BROMAT. CHEM. TOKSYKOL. XLII, 2009, 3, str. 1011 1016 Barbara Bobrowska, Andrzej Tokarz, Sławomir Białek 1), Tserendejid Bat-Erdene 8-izoPGF 2α W SUROWICY KRWI JAKO BIOWSKAŹNIK ZMIAN ZACHODZĄCYCH W PROCESIE NOWOTWOROWYM INDUKOWANYM DMBA U SZCZURÓW Katedra i Zakład Bromatologii Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego Kierownik: prof. nadzw. dr hab. A. Tokarz 1) Katedra i Zakład Biochemii i Chemii Klinicznej Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego Kierownik: prof. dr hab. J. Pachecka Celem pracy było określenie wpływu czynników dietetycznych, działających peroksydacyjnie (wybranych olejów ogrzewanych i nie ogrzewanych) oraz antyoksydacyjnie (związków polifenolowych-genisteiny i resweratrolu) na zawartość 8-izoprostaglandyny F 2α (8-izoPGF 2α ) w surowicy u szczurów traktowanych w celu wywołania nowotworu sutka 7,12-dimetylobenz[a]antracenem (DMBA). W wyniku przeprowadzonych badań stwierdzono, że obecność DMBA w diecie szczurów powoduje wzrost zawartości 8-izoPGF 2α w surowicy krwi badanych zwierząt. Zawartość badanego biowskaźnika w surowicy pozostaje zależna od występowania w diecie zarówno olejów, jak i związków przeciwutleniających. Związki przeciwutleniające (genisteina i resweratrol) zastosowane w wybranych dawkach nie obniżają podwyższonej zawartości 8-izoPGF 2α wywołanej czynnikiem kancerogennym. Hasła kluczowe: 8-izoprostaglandyna F 2α (8-izoPGF 2α ), 7,12-dimetylobenzantracen (DMBA), oleje roślinne, związki polifenolowe. Key words: 8-isoprostane F 2α (8-isoPGF 2α ), 7,12-dimethylbenzanthracene (DMBA), plant s oils, polyphenolic compounds. W poszukiwaniu najskuteczniejszych biowskaźników peroksydacji lipidów szczególną uwagę zwraca się ostatnio na grupę F 2 -izoprostanów, związków wytwarzanych z kwasu arachidonowego. Ich podwyższone stężenie wykryto w moczu i krwi w wielu stanach patologicznych, którym towarzyszy nadmierne tworzenie się wolnych rodników, w tym w nowotworach. Związki te posiadają wiele zalet, są dobrymi wskaźnikami określającymi stopień nasilenia choroby, jak również dostarczają informacji o zachodzących zmianach w organizmie (1, 2, 3). Celem pracy było więc określenie wpływu wybranych elementów diety, działających prooksydacyjnie (olejów ogrzewanych i nie ogrzewanych) oraz antyoksydacyjnie (związków polifenolowych-genisteiny i resweratrolu) na zawartość 8- izopgf 2α w surowicy szczurów traktowanych w celu wywołania nowotworu sutka 7,12-dimetylobenz[a]antracenem. Pogłębienie wiedzy na temat mechanizmów działania związków pro- i antyoksydacyjnych na proces peroksydacji lipidów może przyczyniać się do skuteczniej-
1012 B. Bobrowska i inni Nr 3 szego jej wykorzystania w profilaktyce chorób bądź we wspomaganiu leczenia farmakologicznego, a także w ocenie możliwości wykorzystania 8-izoPGF 2α jako wiarygodnego biowskaźnika. MATERIAŁ I METODY Materiałem do badań była surowica szczurów Sprague-Dawley (masa ciała ± 210 g). Zwierzęta pochodziły z Pracowni Zwierząt Laboratoryjnych Katedry i Zakładu Patologii Ogólnej i Doświadczalnej Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego. Badania na zwierzętach uzyskały aprobatę Komisji Etycznej przy WUM. Zwierzęta podzielono na dwie grupy badawcze: Grupa Ι grupa badana szczury, którym podawano w 50 i 80 dniu życia 7,12-dimetylobenz[a]antracen w dawce 80 mg/kg masy ciała w celu wywołania nowotworów sutka (grupa DMBA+). Grupa IΙ grupa kontrolna szczury, które przebywały w identycznych warunkach jak zwierzęta z grupy badanej, otrzymywały analogiczną dietę; nie traktowane były 7,12-dimetylobenz[a]antracenem (grupa DMBA-). Zwierzęta w obu grupach badawczych otrzymywały diety o zwiększonej zawartości tłuszczów ogrzewanych i nie ogrzewanych bądź diety zróżnicowane pod względem rodzaju związków polifenolowych zawieszonych w układzie wodnym bądź olejowym. Rodzaje diet zastosowane w badaniach: dieta z dodatkiem oliwy nie ogrzewanej, dieta z dodatkiem oleju słonecznikowego nie ogrzewanego, dieta z dodatkiem oleju rzepakowego nie ogrzewanego, dieta z dodatkiem oliwy ogrzewanej (10 minut, 200 C), dieta z dodatkiem oleju słonecznikowego ogrzewanego (10 minut, 200 C), dieta z dodatkiem oleju rzepakowego ogrzewanego (10 minut, 200 C). dieta z dodatkiem resweratrolu w dawce 0,1 mg/ml w oleju rzepakowym, dieta z dodatkiem resweratrolu w dawce 0,1 mg/ml w zawiesinie wodnej, dieta z dodatkiem genisteiny w dawce 0,375 mg/ml w oleju rzepakowym, dieta z dodatkiem genisteiny w dawce 0,375 mg/ml w zawiesinie wodnej, dieta z dodatkiem genisteiny w dawce 0,1 mg/ml w zawiesinie wodnej. Wyżej wymienione elementy diety podawano indywidualnie każdemu szczurowi sondą dożołądkową w ilości 0,4 ml/dzień od 40 dnia życia do czasu dekapitacji (20 tydzień życia szczurów). Dawki związków polifenolowych ustalono na podstawie danych z piśmiennictwa, dotyczących średniego dziennego spożycia ww. związków z dietą przez ludzi (w przeliczeniu na masę ciała). Szczury miały zapewniony ciągły dostęp do wody i paszy. Przebywały w warunkach o stałej temperaturze (22 C) i kontrolowanym okresie dzień/noc. Zawartość 8-izoPGF 2α w surowicy szczurów oznaczano metodą ELISA. W tym celu wykorzystano test 8-isoprostane EIA Kit, firmy Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA.
Nr 3 1013 8-izoPGF 2α jako biowskaźnik zmian w procesie nowotworowym WYNIKI I ICH OMÓWIENIE W przeprowadzonych badaniach oznaczano zawartość 8-izoPGF 2α w surowicy krwi szczurów, u których wywoływano nowotwór sutka za pomocą DMBA oraz w grupie kontrolnej, nie narażonej na czynnik kancerogenny. Dodatkowo zbadano również wpływ wybranych składników diety, tłuszczów ogrzewanych i nie ogrzewanych, traktowanych jako czynniki prooksydacyjne, bądź diety zróżnicowane pod względem rodzaju i dawki związków polifenolowych (genisteina i resweratrol) działających antyoksydacyjnie, na proces tworzenia się badanego biowskaźnika Otrzymane wyniki wskazują, że zawartość 8-izoPGF 2α w surowicy szczurów traktowanych DMBA i otrzymujących dietę standardową była wyższa w porównaniu z grupą kontrolną otrzymującą analogiczną dietę, pozbawioną DMBA (853,57±428,24 pg/ml wobec 500,38±89,69 pg/ml) (ze względu na wysoką wartość odchylenia standardowego nie były to jednak różnice istotne statystycznie) (ryc. 1). Ryc. 1. Zawartość 8-izoPGF 2α w surowicy szczurów traktowanych bądź nie-dmba i otrzymujących dietę standardową wzbogaconą ogrzewanymi bądź nie ogrzewanymi olejami. Fig. 1. The effect of diet suplemented with heated or unheated oils on serum 8-isoPGF 2α content (means ± standard deviation) in DMBA treated and untreated animals. /DMBA+/-grupa traktowana 7,12-dimetylo-1,2-benz[a]antracenem. /DMBA-/-grupa nie traktowana 7,12-dimetylo-1,2-benz[a]antracenem. Podobną tendencję zauważono, gdy zwierzęta otrzymywały dietę wzbogaconą w wybrane polifenole (genisteinę i resweratrol) w zawiesinie wodnej (ryc. 2). Wyższą zawartość 8-izoPGF 2α stwierdzono u zwierząt traktowanych DMBA i otrzymujących olej rzepakowy ogrzewany, w porównaniu do szczurów nie traktowanych czynnikiem kancerogennym, otrzymujących analogiczną dietę (ryc. 1). Podsumowując można stwierdzić, że DMBA, czynnik indukujący nowotwory piersi adenocarcinoma, powoduje wzrost zawartości 8-izoPGF 2α w surowicy szczurów. Podobne rezultaty uzyskali Awad i współpr. (4), oznaczając 8-izoPGF 2α w żółci
1014 B. Bobrowska i inni Nr 3 szczurów intoksykowanych czterochlorkiem węgla. W innym badaniu, ilość izoprostanów wzrosła aż 200-krotnie w porównaniu do grupy kontrolnej, kiedy szczurom poddano czterochlorek węgla lub parakwat (5). Nieco inaczej przedstawiają się wyniki badań, wśród zwierząt otrzymujących dietę standardową wzbogaconą olejami nie ogrzewanymi (oliwą, olejem słonecznikowym, olejem rzepakowym) (ryc. 1). Podwyższona ilość tłuszczu w diecie stymulowała proces tworzenia izoprostanów, szczególnie w grupie nie traktowanej DMBA. W związku z powyższym zawartość badanego biowskaźnika u zwierząt nie stymulowanych czynnikiem kancerogennym i otrzymujących oleje nie ogrzewane była wyższa niż u zwierząt, u których wywołano guzy. Istotne statystycznie różnice w zawartości biowskaźnika wystąpiły u zwierząt nie traktowanych DMBA i otrzymujących dietę z nie ogrzewanym olejem rzepakowym bądź oliwkowym, w odniesieniu do grupy będącej na diecie standardowej (ryc. 1). Ciekawy jest fakt, że u zwierząt traktowanych DMBA i otrzymujących oleje nie ogrzewane obserwowano nawet niższą (choć nie istotną statystycznie) zawartość badanego biowskaźnika w porównaniu z grupą kontrolną na diecie standardowej (ryc. 1). Zwierzęta otrzymujące diety z olejami ogrzewanymi (oliwkowym i rzepakowym) charakteryzowały się wyższą zawartością badanego biowskaźnika w porównaniu do zwierząt będących na diecie standardowej zarówno dla grupy traktowanej, jak i nie traktowanej DMBA (ryc. 1). Podobną tendencję zaobserwowano u zwierząt otrzymujących dietę z oliwą ogrzewaną w odniesieniu do grupy otrzymującej oliwę nie ogrzewaną (grupa DMBA+/ DMBA-), jak również w przypadku grupy traktowanej DMBA dla diety z olejem rzepakowym (wartości istotne statystycznie) (rycina 1). Z przeprowadzonych badań wynika, że wzbogacanie diety olejami (ogrzewanymi i nie ogrzewanymi) ma wpływ na zawartość 8-izoPGF 2α w surowicy. W przypadku grup zwierząt traktowanych DMBA silniejsze oddziaływanie stymulujące wykazywały oleje ogrzewane. Podobne rezultaty uzyskali badając oleje nie ogrzewane Visioli i współpr. (6). Badane związki przeciwutleniające nie zdołały obniżyć podwyższonej zawartości 8-izoPGF 2α wywołanej czynnikiem kancerogennym-dmba (ryc. 2). A nawet w przypadku, gdy polifenole podawano w zawiesinie olejowej obserwowano wyraźnie wyższą zawartość biowskaźnika zarówno w odniesieniu do grupy zwierząt otrzymujących dietę standardową, jak i diety wzbogacone analogicznymi polifenolami podawanymi w zawiesinie wodnej. Podobne rezultaty otrzymał Willcox i współpr. (7). Na podstawie uzyskanych wyników analizy zawartości F 2 -izoprostanów w sercu i surowicy szczurów badacze stwierdzili, że w zastosowanym modelu doświadczalnym związki flawonoidowe nie zdołały zahamować, wywołanej podwyższoną ilością tłuszczu w diecie, peroksydacji lipidów (7). Cacetta i współpr. (8) w przeprowadzonym badaniu nie zaobserwowali zmian zawartości biowskaźnika u palaczy, którzy spożywali czerwone i białe wino. Natomiast istotnie statystyczne obniżenie wystąpiło, gdy uczestnicy doświadczenia (palacze) spożywali czerwone wino bezalkoholowe (8). W badaniu przeprowadzonym przez Wiseman i współpr. (9) osoby, które spożywały dietę bogatą w izoflawony sojowe charakteryzowały się niższą zawartością 8-izoPGF 2α.
Nr 3 1015 8-izoPGF 2α jako biowskaźnik zmian w procesie nowotworowym Ryc. 2. Zawartość 8-izoPGF 2α w surowicy szczurów traktowanych bądź nie-dmba i otrzymujących dietę standardową wzbogaconą w wybrane związki polifenolowe. Fig. 2. The effect of diet-enriched polyphenolic compounds on serum 8-isoPGF 2α content (means ± standard deviation) in DMBA treated and untreated animals. WNIOSKI 1. Traktowanie szczurów DMBA, związkiem indukującym nowotwory piersi, powoduje wzrost zawartości 8-izoPGF 2α w surowicy krwi badanych zwierząt. 2. Zawartość badanego biowskaźnika w surowicy pozostaje zależna od obecności w diecie zarówno olejów, jak i związków przeciwutleniających. 3. Związki przeciwutleniające (genisteina i resweratrol) zastosowane w wybranych dawkach nie obniżają podwyższonej zawartości 8-izoPGF 2α wywołanej czynnikiem kancerogennym DMBA. 4. Ze względu na zakres zmian, jakim podlega wybrany biowskaźnik i jego reakcję na składniki diety, wydaje się niemożliwe traktowanie go jako dobrego markera stanów patologicznych, natomiast może służyć dla oceny elementów diety pod kątem ich oddziaływania na procesy prooksydacyjne. B. Bobrowska, A. Tokarz, S. Białek, T. Bat-Erdene 8-isoPGF 2α IN SERUM AS A BIOMARKER OF CHANGES IN THE INDUCED DMBA CANCER PROCESS IN RATS Summary The correlation between diets supplemented with heated and unheated oils or polyphenolic compounds on oxidative lipids damage (8-isoPGF 2α in serum) in rats in which breast cancer was induced with DMBA was assessed. The results of the study show that DMBA-induced carcinogenesis was accompanied by increased serum 8-isoPGF 2α levels in rats. The intensity of this process was distinctly conditional upon the presence of polphenolic compounds or fatty acids. Enrichment of diet with polyphenols did not reduce 8-isoPGF 2α contents resulting from DMBA-induced carcinogenesis.
1016 B. Bobrowska i inni Nr 3 PIŚMIENNICTWO 1. Cracowski J.L.: Isoprostanes: an emerging role in vascular physiology and disease. Chem. Phys. Lipids, 2004; 128: 75-83. 2. Cracowski J.L., Durand T., Bessadr G.: Isoprostanes as a biomarker of lipid peroxidation in humans: physiology, pharmacology and clinical implications. Trends Phamacol. Sci, 2002; 23: 360-366. 3. Montuschi P., Corradi M., Ciabattoni G., Nightingale J., Kharitonov S.A., Barnes P.J.: Increased 8-isoprostane, a marker of oxidative stress, in exhaled condensate of asthma patients. Am. J. Crit. Care Med, 1999; 160: 216-220. 4. Awad J.A., Morrow J.D.: Excretion of F 2 -izoprostanes in bile: A novel index of hepatic lipid peroxidation. Hepatology, 1995; 22: 962-968. 5. Tokarz A., Jelinska M., Ozga A.: Izoprostany nowym wskaźnikiem stresu oksydacyjnego. Bromat. Chem. Toksykol, 2004; 37: 203-208. 6. Visioli F., Caruso D., Grande S., Bosisio R., Villa M., Gall G., Sittoni C., Galli C.: Virgin olive oil study (VOLOS): vasoprotective potential of extra virgin olive oil in mildly dyslipidemic patients. Eur. J. Nutr, 2005; 44: 121-127. 7. Willcox J.K., Catignani G.L., Roberts L.J.: Dietary flavonoids fail to suppress F 2 -isoprostane formation in vivo. Free Radical Bio. Med, 2003; 34: 795-799. 8. Cacetta R.A.A., Burke V., Mori T.A., Beilin L.J., Puddey I.B., Croft D.K.: Red vine poliphenols, in the absense of alcohol, reduce lipid peroxidative stress in smoking subjects. Free Radical Bio. Med, 2001; 30: 636-642. 9. Wiseman H., O Reilly J.D., Adlercreutz H., Mallet A.I., Bowey E.A., Rowland I.R., Sanders T.A.B.: Isoflavone estrogens consumed in soy decrease F 2 -isoprostane concentrations and increase resistance of low-density lipoprotein to oxidation in humans. Am. J. Clin. Nutr, 2000; 72: 395-400. Adres: 02-097 Warszawa, ul. Banacha 1.