Roczniki Akademii Rolniczej w Poznaniu CCCLXXXIII (2007) DANUTA KULPA, DANUTA RZEPKA-PLEVNES, MIŁOSZ SMOLIK, MARIANNA DOBROCHOWSKA INICJACJA KULTUR TKANKOWYCH DAWIDII CHIŃSKIEJ ODMIANY VILIMORINA (DAVIDIA INVOLUCRATA BAILL. VAR. VILIMORINIANA (DODE) WAGNER) Z Zakładu Hodowli Roślin Ogrodniczych Akademii Rolniczej w Szczecinie ABSTRACT. The studies aimed at determining the effect of the age of the maternal plant and medium hormonal composition on the initiation of an in vitro culture of Davidia involucrata Baill. var. Vilimoriniana (Dode) Wagner. The results obtained demonstrated that MS medium with 1.0 mg dm -3 IBA was the best growth regulator. Key words: Davidia involucrata Baill. var. Vilimoriniana, in vitro culture, explants, growth regulators Wstęp Dawidia chińska Vilimorina (Davidia involucrata Baill. var. Vilimoriniana (Dode) Wagner) jest uważana za jedno z najpiękniejszych drzew Azji południowo-wschodniej. Ernest Henry Wilson, podróżnik i odkrywca wielu roślin, pisał, że jest to najpiękniejsze drzewo klimatu umiarkowanego (Wilson 1929). Elementem dekoracyjnym drzewa są dwie asymetryczne podsadki otaczające bezpłatkowe kwiatostany. Podsadki zwisają na długim trzonku poruszanym przez najlżejszy powiew wiatru. W czasie kwitnienia całe drzewo pokrywa się białymi podsadkami, przypominającymi wyglądem chusteczki swobodnie porozwieszane na gałązkach, dlatego potocznie drzewo to jest określane jako chusteczkowe (Chylarecki i in. 1997), lub też drzewo duchów (ghost tree), gołębie drzewo (Taubenbaum) czy motyle drzewo (Seneta 1996). Dawidia chińska jest chlubą wielu ogrodów botanicznych, a Arboretum Przelewickie umieściło kwiat z podsadkami dawidii w swoim logo. Niestety obecnie jest to gatunek zagrożony wyginięciem, który w 1998 roku został wpisany przez Międzynarodową Unię Ochrony Przyrody do Czerwonej księgi roślin zagrożonych wyginięciem (Red list... 2006). Rocz. AR Pozn. CCCLXXXIII, Ogrodn. 41: 97-101 Wydawnictwo Akademii Rolniczej im. Augusta Cieszkowskiego w Poznaniu, Poznań 2007 PL ISSN 0137-1738
98 D Kulpa, D. Rzepka-Plevnes, M. Smolik, M. Dobrochowska Obecnie stosowane metody rozmnażania dawidii (sadzonki, nasiona, odkłady) są mało efektywne, dlatego poszukuje się metod umożliwiających rozpowszechnienie tej rośliny. Zdaniem wielu autorów (Bugała 2000, Chylarecki i in. 1997, Seneta 1996, Hrynkiewicz-Sudnik i in. 1990) może nią być regenerowanie dawidii w kulturach in vitro. Celem pracy było określenie wpływu wieku rośliny matecznej, zawartości roślinnych regulatorów wzrostu w pożywce oraz terminu pobierania eksplantatów pierwotnych na inicjację kultur in vitro. Materiał i metody Materiałem wyjściowym były pędy boczne pobierane z dwóch drzew dawidii chińskiej var. Vilmoriniana rosnących w Przelewicach: około 80-letniego i 20-letniego, powstałego w wyniku swobodnego zapylenia starszego okazu. Pędy do badań pobrano w 2005 roku, w trzech terminach: w połowie kwietnia (okres wiosenny), kiedy drzewo rozpoczynało wegetację, a pędy miały nierozwinięte pączki, na początku lipca w czasie pełni wegetacji drzew (po kwitnieniu) oraz na początku września koniec wegetacji. Z pędów usuwano zbędne liście, pozostawiając fragmenty ogonków liściowych o długości od 1,5 do 2,0 cm, następnie płukano je przez 15 minut w wodzie z dodatkiem detergentu. Po wstępnym odkażeniu fragmenty pędów zanurzano na 30 s w 70- -procentowym alkoholu etylowym, a następnie na 15 minut w 3-procentowym roztworze podchlorynu sodu (NaOCl). Odkażanie NaOCl prowadzono w komorze laminarnej. Po sterylizacji pędy płukano trzykrotnie w sterylnej wodzie destylowanej i pobierano eksplantaty pierwotne, którymi były pąki z 2-milimetrowym fragmentem zdrewniałego pędu. Umieszczano je pojedynczo w probówkach o objętości 10 ml, zawierających po 1,5 ml pożywki. W doświadczeniu stosowano pożywkę o składzie mikro- i makroelementów według Murashige i Skoog (1962), wzbogaconą o auksynę kwas idolilo-3- -masłowy (IBA) w stężeniu 1,0 i 2,0 mg dm -3 oraz cytokininę tidiazuron (TDZ) w stężeniu 0,1 i 0,2 mg dm -3 (tab. 1). Ponadto do pożywek dodano 7 g dm -3 agaru oraz 30 g dm -3 sacharozy, a ph pożywki ustalono na 5,7. Każdą kombinację doświadczalną reprezento- Tabela 1 Zawartość roślinnych regulatorów wzrostu dodanych do pożywek na etapie inicjacji Growth regulators composition on the medium at initiating stage Kombinacja Combination Roślinne regulatory wzrostu Plant growth regulators (mg dm - ³) IBA TDZ 1 1,0 0,0 2 2,0 0,0 3 0,0 0,1 4 0,0 0,2
Inicjacja kultur tkankowych dawidii chińskiej... 99 wało 25 eksplantatów. Pożywki autoklawowano po dodaniu regulatorów wzrostu w temperaturze 121 C przez 20 minut. Kultury prowadzono w pomieszczeniu wzrostowym o temperaturze 23 C oświetlonym przez 16 godzin światłem jarzeniowo-rtęciowym, o natężeniu 50 µmol m -2 s -1. W czasie cotygodniowych obserwacji określano liczbę eksplantatów zakażonych, zamarłych i inicjujących wzrost. Wyniki i dyskusja Wyniki badań wykazały, że najlepszym terminem pobierania eksplantatów dawidii jest okres wiosenny, kiedy drzewa rozpoczynają wegetację jedynie fragmenty pędów wykładane na pożywkę wiosną rozpoczynały wzrost w kulturach in vitro. W terminie tym 67,8% eksplantatów zainicjowało wzrost. Spośród eksplantatów wykładanych na pożywki w pozostałych terminach żaden nie podjął wzrostu wszystkie eksplantaty zamierały w wyniku zakażeń lub gromadzenia się związków fenolowych, widocznych w postaci ciemnych wytrąceń w pożywce. Podobne wyniki badań otrzymali Chang i in. (2001), rozmnażając w kulturach in vitro stare (1000-letnie) okazy cisa (Taxus mairei). Cytowani autorzy inicjowali kultury in vitro, wykładając na pożywki eksplantaty pobrane ze starych drzew oraz z ich młodych odrostów w okresie wiosennym, letnim, jesiennym i zimowym. Najwyższy procent inicjacji wzrostu w kulturach in vitro uzyskali w eksplantatach, którymi były pędy pobierane w okresie wiosennym. W prezentowanych badaniach stwierdzono brak istotnego wpływu wieku rośliny matecznej na częstotliwość inicjacji kultury in vitro u dawidii. Eksplantaty pobrane z młodszego okazu dawidii inicjowały wzrost średnio w 68,3%, ze starszego w 67,3%. Do inicjacji kultur in vitro dawidii stosowano dwa rodzaje regulatorów wzrostu: auksynę IBA i cytokininę TDZ. Najlepsze rezultaty uzyskano, wykładając eksplantaty pierwotne na pożywkę MS z dodatkiem 1,0 mg dm -3 kwasu IBA (fot. 1, ryc. 1). Zwiększenie zawartości IBA do 2,0 mg dm -3 powodowało nieznaczny wzrost liczby eksplantatów inicjujących wzrost, otrzymane roślinki były jednak asymetryczne, a ich liście zabarwione antocyjanowo. Fot. 1. Eksplantat dawidii chińskiej na pożywce MS uzupełnionej 1,0 mg dm -3 IBA Phot. 1. Davidia explant on MS medium with 1.0 mg dm -3 IBA
100 D Kulpa, D. Rzepka-Plevnes, M. Smolik, M. Dobrochowska 100 Procent (%) Percent (%) 80 60 40 20 Eksplantaty pobrane z 80-letniego okazu Explant from 80-year old plant Eksplantaty pobrane z 20-letniego okazu Explant from 20-year old plant 0 1 mg dm -3 2 mg dm -3 0,1 mg dm -3 0,2 mg dm -3 IBA TDZ Ryc. 1. Procent eksplantatów inicjujących wzrost w zależności od rodzaju zastosowanej pożywki i wieku rośliny, z której pobierano eksplantaty pierwotne Fig. 1. Percentage of explant initiating growth depending on the kind of media and age of mother plant Niniejszą pracę należy traktować jako wstęp do dalszych badań, których celem jest opracowanie metody mikrorozmnażania tego pięknego drzewa. Wnioski 1. Inicjacja kultur pędowych dawidii chińskiej (Davidia involucrata Baill. var. Vilimoriniana (Dode) Wagner) powinna być prowadzona na pożywce o składzie mineralnym według Murashige i Skoog (1962), wzbogaconej o 1,0 mg dm -3 auksyny IBA. 2. Najlepszym terminem do inicjacji kultur jest wczesna wiosna. Eksplantaty pobierane latem i jesienią wydzielają duże ilości związków fenolowych i bardzo szybko zamierają. Literatura Bugała W. (2000): Drzewa i krzewy. PWRiL, Warszawa: 273-274. Chang S.H., Ho C.K., Chen Z.Z., Tsay J.Y. (2001): Micropropagation of taxus mairei from mature trees. Cell Biol. Morphol. 20: 496-502. Chylarecki H., Chudecki Z., Koćmit A., Niedźwiecki A., Swiłło Ł. (1997): Arboretum Przelewickie egzotyczny ogród na Ziemi Pyrzyckiej. Ogólnopolskie Towarzystwo Ochrony Ptaków, Gdańsk. Hrynkiewicz-Sudnik J., Sękowski B., Wilczkiewicz M. (1990): Rozmnażanie drzew i krzewów liściastych. Wyd. PWN, Warszawa. Murashige T., Skoog F.M. (1962): A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15: 473-479.
Inicjacja kultur tkankowych dawidii chińskiej... 101 Przyborowski J. A., Wiwart M., Szczukowski S., Tworkowski J. (1997): Zesz. Nauk. AR Krak. 318, 50: 227-230. Red list of threatened plants. (2006). IUCN. World Conservation Monitoring Centre, http://www. iucnredlist.org Seneta W. (1996): Drzewa i krzewy liściaste. T. 3. PWN, Warszawa: 20-22. Wilson E.H. (1929): China: mother of gardens. The Stratford Company, Boston, Massachusetts. INITIATION OF TISSUE CULTURES OF DAVIDIA INVOLUCRATA BAILL. Summary The studies aimed at determining the effect of the age of the maternal plant and medium hormonal composition on the initiation of an in vitro culture of Davidia involucrata Baill. var. Vilimoriniana (Dode) Wagner, from the dendrological garden in Przelewice. For initiating the culture a MS medium (Murashige and Skoog 1962) was used, enriched by IBA and TDZ. Explants for studying were taken during early spring, summer and early autumn. The results obtained demonstrated that auxin IBA (1.0 mg dm -3 IBA) was the best growth regulator. Early spring proved to be the best time for culture initiation.