Uniwersytet Łódzki Wydział Biologii i Ochrony Środowiska Katedra Biofizyki Skażeń Środowiska ul. Pomorska 141/143, 90-236 Łódź Dr hab. Bożena Bukowska, prof. nadzw. UŁ Łódź, 09-07-2013 Katedra Biofizyki Skażeń Środowiska Instytut Biofizyki, Wydział Biologii i Ochrony Środowiska Uniwersytet Łódzki ul. Pomorska 141/143, 90-236 Łódź Tel. 42 6354453 e-mail:bukow@biol.uni.lodz.pl Recenzja rozprawy doktorskiej Udział endoteliny-1, oksydazy NADPH, oksydazy ksantynowej i kinazy białkowej C w procesie powstawania reaktywnych form tlenu autorstwa mgr Pauliny Kleniewskiej Tematyka rozprawy doktorskiej mgr Pauliny Kleniewskiej jest bardzo aktualna i wiąże się ściśle z poszukiwaniem nowych terapii chorób przebiegających z uszkodzeniem śródbłonka naczyniowego. Choroby te należą do najczęstszych w Polsce i na świecie i są istotną przyczyną zgonów ludzi. Szybki rozwój badań naukowych prowadzonych w ostatnich latach przyczynił się do ustalenia roli śródbłonka w regulacji ciśnienia tętniczego oraz w procesach hemostazy. Wykazano, że komórki śródbłonka charakteryzują się niezwykle różnorodną aktywnością biologiczną. Uwalniają dwie grupy substancji o przeciwstawnych właściwościach regulujące napięcie ściany naczynia krwionośnego. Do pierwszej, określanej ogólnie jako śródbłonkowe czynniki rozszerzające naczynia, należy prostacyklina oraz tlenek azotu zaś do drugiej grupy uwalniającej czynniki zwężające naczynia zaliczamy endotelinę-1. Endotelina-1 spełnia w organizmie wiele ważnych funkcji m.in. reguluje ciśnienie tętnicze krwi, zapewnia utrzymanie równowagi kwasowo-zasadowej i wodno-elektrolitowej ustroju, reguluje nerkowy przepływ krwi i hemodynamikę kłębuszków jak również wpływa na syntezę cytokin. Z drugiej strony endotelina-1 jako czynnik prozapalny ma istotne znaczenie w patogenezie wielu chorób sercowo naczyniowych takich jak miażdżyca, stabilna i niestabilna choroba niedokrwienna serca, przewlekła niewydolność krążenia, nadciśnienie tętnicze, czy nadciśnienie płucne. 1
Prozapalne działanie endoteliny związane jest z wytwarzaniem reaktywnych form tlenu głównie anionorodnika ponadtlenkowego i wydzielaniem cytokin. Nadprodukcja RFT zwiększa wydzielanie prozapalnej cytokiny IL-6 z endotelialnych komórek i aktywuje produkcję: TNF-α, IL-6, IL-8 w makrofagach i monocytach. Peptyd podany dożylnie powoduje początkowo rozkurcz naczyń krwionośnych, a następnie ich długotrwały skurcz, co skutkuje niedokrwieniem narządów wewnętrznych, dysfunkcją śródbłonka, generowaniem reaktywnych form tlenu oraz rozwojem stresu oksydacyjnego. Endotelina-1 wpływa na dwa typy receptorów: receptor ET A co powoduje zwężanie naczynia oraz działanie mitogenne i proagregacyjne oraz receptor ET B co skutkuje uwolnieniem prostacykliny PGI 2 i tlenku azotu oraz równoważy efekty pobudzenia receptora ET A. Blokada receptorów endoteliny przez antagonistów (o nazwie sentany) znalazła jak dotąd zastosowanie w terapii schorzeń sercowo naczyniowych m.in. w leczeniu nadciśnienia tętniczego i rozedmy płuc. Udowodniono korzystny efekt blokady receptorów ET A oraz ET A /ET B, natomiast w chwili obecnej brak jest wskazań do stosowania selektywnych antagonistów receptora ET B. Ciągle jednak nie jest dokładnie poznany mechanizm działania związków blokujących receptory endoteliny-1 oraz inhibitorów kinazy białkowej i enzymów generujących RFT. RFT są jednym z głównych czynników przyczyniających się do uszkodzenia tkanek podczas niedokrwienia i reperfuzji. Głównym zaś źródłem reaktywnych form tlenu w organizmie jest aktywność oksydazy NADPH, oksydazy ksantynowej, syntazy tlenku azotu oraz pośrednio kinazy białkowej C regulującej napływ wapnia do komórki. Nasilone wytwarzanie reaktywnych form tlenu i azotu towarzyszy wielu chorobom zarówno we wczesnych stadiach rozwoju, jak i w ich późniejszym przebiegu. Dlatego też zwraca się uwagę na ocenę stresu oksydacyjnego, który może prowadzić do licznych strukturalnych i funkcjonalnych modyfikacji lipidów, białek i kwasów nukleinowych obecnych zarówno w komórkach, tkankach, jak i płynach ustrojowych. Reaktywne formy tlenu wykazują różnokierunkowe działanie w naczyniach krwionośnych. Jest to działanie zarówno pozytywne, jak i negatywne tzn. udział w sygnalizacji komórkowej i procesach, takich jak wzrost i proliferacja komórek jak również wpływ cytotoksyczny. Ponadto RFT modyfikują syntezę i degradację elementów macierzy zewnątrzkomórkowej, są związane z utlenianiem lipoprotein o małej gęstości i oddziaływaniem na metabolizm tlenku azotu. Mimo licznych badań doświadczalnych i klinicznych związek pomiędzy stresem oksydacyjnym a rozwojem nadciśnienia tętniczego i innych chorób związanych z dysfunkcją nabłonka pozostaje niewyjaśniony. Zatem Doktorantka postawiła sobie ambitny cel znalezienia odpowiedzi na to pytanie. Zagadnienie to wydaje się szczególnie ważne, gdyż poznanie odpowiedzi mogłoby w przyszłości wyznaczać nowe kierunki terapii chorób przebiegających z uszkodzeniem śródbłonka naczyniowego. Właściwości biologiczne jednego z badanych przez Doktorantkę czynników - endoteliny-1 analizowane są przez ośrodki naukowe zarówno w Polsce, jak i na świecie. O rosnącym zainteresowaniu naukowców tą tematyką świadczy obserwowany w ostatnich latach duży wzrost liczby prac eksperymentalnych z tego tematu opublikowanych w recenzowanych międzynarodowych czasopismach naukowych. Według danych z bazy MEDLINE 2
tylko z hasłem endotelina w ostatnim 2013 roku wiąże się około 180 publikacji, a według bazy SCOPUS aż 470 artykułów. Podjęcie się przez Doktorantkę wyjaśnienia złożonego mechanizmu udziału endoteliny-1, oksydazy NADPH, oksydazy ksantynowej i kinazy białkowej C w procesie powstawania reaktywnych form tlenu w komórkach serca i płuc szczurów jest bardzo aktualne oraz niezwykle istotne w aspekcie medycznym, poznawczym i praktycznym i stanowi o nowatorskim charakterze Jej pracy. Przedstawiona mi do recenzji rozprawa doktorska mgr Pauliny Kleniewskiej została wykonana pod kierunkiem prof. dr hab. Anny Gorącej w Zakładzie Fizjologii Doświadczalnej i Klinicznej Uniwersytetu Medycznego w Łodzi. Rozprawa doktorska ma typowy układ i jest napisana starannie. Bardzo dobrze opracowany, obszerny Wstęp stanowi znakomite wprowadzenie do tematyki badawczej rozprawy i dostarcza jednocześnie szeregu istotnych informacji m.in. na temat występowania, syntezy, ekspresji i biologicznego działania endoteliny-1. Doktorantka również bardzo wnikliwie opisuje rodzaje reaktywnych form tlenu, ich źródła, działanie biologiczne oraz enzymatyczny i nieenzymatyczny system antyoksydacyjny. Cele pracy są sformułowane prawidłowo. Doktorantka założyła zbadanie wpływu podanej dożylnie endoteliny-1. na tworzenie wolnych rodników w sercu i płucach na podstawie oznaczenia markerów stresu oksydacyjnego oraz stężenia czynnika martwicy nowotworów (TNF-α). Ponadto zbadała mechanizm receptorowego działania endoteliny-1 w narządach wewnętrznych szczura oraz postanowiła określić główne źródła powstawania reaktywnych form tlenu w badanych narządach. Plan pracy badawczej jest zaprojektowany logicznie i konsekwentnie wykonany. Metody zastosowane w pracy: spektrofotometryczne, fluorescencyjne i immunoenzymatyczne wydają się być właściwe do rozwiązania problemu będącego przedmiotem rozprawy doktorskiej. Opis stosowanych metod jest jasny i dokładny, stwarzający możliwość powtórzenia opisywanych doświadczeń. Wyniki badań przedstawione są szczegółowo w formie opisowej oraz w przejrzystych sześciu tabelach i dwudziestu dwóch wykresach. Nie widzę celowości szczegółowego omawiania wyników badań w recenzji, chciałabym jednak zwrócić uwagę na szczególnie ważne aspekty uzyskanych wyników oraz te, które nie zostały w pełni skomentowane w rozprawie. Doktorantka prowadziła badania na małej liczbie sześciu szczurów, dla określonej grupy badawczej. Nasuwa się tutaj pytanie czy taka liczba osobników jest wystarczająca do tego typu badań. Prosiłabym Doktorantkę o wyjaśnienie tej kwestii. Mgr Paulina Kleniewska wykazała, że podanie dożylne szczurom endoteliny-1 powoduje istotny wzrost stężenia produktów peroksydacji lipidów oraz poziomu nadtlenku wodoru, znaczący spadek stężenia białka całkowitego, glutationu zredukowanego oraz wolnych grup SH w homogenatach serc i płuc tych zwierząt. Doktorantka w celu oceny stresu oksydacyjnego mierzyła poziom białka całkowitego. Prosiłabym o wyjaśnienie, w jaki sposób poziom białka całkowitego wiąże się ze stresem oksydacyjnym? 3
Istotnym wynikiem badań Doktorantki jest wykazanie, że podana dożylnie ET-1 zwiększa produkcję RFT głównie za pośrednictwem receptorów ET A natomiast receptory ET B nie uczestniczą w tym procesie. Doktorantka po zastosowaniu blokera receptora ET A BQ123 zaobserwowała znaczące obniżenie zmian charakterystycznych dla stresu oksydacyjnego. Zastosowanie zaś blokera receptora ET B - BQ788 nie spowodowało takiego efektu, a nawet zaobserwowano działanie przeciwne antyoksydacyjne przejawiające się we wzroście poziomu grup SH oraz stosunku GSH/GSSG. Wyniki te wydają się być szczególnie ważne, gdyż publikowane w literaturze światowej dane nie są jednoznaczne w odniesieniu do roli receptora ET B w indukcji stresu oksydacyjnego, a liczba publikacji z tego zakresu wskazuje na wagę problemu. Kolejnym zagadnieniem analizowanym przez Doktorantkę był wpływ wyżej wymienianych enzymów i ich blokerów na wartość ciśnienia tętniczego krwi. Mgr Paulina Kleniewska wykazała, że zmniejszenie powstawanie RFT na skutek podania blokera receptora ET A, blokerów oksydazy NADPH, syntazy tlenku azotu oraz kinazy białkowej C istotnie wiąże się z obniżaniem ciśnienia tętniczego krwi. Jest to bardzo ciekawe zagadnienie i w związku z tym prosiłabym o wyjaśnienie w świetle danych literaturowych w jaki sposób RFT mogą wpływać na ciśnienie tętnicze krwi. Dyskusja, omawiająca uzyskane wyniki badań w kontekście bogatych danych piśmiennictwa, jest interesująco napisana. Podział dyskusji na rozdziały dotyczące poszczególnych zagadnień ułatwia zapoznanie się z jej treścią. Autorka zaprezentowała dużą wiedzę teoretyczną w zakresie realizowanej tematyki badawczej. Wyczerpująco i krytycznie przeanalizowała swoje wyniki, porównując je z badaniami innych autorów. Pracę kończy rozdział Wnioski w którym przedstawiono 9 głównych osiągnięć badawczych płynących z przeprowadzonych badań. Doktorantka wykazała, że endotelina-1 podana dożylnie stymuluje produkuję RFT w sercu i płucach szczurów. Powstanie zaś RFT odbywa się głównie za pośrednictwem receptorów ET A. Źródłem zaś RFT w sercu szczurów jest oksydaza NADPH natomiast w płucach syntaza NO. Ponadto mgr Paulina Kleniewska wykazała, że endotelina-1 podana dożylnie wpływa na wzrost ciśnienia tętniczego krwi za pośrednictwem receptora ET A, oksydazy NADPH oraz kinazy białkowej. Piśmiennictwo obejmuje aż 260 pozycji, w znakomitej większości oryginalnych prac anglojęzycznych, opublikowanych w ostatnich kilkunastu latach. W rozprawie doktorskiej znalazłam pewne uchybienia i błędy edytorskie, które najprawdopodobniej wynikają z pośpiechu, w jakim przeważnie pisane są rozprawy doktorskie. Pomimo tego, że nie obniżają one bardzo dobrego pod względem merytorycznym, poziomu pracy, chciałabym z obowiązku recenzenta przekazać Doktorantce niektóre z nich: 1. W opisie skrótów Doktorantka stosuje niepotrzebnie wyjaśnienia dla pierwiastków i prostych wzorów chemicznych np. NO, H 2 O 2, O 2, Fe 2+, Fe 3+, przecież powszechnie wiadomo, co te symbole oznaczają. 2. Ponadto nie ma konsekwencji w opisie skrótów raz są wyjaśnienia z nazwą angielską, raz nie ma, a czasami są tylko same nazwy angielskie, nie ma kolejności alfabetycznej co znacznie utrudnia szukanie danego skrótu. 4
3. Także w tekście Doktorantka stosuje niekonsekwentnie nazwy angielskie blokerów np. hydrochloride zamiast chlorowodorek na przemian z odpowiednikami polskimi bądź skrótami. 4. Cel pracy: Doktorantka pisze Celem podjętych badań było zbadanie egzogennie podanej endoteliny 1 (ET-1)... moim zdaniem zastosowanie tutaj jak również w innych miejscach w pracy określenia egzogennie podanej to błąd stylistyczny egzogenne są substancje niemożliwe do wytworzenia przez organizm, ale nie endotelina, którą komórki śródbłonka szczura wytwarzają na co dzień. Powinno być moim zdaniem podanej dożylnie zamiast egzogennie podanej. 5. Brak wyjustowania tekstu, czasami są na końcu wierszy pojedyncze litery np. i, w, z. Występują drobne błędy jak np. z kwasem barbiturowym zamiast tiobarbiturowym 6. Metody: - str. 47 opis grup badawczych: Grupa X - podawano inhibitor specyficzny dla izoenzymów α i β1 warto dodać jakiego enzymu - kinazy białkowej C, - str. 52. Mierzono natężenie emisji o długości fali 420 nm powinno być Mierzono natężenie emisji przy długości fali 420 nm, - str. 54. przyrost próbki mierzono raczej przyrost absorbancji próbki mierzono, - str 46. Doktorantka w opisie metod pisze, że grupy badawcze III i IV liczyły 3 osobniki, natomiast w opisie wyników podaje 6. Proszę o wyjaśnienie prawidłowej wartości n dla tych grup. 7. Wyniki: Doktorantka wyniki z peroksydacji lipidów przedstawia jako stężenie TBARsów (µmol/l). Niestety w literaturze bardzo często spotykamy się z takim, moim zdaniem, błędnym zapisem. Prosiłabym o wyjaśnienie, czy zastosowanie tetrametoksypropanu jako wzorca do krzywej kalibracyjnej uprawnia do takiego zapisu. Z jakiego molowego współczynnika Doktorantka korzystała? Czy TBARS-y mają molowy współczynnik absorpcji aby ich stężenie można było podawać w µmol/l? 8. Wartości liczbowe w tabelach i tekście powinny być podawane konsekwentnie do dwóch lub trzech miejsc po przecinku. Przedstawione powyżej drobne błędy występujące w rozprawie, nie wpływają na oczywiste walory poznawcze jak i aplikacyjne recenzowanej pracy. Podsumowując, przedstawioną mi do recenzji rozprawę oceniam wysoko. Praca jest interesująca, prezentuje bardzo dobry poziom merytoryczny i posiada dużą wartość aplikacyjną. Uzyskane wyniki i wykonane szczegółowe analizy stanowią oryginalny wkład Doktorantki i Jej Promotora w badania nad udziałem endoteliny-1, oksydazy NADPH, oksydazy ksantynowej i kinazy białkowej C w procesie powstawania reaktywnych form tlenu. Rozprawa doktorska mgr Pauliny Kleniewskiej wraz ze wstępem teoretycznym stanowi cenne kompendium wiedzy na ten temat dla osób zajmujących się podobną tematyką badawczą. Podkreślić należy również dużą aktywność naukową Doktorantki, którą dokumentują publikacje i wystąpienia konferencyjne. Mgr Paulina Kleniewska opublikowała aż 14 prac 5
naukowych, w tym 4, w których jest pierwszym autorem. Wartość współczynnika oddziaływania (Impact factor) opublikowanych prac doświadczalnych jest wysoka i wynosi 19,81. Ponadto Doktorantka napisała jeszcze dwie prace z wyników pracy doktorskiej znajdujące się obecnie w recenzji. Jej prace były 24 razy cytowane a indeks Hirscha wynosi 3. Podsumowując, rozprawa doktorska Pani mgr Pauliny Kleniewskiej ma wszelkie cechy rozprawy naukowej; uzyskane dane mają dużą wartość poznawczą, są wynikiem racjonalnie zaplanowanych i konsekwentnie zrealizowanych doświadczeń. Zatem, rozprawa spełnia z powodzeniem wymogi określone w art. 14 i 15 Ustawy o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki z dnia 14 marca 2003 r., z późniejszymi zmianami. Wnoszę do Wysokiej Rady Uniwersytetu Medycznego w Łodzi o dopuszczenie mgr Pauliny Kleniewskiej do dalszych etapów przewodu doktorskiego. Biorąc pod uwagę wartość uzyskanych rezultatów, fakt opublikowania już części wyników oraz znaczny ogólny dorobek naukowy Doktorantki wnioskuję o wyróżnienie niniejszej rozprawy stosowną nagrodą. Dr hab. Bożena Bukowska, prof. nadzw. UŁ 6