stanie zamroŝenia. Po rozmroŝeniu
Reakcje przeciwciał anty-hla z krwinkami czerwonymi 83 podzielono je na mniejsze porcje, aby uniknąć błędów wynikających z zamraŝania i rozmraŝania. Próbki surowic badano jednocześnie z kilkoma dostępnymi zestawami krwinek czerwonych. Badano teŝ poszczególne surowice z tymi samymi krwinkami czerwonymi na początku i na końcu terminu waŝności. Test limfocytotoksyczny (LCT) W teście limfocytotoksycznym wykrywa się przeciwciała anty-hla zaleŝne od dopełniacza, który po wystąpieniu reakcji antygen-przeciwciało uszkadza błonę komórkową limfocytów i powoduje ich obumieranie. Dodany barwnik eozyna wnika do wnętrza komórek, które powiększają się i nie odbijają światła reakcja dodatnia. śywe komórki nie wchłaniają barwnika, są małe i odbijają światło reakcja ujemna. Badanie przeprowadzano zgodnie ze standardową procedurą, na płytkach Terasaki, na które przenoszono składniki reakcji mikrostrzykawką Hamiltona. Badanie wykonywano w stosunku do limfocytów 10 lub 30 dawców zaleŝnie od ośrodka i celu badania. Wyniki odczytywano w mikroskopie odwróconym kontrastowo-fazowym i za dodatnie przyjmowano te, w których >20% komórek było martwych. Pośredni test antyglobulinowy (PTA) Test przeprowadzano na kartach LISSCoombs (DiaMed, Szwajcaria), zawierających po 6 mikroprobówek z Ŝelem i z surowicą wieloswoistą: anty-igg + anty-c3. Kolejno odmierzano po 50µl 0,8% zawiesiny wzorcowych krwinek czerwonych do wykrywania lub do identyfikacji przeciwciał i przenoszono je do poszczególnych mikroprobówek. Do kaŝdej mikroprobówki dodawano po 0,25µl surowicy badanej. Karty inkubowano przez 15 minut w 37 o C, aby zaszła reakcja antygen-przeciwciało. Następnie wirowano je przez 10 minut i oceniano wyniki: dodatnie, gdy zaglutynowane krwinki czerwone znajdowały się na powierzchni Ŝelu (4+) lub zostały w nim zatrzymane między powierzchnią a dnem (od 3+ do 1+) oraz ujemne, gdy wszystkie krwinki czerwone znajdowały się na dnie mikroprobówki. Krwinki wzorcowe Stosowano gotowe do uŝycia zawiesiny krwinek wzorcowych do wykrywania przeciwciał: 6 zestawów po 3 rodzaje krwinek czerwonych oraz do identyfikacji 3 zestawy po 11 rodzajów krwinek czerwonych (DiaMed, Szwajcaria). UŜyto teŝ wzorcowe krwinki czerwone, których zawiesiny sporządzano, aby odpowiadały wymogom testu kolumnowego: 4 zestawy po 3 rodzaje krwinek do wykrywania przeciwciał Regionalne Centrum Krwiodawstwa i Krwiolecznictwa (RCKiK) Warszawa, 6 zestawów po 6 rodzajów krwinek do wykrywania i identyfikacji przeciwciał RCKiK Katowice oraz 2 zestawy po 16 rodzajów krwinek do identyfikacji przeciwciał Immucor Gamma, USA. Krwinki te przemywano 0,9% zbuforowanym roztworem NaCl oraz roztworem NaCl o niskiej sile jonowej (LISS, RCKiK Katowice) i sporządzano z nich
84 J. FABIJAŃSKA-MITEK i wsp. 0,8% zawiesiny równolegle w roztworze LISS odczynnik 1 (RCKiK Katowice) oraz LISS odczynnik 2 (DiaMed, Szwajcaria). Łącznie uŝyto 21 zestawów krwinek wzorcowych, a poszczególne surowice zbadano z co najmniej 7 zestawami. WYNIKI Wśród 114 chorych z dodatnim LCT było 23 męŝczyzn i 91 kobiet. Wśród dorosłych chorych 68 miało > 50 lat, a 32 osoby < 50 lat. U 14 chorych (12,3%) zidentyfikowano swoiste alloprzeciwciała do antygenów krwinek czerwonych, o pojedynczej swoistości: 2 x anty-d, 2 x anty-k, anty-e, anty-c W, anty-m, anty-s, anty-le b oraz wieloswoiste: anty-d+c, anty-k+c, anty-c+e, anty-c+c W, anty-d+e+k. U 30 chorych (26,3%) wykryto wyłącznie reakcje nieswoiste z róŝnymi zestawami krwinek czerwonych. Surowice 70 chorych (61,4%) nie reagowały z Ŝadnym z uŝytych do ich badania zestawów wzorcowych (Ryc. 1). 70 % anty-hla alloprzeciwciała swoiste brak przeciwciał 60 50 40 30 20 10 0 Ryc. 1. Reakcje z krwinkami czerwonymi surowic 114 chorych z dodatnim LCT Fig. 1. Reactions of sera from 114 LCT positive patients with RBCs
Reakcje przeciwciał anty-hla z krwinkami czerwonymi 85 Aktywność serologiczną 30 surowic, w których nie wykryto swoistych przeciwciał do krwinek czerwonych przedstawia Tabela 1. Tabela 1. Charakterystyczne cechy nieswoistych reakcji 30 surowic, dodatnich w LCT i w kolumnowym PTA w stosunku do róŝnych zestawów krwinek czerwonych Table 1. Characteristics of non-specific reactions of 30 sera with positive LCT and column IAT with different RBC panels Reakcje poszczególnych surowic badanych z co Zazwyczaj dodatnie z krwinkami w 2 4 zestawach najmniej 7 zestawami wzorcowych krwinek czerwonych Wyniki PTA róŝnych surowic Zazwyczaj dodatnie z tymi samymi krwinkami czerwonymi Reakcje z krwinkami czerwonymi Bg (a+) Reakcje w ostatnim dniu terminu waŝności krwinek czerwonych w porównaniu z reakcjami świeŝych krwinek Reakcje z zawiesinami krwinek czerwonych sporządzonych w LISS odczynnik 1 w stosunku do zawiesin tych samych krwinek w LISS odczynnik 2 DYSKUSJA Częste 70% surowic Słabsze, ale tylko w 1 przypadku ujemne 6 (20%) wyników słabo dodatnich z odczynnikiem 1 vs ujemne z odczynnikiem 2 Dotychczas nie przeprowadzono badań oceniających jak często u chorych z przeciwciałami anty-hla mogą wystąpić reakcje dodatnie w stosunku do krwinek czerwonych, jeŝeli stosuje się czułą technikę kolumnową. Obecne badania wykazały, Ŝe problem moŝe dotyczyć ponad 25% chorych z dodatnim wynikiem LCT i Ŝe są to zazwyczaj kobiety oraz wielokrotni biorcy krwi. Nieliczni autorzy obserwowali reakcje przeciwciał limfocytotoksycznych w rutynowych badaniach serologicznych, przeprowadzanych testami probówkowymi, ale wykrywali je podczas stosowania specjalnych technik np.: PTA w środowisku albuminy lub PTA w kapilarach [1, 4]. Ivankovic i współpracownicy wykazali, Ŝe wśród róŝnych reakcji nieswoistych w testach kolumnowych, ok. 50% powodują przeciwciała limfocytotoksyczne [7]. Odnotowali, Ŝe znacząco częściej występowały one u kobiet niŝ u męŝczyzn oraz po 60. roku Ŝycia niŝ przed 30. rokiem. Te obserwacje pacjentów są zbieŝne z naszą oceną. Wśród omawianych obecnie chorych, znacznie częściej niŝ zdarza się to wśród wielokrotnych biorców krwi (12% vs 3%), wykryto swoiste, klinicznie istotne alloprzeciwciała odpornościowe, w tym przeciwciała wieloswoiste. Podobną predyspozycję do wytwarzania przeciwciał anty-hla przez chorych z przeciwciałami przeciw krwinkom czerwonym opisali Buentes i współpracownicy [3]. Obserwowano teŝ, Ŝe osoby łatwo ulegające uodpornieniu antygenami HLA, wytwarzają je nawet wtedy, gdy przetacza się KKCz lub KKP filtrowane, czyli w znacznym stopniu pozbawione leukocytów i niezaleŝnie, czy procedurę przeprowadzi się po pobraniu krwi, czy przed transfuzją [11]. PoniewaŜ w obecnych badaniach prawidłowością były powtarzające się reakcje wielu surowic z konkretnymi krwinkami czerwonymi w poszczególnych zestawach
86 J. FABIJAŃSKA-MITEK i wsp. wzorcowych, to moŝna było załoŝyć, Ŝe dawcy tych krwinek czerwonych posiadali większą od innych ekspresję antygenów Bg. Niektórzy autorzy wykrywali antygeny Bg a u 93% dawców, a Bg b u 80% dawców [4]. Inni stwierdzili obecność antygenów Bg u ok. 50% ludzi [2, 8]. JeŜeli w prezentowanych badaniach uŝyto krwinki zidentyfikowane jako Bg(a+), to większość dodatnich reakcji dotyczyła tych krwinek, ale niektóre surowice reagowały z krwinkami Bg(a+) w jednym zestawie i nie reagowały z Bg(a+) w innym zestawie. Badania innych autorów wykazały, Ŝe przeciwciała limfocytotoksyczne rzadko mają pojedynczą swoistość np. anty-bg a, natomiast często są to anty- Bg a +Bg b, anty-bg a +Bg c lub anty-bg a +Bg b +Bg c [6]. W prezentowanych badaniach wieloswoistość przeciwciał anty-bg mogła być przyczyną róŝnego nasilenia reakcji z krwinkami czerwonymi Bg(a+) pochodzącymi od róŝnych dawców. Wiadomo, Ŝe antygeny Bg u poszczególnych osób mogą mieć w róŝnych okresach Ŝycia róŝną ekspresję i Ŝe słabnie ona podczas starzenia się erytrocytów [1]. Poza jednym przypadkiem, nie obserwowano braku reakcji surowicy z krwinkami czerwonymi pod koniec terminu ich waŝności, ale na ogół reakcje te były słabsze od reakcji z krwinkami świeŝymi. Okres przydatności krwinek czerwonych do uŝycia wynosi od 4 do 6 tygodni i jest znacznie krótszy od Ŝycia krwinek czerwonych in vivo (ok. 17 tygodni), co moŝe tłumaczyć zachowanie ekspresji antygenów Bg podczas przechowywania. Niektóre firmy przygotowujące krwinki czerwone do serologicznych badań diagnostycznych, aby uniknąć reakcji nieswoistych, dobierają dawców o niskiej ekspresji antygenów Bg lub sporządzają specjalne roztwory do zawieszania krwinek czerwonych, ograniczające aktywność przeciwciał anty-hla. Wiadomo, Ŝe obniŝone ph oraz niska siła jonowa osłabiają ekspresję antygenów Bg, dlatego reakcje przeciwciał limfocytotoksycznych częściej występują w próbie krzyŝowej, gdy pracownik laboratorium sam sporządza zawiesinę krwinek czerwonych, niŝ w badaniu przeciwciał z gotowymi do uŝycia krwinkami czerwonymi, znajdującymi się cały czas w odpowiednim roztworze [7, 10]. Podobnie, w obecnych badaniach częściej obserwowano reakcje dodatnie, gdy wykonywano PTA z krwinkami czerwonymi przygotowanymi w pracowni, a nie z krwinkami wzorcowymi gotowymi do uŝycia. Dyskusyjnym i niewyjaśnionym problemem pozostają nieliczne doniesienia o moŝliwych hemolitycznych reakcjach poprzetoczeniowych wywołanych przeciwciałami anty-hla [2, 10]. Przypadki te budzą wątpliwości, co do prawidłowej oceny. MoŜna sądzić, Ŝe podczas analizy odczynu hemolitycznego nie wykryto swoistych przeciwciał i przypisano objawy przeciwciałom anty-hla [9]. MoŜna teŝ przypuszczać, Ŝe przeciwciała limfocytotoksyczne mogły wywołać hemolizę, gdy reagując z leukocytami, pobudzały układ dopełniacza, którego składniki łatwo wiąŝą się z receptorami CR (coplement receptor) erytrocytów. Podsumowując przeprowadzone badania moŝna stwierdzić, Ŝe zastosowanie wszystkich firmowych odczynników dla danej techniki kolumnowej, ogranicza reakcje przeciwciał limfocytotoksycznych z antygenami krwinek czerwonych, czasem pozwala na zidentyfikowanie ich jako anty-bg a. MoŜliwość zbadania surowicy pacjenta z kilkoma zestawami krwinek czerwonych, pochodzącymi z róŝnych źródeł, wydaje się
Reakcje przeciwciał anty-hla z krwinkami czerwonymi 87 najskuteczniejszym sposobem róŝnicowania przeciwciał anty-hla od klinicznie istotnych alloprzeciwciał odpornościowych, reagujących ze swoistymi antygenami krwinek czerwonych. Praca została sfinansowana w ramach projektu badawczego CMKP nr 501-2- 1-23-03/06 PIŚMIENNICTWO 1. Brecher ME. Ed. AABB Techical Manual 14 th ed. Antibodies to low-incidence antigens. 2003; 338: 684. 2. Benson K, Agosti SJ, Latoni-Benedetti GE, Leparc GF. Acute and delayed hemolytic transfusion reactions secondary to HLA alloimmunization. Transfusion 2003; 753-757. 3. Buentes O, Shirey RS, Gooble-Lee M, Houp J, Zachary A, King KE, Ness PM. Prevalence of HLA antibodies in transfused patients with and without red cell antibodies. Transfusion 2006; 46: 754-760. 4. Crawford MN, Schroeder ML. Bga and Bgb correlations with HLA antigens by capillary tube technique. Transfusion 1980; 20: 594-596. 5. Daniels G. Human blood groups. HLA (Human Leucocyte Associated) class I antigens on red cells. Blackwell Science Ltd. 1995; 668-671. 6. Issitt PD, Anstee DJ. Applied blood group serology, 4 th ed. Low incidence antigens and Bg. Montgomery Science Publications, Durham, North Carolina, USA, 1998; 834-838. 7. Ivancovic Z, Golubic B, Lucic M, Plencovic F, Bojanic I, Pool J. Positive antibody tests without detectable specific antibodies; part I: features; part II: causes and relationships. Vox Sang 2005; 89 (S1): 145-146. 8. Klein HG, Anstee DJ. Mollison s Blood transfusion in clinical medicine, 11 th ed. HLA antigens detectable on red cells. Blackwell Publishing Ltd. 2005; 237-238. 9. Nance ST. Do HLA antibodies cause hemolytic transfusion reactions or decreased RBC survival? Transfusion 2003; 43: 687-690. 10. Takeuchi C, Ohto H, Miura S, Yasuda H, Ono S. Ogata T. Delayed and acute hemolytic transfusion reactions resulting from red cell antibodies and red cell-reactive HLA antibodies. Transfusion 2005; 45: 1925 1929. 11. Van de Watering, Hermans Jo, Witviliet M, Versteegh M, Brand A. HLA an RBC immunization after filtered and buffy coat-depleted blood transfusion in cardiac surgery: a randomized controlled trial. Transfusion 2003; 43: 765 771. Praca wpłynęła do Redakcji 8.04.2008 r. i została zakwalifikowana do druku 24.09.2008 r. Adres do korespondencji: Jadwiga Fabijańska-Mitek Zakład Biofizyki Centrum Medyczne Kształcenia Podyplomowego ul. Marymoncka 99/103 01-813 Warszawa