SUMMARIES
Summary SUMMARY The Copper Metabolism MURR1 Domain Protein 1 (COMMD1) is the prototype of the COMMD family of proteins. It has been shown to regulate various cellular processes, like copper homeostasis, inflammatory response, and hypoxia adaptation, and to mediate the cellular localization of numerous proteins. However, the biological role of COMMD1 and the exact molecular mechanisms by which it regulates these processes are still ill-defined. This thesis aims to give more insight into the biological role of COMMD1 in the pathogenesis of inflammatory diseases, including colitis and non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). In addition, we report identifying COMMD1 as a potential hypercholesterolemia risk gene. Chapter 1 provides a general introduction to NAFLD and non-alcoholic steatohepatitis (NASH), which are obesity-related health problems. The pathology of the majority of hepatic disorders is intertwined with aberrant inflammatory responses. We discuss here the contribution of inflammation and the role of the NF-κB signaling pathway, a key pathway in inflammation. We also discuss the significance of increased circulating lowdensity lipoprotein cholesterol (LDL-c) levels, as a risk factor for cardiovascular diseases and as one of the features of the metabolic syndrome. A brief description of the low-density lipoprotein receptor (LDLR) trafficking pathway is given. Although all COMMD proteins can suppress NF-κB activity in vitro, COMMD1 is the best-studied family member in this signaling pathway to date. Chapter 2 reviews the current knowledge about the molecular mechanisms which terminate NF-κB activity. We specifically focus on the contribution of the COMMD family to NF-κB signaling. Apart from regulating the activity of NF-κB, COMMD1 is a protein with multiple functions. It was initially discovered to regulate copper homeostasis, as COMMD1-deficient dogs progressively accumulate copper in their livers up to toxic levels. Based on our current knowledge, we speculate that COMMD1 modulates the trafficking of the copper transporting protein ATP7B. The mechanism by which COMMD1 regulates this pathway might be similar to the way it coordinates the trafficking of other transmembrane proteins. An overview of current knowledge about the pleiotropic function of COMMD1 is given in Chapter 3. Chapter 4 describes the first in vivo evidence that COMMD1 restrains the proinflammatory response. Mice devoid of myeloid Commd1 were found to have lower survival in a murine model of DSS-induced colitis as well as in LPS-induced sepsis. We show also the first link between genetic variation in the human COMMD1 3 region and the risk for inflammatory bowel disease. Furthermore, an increased progression to colonic dysplasia was found in myeloid Commd1-deficient mice, advocating a possible role of Commd1 in tumor development. Further studies on the role of Commd1 in inflammation are presented in Chapter 5. In order to investigate the effect of Commd1 deficiency on hepatic inflammation, we used a mouse model of NAFLD. Mice were fed a high-fat high-cholesterol diet (HFC) diet for 12 weeks. The inhibitory role of Commd1 on inflammation was shown to be cell- S 171
Summary type-specific, since hepatocyte Commd1-deficiency did not alter the level of diet-induced inflammation, whereas myeloid Commd1 depletion exacerbated liver inflammation. Unexpectedly, both myeloid and hepatocyte Commd1 depletion resulted in an increased fat accumulation in the liver. The effect on steatosis is suggested to be a result of two different mechanisms: one inflammation-dependent and the other independent of inflammation. Depletion of hepatocyte-specific Commd1 also led to the discovery of COMMD1 as a modulator of cholesterol homeostasis (Chapter 6). Hepatic COMMD1 deficiency in mice and dogs results in hypercholesterolemia; both animals show elevated levels of circulating atherogenic LDL-c. The observed phenotype is likely related to aberrant LDLR trafficking. COMMD1 was shown to interact with LDLR and mediate the uptake of LDL in mouse embryonic fibroblasts. Furthermore, depletion of Commd1 markedly impairs PCSK9-induced Ldlr degradation, suggesting that Commd1 mediates cellular trafficking of the Ldlr. Further investigations into its mechanistic action in Ldlr trafficking are essential to gain a better understanding of how cholesterol homeostasis is regulated. The study we report in Chapter 7 suggested that hepatic Commd1 plays a role in the progression of HFC-diet induced microvesicular steatosis to macrovesicular steatosis. Here, we demonstrated that microvesicular steatosis is associated with a lower inflammatory tone in the liver and with reduced activation of the LXR pathway, which prevents cells from cholesterol overload. However, further research is necessary to elucidate the mechanism behind this observation. Finally, Chapter 8 discusses the findings presented in this thesis. It is divided into three sections related to the role of Commd1: in inflammation, in NAFLD, and in cellular trafficking of its clients. In conclusion, our data underline the multifunctional nature of COMMD1, and provide novel insights into its biological function. We demonstrate a cell-type-specific role for COMMD1 in suppressing inflammation, and identify COMMD1 as a novel gene in regulating cholesterol homeostasis. Our data indicate that COMMD1 delivers the LDLR to the right docking station in the cell. We believe that unraveling the mechanistic action of COMMD1 in the LDLR pathway will help us better understand the mechanism by which COMMD1 regulates biliary copper excretion. This thesis shows that COMMD1 is a relatively novel adaptor protein in sorting various molecules involved in a number of different biological processes, such as cholesterol and copper homeostasis. 172
Podsumowanie PODSUMOWANIE Białko COMMD1 (ang. Copper Metabolism MURR1 Domain Protein 1) należy do rodziny białek COMMD. Bierze ono udział w regulacji różnych procesów komórkowych, takich jak gospodarka miedzi, reakcja zapalna czy adaptacja komórkowa do hipoksji (niedotlenienia) oraz odgrywa rolę we właściwej lokalizacji komórkowej wielu innych białek. Jednakże precyzyjna funkcja COMMD1 oraz dokładny mechanizm molekularny, poprzez który reguluje ono określone procesy komórkowe nie są w pełni poznane. Praca ta ma na celu pogłębienie dotychczasowej wiedzy na temat biologicznej roli białka COMMD1 w patogenezie chorób zapalnych, w tym zapalenia jelit i niealkoholowego stłuszczenia wątroby (ang. Non-Alcoholic Fatty Liver Disease, NAFLD). Ponadto gen COMMD1 został zidentyfikowany w niniejszej pracy jako potencjalny gen ryzyka hipercholesterolemii. Rozdział 1 stanowi ogólny wstęp do zagadnienia NAFLD oraz niealkoholowego stłuszczeniowego zapalenia wątroby (ang. Non-Alcoholic Steatohepatitis, NASH), stanowiących problemy zdrowotne związane z otyłością. Ponieważ patologia większości zaburzeń czynności wątroby jest powiązana z nieprawidłowymi reakcjami zapalnymi, omówiona została rola stanu zapalnego oraz szlaku sygnałowego NFκB odgrywającego kluczową rolę podczas zapalenia. Podkreślone zostało również znaczenie podwyższonego stężenia lipoprotein niskiej gęstości (ang. Low Density Lipoprotein, LDL) w osoczu krwi jako czynnika ryzyka wystąpienia chorób układu sercowo-naczyniowego oraz jako jednego z objawów zespołu metabolicznego. W rozdziale tym zawarty został również krótki opis wewnątrzkomórkowego transportu (ang. trafficking) receptora cholesterolu typu LDL (ang. LDL receptor, LDLR). Mimo, że wszystkie białka z rodziny COMMD mogą tłumić aktywność NF-κB in vitro, to właśnie rola białka COMMD1 została dotychczas najlepiej poznana w tym szlaku komórkowym. Rozdział 2 stanowi przegląd aktualnego stanu wiedzy na temat mechanizmów molekularnych hamujących aktywność NF-κB. Jednakże szczególna uwaga została poświęcona udziałowi rodziny białek COMMD w ścieżce przekazu sygnału NF-κB. COMMD1, oprócz wpływu na aktywność NF-κB, ma wiele innych funkcji. Początkowo zostało ono odkryte jako regulator homeostazy miedzi w komórkach. Odkrycia tego dokonano na podstawie badań z udziałem psów z wykrytą mutacją genu dla białka COMMD1 prowadzącą do zahamowania jego produkcji. U zwierząt tych miedź gromadzona jest w wątrobie stopniowo, aż do osiągnięcia toksycznego poziomu. W oparciu o naszą obecną wiedzę wnioskować możemy, że COMMD1 moduluje przemieszczanie białka ATP7B transportującego miedź wewnątrz komórek. Mechanizm odpowiadający za ten proces może być zbliżony do koordynacji przemieszczania innych transmembranowych (transbłonowych) białek przez COMMD1. Aktualny stan wiedzy na temat plejotropowych funkcji COMMD1 przedstawiony został w rozdziale 3. W rozdziale 4 opisane zostały pierwsze dowody pochodzące z badań in vivo świadczące o tym, że COMMD1 powstrzymuje prozapalną odpowiedź komórkową. S 173
174 Podsumowanie Stwierdzono, że myszy pozbawione Commd1 w komórkach szpikowych cechują się niższą przeżywalnością w mysim modelu eksperymentalnego zapalenia jelita grubego (ang. colitis) indukowanym poprzez podawanie dekstranu siarczanu sodu (DSS) oraz w modelu posocznicy indukowanej lipopolisacharydem bakteryjnym (LPS). Po raz pierwszy również pokazano zależność pomiędzy wariantem genetycznym w regionie 3 ludzkiego genu COMMD1 a ryzykiem wystąpienia nieswoistego zapalenia jelit (ang. Inflammatory Bowel Disease, IBD). Ponadto zaobserwowana została zwiększona progresja dysplazji jelita grubego u myszy pozbawionych Commd1 w komórkach szpikowych, co może świadczyć o potencjalnej roli białka Commd1 w rozwoju nowotworów. Dalsze badania dotyczące roli białka Commd1 w reakcji zapalnej przedstawione zostały w rozdziale 5. Mysi model NAFLD został użyty w celu zbadania wpływu niedoboru Commd1 na stan zapalny wątroby. Myszom podawana była wysokotłuszczowa karma o podwyższonej zawartości cholesterolu (ang. High-Fat, High Cholesterol, HFC) przez okres 12 tygodni. Brak białka Commd1 w mysich hepatocytach nie spowodował zmian w poziomie stanu zapalnego wywołanego dietą HFC, jednakże brak Commd1 w komórkach szpiku doprowadził do zwiększenia reakcji zapalanej. Wykazano tym samym, iż hamujący wpływ białka Commd1 na reakcję zapalną jest komórkowo specyficzny. Jednakże pozbawienie myszy Commd1, czy to w hepatocytach czy w komórkach szpiku, doprowadziło do zwiększonej akumulacji tłuszczu w wątrobie. Wpływ na stłuszczenie wydaje się być w tym wypadku wynikiem działania dwóch różnych mechanizmów: jednego, zależnego i drugiego, niezależnego od reakcji zapalnej. Pozbawienie myszy białka Commd1 w hepatocytach doprowadziło do odkrycia COMMD1 jako nowego modulatora homeostazy cholesterolu (rozdział 6). Brak Commd1 w hepatocytach u myszy oraz całkowity brak tego białka u psów wywołał w obu przypadkach hipercholesterolemię. Zarówno u myszy, jak i u psów zaobserwowano podwyższone stężenie miażdżycogennego cholesterolu LDL we krwi. Fenotyp ten jest najprawdopodobniej związany z nieprawidłowym wewnątrzkomórkowym transportem receptora LDLR. Używając mysich embrionalnych fibroblastów (ang. Mouse Embryonic Fibroblasts, MEFs) dowiedziono, że COMMD1 oddziałuje z LDLR oraz pośredniczy w internalizacji lipoprotein LDL do wnętrza komórek. Co więcej, brak Commd1 znacząco osłabia degradację receptora Ldlr indukowaną przez PCSK9, co sugeruje, że Commd1 pośredniczy w wewnątrzkomórkowym transporcie Ldlr. Jednakże dalsze badania dotyczące mechanizmu molekularnego odpowiedzialnego za ten transport są niezbędne do pełnego wyjaśnienia sposobu, w jaki regulowana jest homeostaza cholesterolu w komórkach. Na podstawie badań przedstawionych w rozdziale 7 wydaje się, że Commd1 odgrywa w hepatocytach dodatkową rolę w progresji drobnokropelkowego stłuszczenia wątroby (ang. microvesicular steatosis) indukowanego dietą HFC w kierunku jego wielkokroplekowej odmiany (ang. macrovesicular steatosis). Pokazano, że drobnokropelkowe stłuszczenie związane jest z niższym odczynem zapalnym w wątrobie oraz ze zredukowaną aktywacją szlaku LXR, który chroni komórki przed nadmiernym nagromadzeniem
Podsumowanie cholesterolu. Niemniej jednak kolejne badania będą kluczowe, aby zrozumieć mechanizm odpowiedzialny za opisane zjawiska. Rozdział 8 stanowi dyskusję wyników badań przedstawionych w niniejszej pracy. Jest on podzielony na trzy sekcje traktujące o roli Commd1 w: stanie zapalnym, NAFLD oraz regulacji wewnątrzkomórkowego transportu innych białek. Podsumowując, wyniki opisanych badań podkreślają wielofunkcyjną naturę białka COMMD1 oraz dostarczają nowych informacji na temat jego biologicznej funkcji. Pokazana została specyficzność komórkowa COMMD1 w tłumieniu stanu zapalnego oraz zidentyfikowano COMMD1 jako nowy gen istotny w regulacji homeostazy cholesterolu. Przedstawione dane pozwalają sądzić, że COMMD1 może być odpowiedzialne za dostarczanie LDLR do właściwej stacji dokującej w komórce. Odkrycie mechanizmów działania COMMD1 w szlaku receptora LDLR być może pozwoli również lepiej zrozumieć mechanizmy działania tego białka odpowiedzialne za regulację wydzielania miedzi z żółcią. Praca ta pokazuje, że COMMD1 to relatywnie nowe białko adaptorowe uczestniczące w sortowaniu innych cząsteczek biorących udział w wielu różnych procesach biologicznych, takich jak homeostaza miedzi i cholesterolu. S 175
176 Samenvatting Samenvatting Het Copper Metabolism MURR1 Domain 1 (COMMD1) eiwit is het prototype voor de eiwit familie COMMD. Eerdere studies hebben aangetoond dat COMMD1 verschillende biologische processen reguleert zoals koper homeostase, ontstekingen, en hypoxia adaptatie. Daarnaast bepaald COMMD1 de lokalisatie van verschillende eiwitten in de cel. Echter de biologische functie van COMMD1 en de exacte moleculaire mechanismes waarmee dit eiwit al deze processen reguleert is nog onduidelijk. Het doel van dit proefschrift is om meer inzicht te krijgen in de biologische rol van COMMD1 in de pathogenese van verschillende ziekten die gerelateerd zijn aan chronische ontstekingen zoals colitis en niet-alcoholische leververvetting (NAFLD). In dit proefschrift tonen we voor het eerst aan dat COMMD1 een potentieel kandidaat gen is voor hypercholesterolemie. Hoofdstuk 1 geeft een algemene introductie over NAFLD en niet-alcoholische leverontsteking (NASH). In beide gevallen draagt overgewicht bij aan het ontstaan en het verloop van deze leveraandoeningen. Daarnaast speelt chronische ontsteking van de lever een belangrijke rol in de pathogenese van NAFLD en NASH. De bijdrage van leverontsteking en nuclear factor-κb (NF-κB), een belangrijke transcriptie factor in ontstekingsreacties, in NAFLD en NASH worden in dit hoofdstuk beschreven. Tevens wordt de gevolgen van verhoogd circulerend low-density lipoprotein cholesterol (LDL-c) als risico factor bij cardiovasculaire aandoeningen, een van de aandoeningen van het metabool syndroom, besproken. Er wordt een korte omschrijving gegeven over de functie van de low-density lipoprotein receptor (LDLR) en hoe de LDLR wordt getransporteerd in de cel. Hoewel alle COMMD eiwitten de NF- κb activiteit in vitro kunnen remmen, is COMMD1 tot op heden het best bestudeerde eiwit uit deze familie. In hoofdstuk 2 wordt de huidige kennis over de moleculaire mechanisme waarmee NF-κB activiteit wordt geremd beschreven. Met name wordt de rol van de COMMD eiwitten in dit proces behandeld. Naast de functie van COMMD1 als NF-kB terminator, reguleert COMMD1 nog verschillende andere biologische processen. In eerste instantie werd COMMD1 ontdekt als een eiwit betrokken bij koper huishouding. Honden deficiënt voor het COMMD1 eiwit stapelen koper op, tot zeer hoge toxische waardes, in de lever. Gebaseerd op onze huidige kennis denken we dat COMMD1 het intracellulaire transport van het koper transport eiwit ATP7B moduleert. Het mechanisme waarmee COMMD1 dit controleert is mogelijkerwijs op dezelfde manier waarmee COMMD1 ook het transport van andere transmembraan eiwitten reguleert. Een samenvatting over de huidige kennis van de pleiotropische functie van COMMD1 wordt in hoofdstuk 3 beschreven. In hoofdstuk 4 leveren we voor de eerste keer bewijs dat Commd1 ontstekingen ook in vivo remt. In een muismodel voor colitis (darmontsteking), en een model voor sepsis blijken muizen deficiënt voor Commd1 in myeloïde cellen in beide modellen een lagere overlevingskans te hebben dan wild type muizen. Wij laten ook zien dat er een correlatie is tussen een specifieke genetische variatie in de 3 regio van COMMD1 en de kans op het ontstaan van ontsteking in de darm (inflammatoire bowel disease) bij de mens. Daarnaast is de progressie van afwijkingen van de weefsel structuur van de dikke darm (dysplasie)
Samenvatting verslechterd in de myeloïde Commd1 deficiënte muizen. Hieruit veronderstellen we dat Commd1 een belangrijke regulerende rol heeft in de ontwikkeling van darmtumoren. Verdere studies waarin de rol van COMMD1 in ontstekingsreacties wordt beschreven zijn opgenomen in hoofdstuk 5. Om het effect van Commd1 deficiëntie te bestuderen in leverontsteking hebben we een muis model voor NAFLD/NASH gebruikt. Deze muizen hebben 12 weken lang een hoog-vet cholesterol (HFC) dieet gekregen. Uit deze studie blijkt dat de beschermende rol van Commd1 op ontstekingen celtype specifiek is. Muizen waarbij Commd1 is uitgeschakeld in hepatocyten lieten geen verandering zien in de mate van de dieetgeïnduceerde leverontsteking. Daarentegen was de leverontsteking wel verergerd in de muizen die Commd1 missen in myeloïde cellen. Zowel de lever- als de myeloïde-deficiënte Commd1 muis lieten onverwachts een verhoogde vet ophoping (steatose) in de lever zien. Het effect van de toegenomen leververvetting in deze twee muis modellen blijkt een gevolg te zijn van twee verschillende mechanismen: een ontstekings afhankelijke en - onafhankelijke mechanisme. Door Commd1 specifiek in hepatocyten uit te schakelen, ontdekte we dat COMMD1 ook een rol speelt in cholesterol homeostase (hoofdstuk 6). Muizen en honden die COMMD1 deficiënt zijn leiden beide aan hypercholesterolemie; een verhoogd cholesterol (LDL-c) gehalte in het bloed. Dit fenotype is waarschijnlijk te koppelen aan verstoord intracellulair LDLR (Low Density Lipoprotein receptor) transport. COMMD1 bindt fysiek aan de LDLR en is belangrijk voor de opname van LDL in muizen embryonale fibroblasten (MEF). Opvallend is dat PCSK9-geïnduceerde degradatie van de LDLR verminderd is door de afwezigheid van Commd1. Verder onderzoek is nodig om het mechanisme van LDLR transport beter te begrijpen en we hopen hiermee beter inzicht te krijgen in cholesterol homeostase. De studie beschreven in hoofdstuk 7 suggereert dat hepatisch Commd1 een rol speelt in de progressie van HFC-geïnduceerde micro-vesiculaire steatose naar macro-vesiculaire steatose. In dit hoofdstuk laten wij ook zien dat micro-vesiculaire steatose geassocieerd is met een lager ontstekingsniveau in de lever en met een verlaagde activiteit van de LXR signaleringsroute. LXR zorgt ervoor dat er niet te veel cholesterol is in de cel. Echter er is meer onderzoek nodig om het mechanisme achter deze observatie te verklaren. Ten slotte wordt in hoofdstuk 8 alle bevindingen van dit proefschrift bediscussieerd. Het is onderverdeeld in drie secties die gerelateerd zijn aan de rol van COMMD1 in ontstekingsreacties, in NAFLD en in intracellulair eiwit transport. Onze resultaten benadrukken de multifunctionele rol van COMMD1 en geven nieuwe inzichten in de biologische functie van COMMD1. Ons onderzoek demonstreert een celtype specifieke rol van COMMD1 in het onderdrukken van ontstekingen, en laat zien dat COMMD1 een nieuw gen is in cholesterol homeostase. Onze resultaten suggereren dat COMMD1 de LDLR naar de juiste plaats in cel brengt. Wij zijn er van overtuigd dat inzichten in de mechanistische rol van COMMD1 in de LDLR transport ook inzichten zullen geven in hoe COMMD1 de koper uitscheiding via de gal reguleert. Samenvattend, dit proefschrift toont aan dat COMMD1 een relatief nieuw adapter eiwit is in het sorteren van verschillende eiwitten die betrokken zijn in aantal verschillende biologische processen zoals cholesterol en koper homeostase. S 177