Metoda FISH, Anammox, struktura gatunkowa, Izabela BIEDROŃ, Kamil JANIAK* WYKORZYSTANIE FLUORESCENCYJNEJ HYBRYDYZACJI IN SITU (FISH) DO OCENY STRUKTURY GATUNKOWEJ MIKROORGANIZMÓW PRZEPROWADZAJĄCYCH BEZTLENOWE UTLENIANIE AMONIAKU (ANAMMOX) Proces Anammox jest bardzo interesującą alternatywą dla klasycznych metod usuwania azotu ze strumieni o wysokim stężeniu azotu i wysokiej temperaturze (np. odcieki z węzła gospodarki osadowej). Niestety, trudności z jego rozruchem i nierozpoznany w pełni wpływ czynników środowiskowych powodują, iż nie jest on powszechnie stosowany w oczyszczalniach ścieków. Przy poszerzaniu wiedzy na temat tego procesu, bardzo istotna jest możliwość identyfikacji gatunkowej bakterii Anammoxoraz produktów ich metabolizmu. Artykuł prezentuje obecny stan wiedzy na temat wykorzystania metody FISH do oceny struktury gatunkowej bakterii prowadzących proces Anammox. 1. WSTĘP Usuwanie azotu ze ścieków wykorzystuje połączenie autotroficznego procesu nitryfikacji z heterotroficznym procesem denitryfikacji. Przez wiele lat uznawano, że proces utleniania NH 4 + wymaga warunków tlenowych, jednak pierwsze wzmianki o istnieniu mikroorganizmów zdolnych do beztlenowego utleniania jonów amonowych pochodzą z lat siedemdziesiątych XX wieku. Wtedy Broda wysunął taką hipotezę opierającą się jedynie na podstawie obliczeń termodynamicznych i bilansu związków azotowych [4, 9]. Beztlenowe utlenianie jonów amonowych (Anammox) zostało potwierdzone eksperymentalnie w 1995 roku w oczyszczalni ścieków przemysłowych w Delft, w Holandii przez Muldera [9]. Anammox został opisany jako nowy szlak mikrobiologicznego obiegu azotu, gdzie azotyny są akceptorem elektronów, natomiast produktami * Instytut Inżynierii Ochrony Środowiska, Politechnika Wrocławska, pl. Grunwaldzki 9, Wrocław, izabela.biedron@pwr.wroc.pl.
62 I. BIEDROŃ, K.JANIAK pośrednimi są: hydroksyloamina i hydrazyna [2, 10]. W procesie Anammox uczestniczą mikroorganizmy typu Planctomycetes. Pierwszy opis bakterii Anammox pochodzi z 1999 roku, była to "Brocadia anammoxidans", która nie była czystym szczepem w rozumieniu klasycznej mikrobiologii. Gatunek ten nie został oficjalnie uznany, dlatego też otrzymał przedrostek Candidatus [4]. 2.CHARAKTERYSTYKA BAKTERII ANAMMOX Badania nad mikroorganizmami Anammox klasycznymi metodami były nieskuteczne, dlatego niezbędna okazała się izolacja ich DNA i amplifikacja ze standardowymi starterami 16S rdna. Na podstawie pozyskanych sekwencji bakterie Anammox zakwalifikowano do typu Planctomycete [10].Obecnie opisanych jest pięć rodzajów tych organizmów, które zostały wykryte w osadach pochodzących z różnych oczyszczalni ścieków (Candidatus: Brocadia, Kuenenia, Scalindua, Anammoxoglobus, Jettenia). Tylko rodzaj Candidatus Scalindua wydaje się być powszechny dla ekosystemów naturalnych [1, 4]. Podobieństwo sekwencji charakterystycznej dla rodzaju waha się wśród tych gatunków między 87-99%. Niezależnie od stosunkowo dużego dystansu filogenetycznego, wszystkie z organizmów należą do rzędu Brocadiales [4] Są to organizmy wolnorosnące, będące obligatoryjnymi anaerobami, dla których stężenie 2 µm tlenu wpływa hamująco na dalszy rozwój. Dowiedziono, że bakterie Anammox nie są obligatoryjnymi chemolitoautotrofami, poza NH 4 + mogą wykorzystywać Fe 2+ i związki organiczne (kwasy karboksylowe) jako donory elektronów (np. gatunek Anammoxoglobus propionicus, który wzrasta na propionianie). Jetten zaznacza, że bakterie Anammox w swoim metabolizmie mogą również wykorzystywać Fe 3+, tlenki manganu i azotany jako akceptory elektronów [4]. Szczególnie istotne jest wykorzystywanie azotanów przez te mikroorganizmy, ponieważ tak jak w procesie denitryfikacji, są one przekształcane w N 2, ale w innym szeregu przemian. Azotany są redukowane do azotynów i jonów amonowych, a te w procesie anammox przekształcane są w N 2. Przeprowadzanie takiego szeregu przemian pozwala bakteriom anammox pozostać niezauważonymi pośród grupy bakterii przeprowadzających denitryfikację [4]. Bakterie Gram ujemne Anammox jako źródło węgla wykorzystują CO 2. Cechą charakterystyczną w budowie komórek jest brak peptydoglikanu w ścianie komórkowej, obecność unikalnego organellum- anamoksosomu oraz zróżnicowaną na kompartmenty cytoplazmę. Obecność dwóch błon po wewnętrznej stronie ściany komórkowej tworzy charakterystyczne przedziały. Błona cytoplazmatyczna okala cytoplazmę nie zawierającą RNA-paryfoplazmę, druga, wewnętrzna błona otacza ryboplazmę, która zawiera rybosomy i otoczony podwójna błoną anamoksosom. Anamoksosom zajmuje 50-70% objętości komórki. Błona otaczająca anamoksosom
Wykorzystanie fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) do oceny struktury gatunkowej 63 zawiera specyficzne lipidy, które wpływają na jej wysoką wytrzymałość. Jest to związane z koniecznością utrzymania gradientu stężeń w trakcie reakcji Anammox oraz zapobiega penetracji hydrazyny do ryboplazmy. Biomasa utworzona z bakterii Anammox jest zwykle barwy czerwonej, ze względu na wysoka zawartość hemu (lub heminy) w cząsteczkach reduktazy hydrazyny i w cytochromach. Obecnie opisano 9 gatunków bakterii Anammox [11]. 3. METODA FISH I JEJ MODYFIKACJE Dostępność zaawansowanych metod biologii molekularnej umożliwia dokładną analizę składu gatunkowego jak i rozmieszczenia przestrzennego mikroorganizmów danej biocenozy. Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) służy do wykrywania danej sekwencji DNA za pomocą znakowanej fluorochromem sondy oligonukleotydowej. W identyfikacji mikroorganizmów Anammox należy wykorzystywać co najmniej dwie sondy: charakterystyczną dla grupy oraz specyficzną gatunkowo, jednoczesny sygnał z dwóch sond pozwala na przyporządkowanie danego organizmu do gatunku i eliminuje mylną interpretację obecnych w próbkach artefaktów [13]. Sondy są to krótkie sekwencje DNA (16-20 nukleotydów) znakowane barwnikiem fluorescencyjnym. Sekwencje te są komplementarne do sekwencji 16S rrna występujących w komórkach bakteryjnych. Mikroorganizmy mogą być dzięki tej metodzie zlokalizowane oraz zidentyfikowane. Dzięki zastosowaniu metody fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ zidentyfikowano bakterie Anammox bytujące w różnych rodzajach reaktorów i pochodzących z różnych typów ścieków. Głównymi zaletami metody FISH jest łatwe, szybkie i bezpośrednie określenie składu jakościowego, jak i ilościowego badanej próbki. Jednak nie jest ona wolna od wad, by móc ją stosować należy posiadać podstawowe informacje o badanym ekosystemie, znać sekwencję rrna szukanego mikroorganizmu. Nie zawsze jest możliwe stworzenie restrykcyjnej sondy, jeśli stosowane kryteria są związane z właściwościami metabolizmu drobnoustrojów, projekt sondy i optymalizacja procedury może być procesem czasochłonnym, natomiast analiza struktury agregatów wymaga zastosowania kosztownego mikroskopu konfokalnego [14]. FISH-MAR i FISH-ISR są zaawansowanymi metodami, które pozwalają określić aktywność metaboliczną bakterii Anammox [34]. Organizmy te, nawet przy niskiej aktywności metabolicznej wykazują stosunkowo dużą aktywność rybosomów. W związku z tym faktem, w celu określenia ich rzeczywistej aktywności należy ocenić zawartość prekursora rrna, którego częścią jest region międzygenowy ISR umiejscowiony między 16S rrna a 23S rrna [10,3]. Wówczas intensywność sygnału FISH jest proporcjonalna do stężenia prekursorów rrna w komórkach. Jest to istotne, ponieważ bakterie anammox, w okresach niskiej aktywności metabolicznej, nie
64 I. BIEDROŃ, K.JANIAK zmniejszają liczby rybosomów w swoich komórkach, tak więc zawartość rrna nie odzwierciedla w tym wypadku aktywności metabolicznej. Wadą tej metody jest brak konserwatywności w tym fragmencie RNA, istnieje możliwość, że wśród dwóch szczepów jednego gatunku, fragment ISR będzie posiadał odmienną sekwencję nukleotydów. Oznacza to, że w przypadku ISR-FISH sondy muszą być projektowane indywidualnie dla każdego ekosystemu [9]. Inną metodą oparta na analizie FISH jest FISH-MAR. Jest to połączenie fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ z mikroautoradiografią. Mikroautoradiografia polega na znakowaniu radioizotopowym substratów ( 14 C-etyl, 14 C- maślan), których umiejscowienie w komórce określa się w wyniku obserwacji mikroskopowej [7]. Wykorzystywana jest jako ogólna metoda oznaczania aktywności metabolicznej organizmów Anammox. Pozwala ona określić m.in. chemolitoautortoficzny szlak bakterii Anammox, przy użyciu wyznakowanego 14 CO 2 w próbce zawierającej bakterie tlenowo i beztlenowo utleniające jony amonowe [9]. Standardowa procedura FISH nie sprawdza się w przypadku gęstej struktury biomasy, wówczas należy zastosować zmodyfikowaną procedurę CARD (Catalysed Reporter Deposition)-FISH [12]. Dlatego też jest to często stosowana metoda do analizy próbek pochodzących z oczyszczalni ścieków [8]. Technika ta obejmuje, wzmocnienie sygnału przy użyciu peroksydazy chrzanowej oraz tyramidu. Sonda jest związana kowalencyjnie z peroksydazą chrzanową (HRP), która w trakcie etapu amplifikacji, katalizuje wytworzenie rodników tyramidu. Są to wysoce reaktywne cząstki, które wiążą się już z pojedynczym rybosomem, wzmacniając wielokrotnie (od 4 do 10 razy) emitowany sygnał. Jest to metoda idealna w przypadku próbek o niskim sygnale standardowego protokołu FISH [14]. Jej główna wadą są pojawiające się niespecyficzne sygnały wynikające z aktywności endogennych peroksydaz. W takim wypadku pomocne może być działanie na próbkę H 2 O 2 przed hybrydyzacją [12]. 4.PODSUMOWANIE W przeciągu ostatnich 13 lat Anammox został wdrożony w oczyszczalniach ścieków jako obniżających koszty i przyjazny środowisku proces usuwania azotu. W porównaniu do klasycznego wykorzystania procesów nitryfikacji i denitryfikacji proces Anammox jest przeprowadzany przy niższym zapotrzebowaniu tlenu oraz nie wymaga dostarczanie materii organicznej, co w konsekwencji pozwala zredukować koszty o około 60-90% i obniżyć emisję CO 2 o 90% [5,16]. Głównym problemem we wdrożeniu systemu Anammox są trudności z jego rozruchem. Mikroorganizmy odpowiedzialne za ten proces charakteryzują się powolnym czasie podwojenia populacji, dlatego też okres wymagany do rozruchu reaktora w rzeczywistych obiektach wynosi (w przypadku braku zaszczepu) od kilku do kilkunastu miesięcy [16]. Znajomość
Wykorzystanie fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) do oceny struktury gatunkowej 65 funkcjonowania oraz pozycji bakterii Anammox w heterogenicznej grupie mikroorganizmów jest kluczowe dla usprawnienia procesów usuwania azotu w oczyszczalniach ścieków [6]. Zaletą analiz opartych na fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ jest uzyskanie wiarygodnych wyników, ponieważ w przeciwieństwie do techniki PCR nie mamy tu do czynienia z wielokrotnym namnażaniem poszukiwanej sekwencji. Metody FISH pozwalają również dostrzec przestrzenną lokalizację badanej grupy mikroorganizmów [15]. Badania nad procesem Anammox jest przykładem wartości podstawowych badań mikrobiologicznych, których wyniki mogą być wykorzystywane w obiektach o skali przemysłowej. LITERATURA [1] HU B, ZHENG P, TANG C, CHEN J, BIEZEN E, ZHANG L, NI B, JETTEN M, YAN J, YU H, KARTAL B., Identification and quantification of anammox bacteria in eight nitrogen removal reactors, Water Research, 2010, Vol. 44, 5014-5020. [2] JETTEN M, WAGNER M, FUERST J, VAN LOOSDRECHT M, KUENEN G, STROUS M., Microbiology and application of the anaerobic ammonium oxidation ( anammox ) process, Current Opinion in Biotechnology, 2001, Vol. 12, 283 288. [3] JETTEN M, SCHMID M, SCHMIDT I, WUBBEN M, VAN DONGEN U, ABMA W, SLIEKERS O, REVSBECH N, BEAUMONT H, OTTOSEN L, VOLCKE E, LAANBROEK H, CAMPOSGOMEZ J, COLE J, VAN LOOSDRECHT M, MULDER J, FUERST J, RICHARDSOND, VAN DE PAS K, MENDEZ- PAMPIN R, THIRD K, CIRPUS I, VAN SPANNING R, BOLLMANN A, NIELSEN L, OP DEN CAMP H, SCHULTZ C, GUNDERSEN J, VANROLLEGHEM P, STROUS M, WAGNER M, KUENEN G., Improved nitrogen removal by application of new nitrogen- cycle bacteria, Re/Views in Environmental Science & Bio/Technology, 2002, Vol. 1, 51-63. [4] JETTEN M, NIFTRIK L, STORUS M, KARTAL B, KELTJENS J, OP DEN CAMP H., Biochemistry and molecular biology of anammox bacteria, Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, 2009, Vol. 44, 65-84. [5] KARTAL B, KOLEVA M, ARSOV R, VAN DER STAR W, JETTEN M, STROUS M, Adaptation of a freshwater anammox population to high salinity wastewater, Journal of Biotechnology, 2006, Vol. 126, 546-553. [6] KINDAICHI T, TSUSHIMA I, OGASAWARA Y, SHIMOKAWA M, OZAKI N, SATOH H, OKABE S., In Situ Activity and Spatial Organization of Anaerobic Ammonium-Oxidizing (Anammox) Bacteria in Biofilms, Applied and Environmental Microbiology, 2007, Vol. 73, 4931-4939. [7] LEE N, NIELSEN P, ANDREASEN K, JURETSCHKO S, NIELSEN J, SCHLEIFER K, WAGNER M., Combination of Fluorescent In Situ Hybridization and Microautoradiography a New Tool for Structure-Function Analyses in Microbial Ecology, Appl. Environ. Microbiol., 1999, Vol. 65, 1289-1297. [8] LI M, GU J., Advances in methods for detection of anaerobic ammonium oxidizing (anammox) bacteria, Appl. Microbiol. Biotechnol., 2011, Vol. 90, 1241-1252. [9] SCHMID M, MAAS B, DAPENA A, VAN DE PAS_SCHOONEN K, VAN DE VOSSENBERG J, KARTAL B, VAN NIFTRIK L, SCHMIDT I, CIRPUS I, KUENEN J, WAGNER M, SINNINGHE J, KUYPERS D, REVSBECH N, MENDEZ R, JETTEN M, STROUS M., Biomarkers for In Situ
66 I. BIEDROŃ, K.JANIAK Detection of Anaerobic Ammonium- Oxidizing (Anammox) Bacteria, Applied and Environmental Microbiology, 2005, Vol. 71, 1677-1684. [10] SCHMIDT I, SLIEKERS O, SCHMID M, CIRPUS I, STROUS M, BOCK E, KUENEN G, JETTEN M., Aerobic and anaerobic ammonia oxidizing bacteria- competitors or natural partners?, FEMS Microbiology Ecology, 2002, Vol. 39, 175-181. [11] NOZHEVNIKOVA A, SIMANKOVA M, LITTI Y., Application of the Microbial Process of Anaerobic Ammonium Oxidation (ANAMMOX) in Biotechnological Watewater Treatment, Applied Biochemistry and Microbiology, 2012, Vol. 48,667-684. [12] PAVLEKOVIC M, SCHMID M, SCHMIDER- POIGNEE N, SPRING S, PILHOFER M, GAUL T, FIANDACA M, LOFFLER F, JETTEN M, SCHLEIFER K, LEE N, Optimization of three FISH procedures for in situ detection of anaerobic ammonium oxidizing bacteria in biological wastewater treatment, Journal of Microbiological Methods, 2009, Vol. 78, 119-126. [13] RASZKA A, ZIEMBIŃSKA A, WIECHETEK A., Metody i techniki biologii molekularnej w biotechnologii środowikowej, Środowisko, 2009, Vol. 2, 101-114. [14] SANZ L, KOCHLING T., Molecuar biology techniques used in wastewater treatment: An overview, Process Biochemistry, 2007, Vol. 42, 119-133. [15] TERADA A, ZHOU S, HOSOMI M., Presence and detection of anaerobic ammonium-oxidizing (anammox) bacteria and appraisal of anammox process for high-strength nitrogenous wastewater treatment: a review, Clean. Techn.Environ. Policy., 2011, Vol. 13, 759-781. [16] WANG T, ZHANG H, YANG F, LIU S, FU Z, CHEN H, Start-up of the Anammox process from the conventional activated sludge in a membrane bioreactor, Bioresource Technology, 2009, Vol. 100, 2501-2506 FLUORESCENCE IN-SITU HYBRIDIZATION (FISH) AS AN INSTRUMENT OF SPECIES STRUCTURE IDENTIFICATION OF AMMONIUM-OXIDIZING (ANAMMOX) BACTERIA Anammox process is very interesting alternative for classic methods of nitrogen removal from highly concentrated and warm streams (such as digested liquors). Unfortunately, difficulties in starting-up and still poorly known influence of different environmental conditions leads to problems in implementation. This article discuss briefly current state of art of FISH method as a way to identify species structure and metabolism characteristics is valuable tool accelerating development of knowledge about this process.