ZESZYTY PROBLEMOWE POSTĘPÓW NAUK ROLNICZYCH 2009 z. 534: 297-305 LOKALIZACJA GRADIENTU AUKSYNY ORAZ ROZMIESZCZENIE BIAŁEK PIN W PROLIFERUJĄCYM I RÓśNICUJĄCYM SIĘ TRANSGENICZNYM KALUSIE Arabidopsis thaliana 1 Justyna Wiśniewska, Małgorzata Pietrzykowska, Bogumiła Szyndel, Andrzej Tretyn Zakład Biotechnologii, Instytut Biologii Ogólnej i Molekularnej, Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu Wstęp Auksyna kontroluje szeroki zakres procesów zachodzących podczas ontogenezy rośliny, m.in.: stymulowanie podziałów komórkowych kambium, wzrost wydłuŝeniowy komórek, róŝnicowanie się tkanek przewodzących, tworzenie korzeni bocznych [DAVIES 2004]. Unikalną właściwością auksyny jest jej polarny transport, kontrolowany przez białka PIN odpowiedzialne za wypływ tego hormonu z komórki. Wykazano, iŝ to one odgrywają znaczącą rolę w asymetrycznym rozmieszczeniu stęŝenia tego fitohormonu w ciele rośliny, co ma ogromne znaczenie zarówno podczas wzrostu i rozwoju rośliny juŝ na etapie zarodkowym, jak i podczas dalszych etapów ontogenezy [FRIML i in. 2002a, b; BENKOVÁ i in. 2003; FRIML i in. 2003b; VIETEN i in. 2005; TANAKA i in. 2006; WIŚNIEWSKA i in. 2006]. Prawidłowy przebieg rozwoju zarodkowego i tworzenia korzeni bocznych uwarunkowany jest dynamiczną zmianą lokalizacji białek PIN [BENKOVÁ i in. 2003; FRIML i in. 2003b]. Wewnątrz komórki istnieje stała pula krąŝących białek PIN w endosomach, które pod wpływem róŝnych czynników mogą przemieszczać się z błony do cytoplazmy, przez to wpływając na kierunek i wydajność transportu auksyny [PACIOREK i in. 2005]. Auksyna odgrywa istotną rolę w kulturach in vitro, gdyŝ wraz z cytokininami indukuje bezpośrednią organogenezę [MANDAL, DUTTA GUPTA 2001; ŠUŠEK i in. 2002; BOLTENKOV, ZAREMBO 2005; TILKAT, ONAY 2009] oraz stymuluje namnaŝanie kalusa i organogenezę pośrednią korzenia i pędu [SKOOG, MILLER 1957; KORACH i in. 2002] oraz somatyczną embriogenezę [MONNIER 1990]. Wykorzystując w badaniach rośliny transgeniczne DR5rev::GFP, PIN1::GFP, PIN4::GFP, PIN7::GFP A. thaliana oraz mikroskop konfokalny określano, pośrednio wykorzystując gen reporterowy GFP, lokalizację gradientu auksyny i rozmieszczenie chimerycznych białek PIN1-GFP, PIN4- GFP i PIN7-GFP podczas wzrostu i róŝnicowania się kalusa w warunkach in vitro, 1 Badania realizowano w ramach projektu badawczego finansowanego przez Fundację na Rzecz Nauki Polskiej oraz Rektora UMK w Toruniu 484-B.
298 J. Wiśniewska i inni który stanowi waŝny etap podczas regeneracji pośredniej. Stworzenie roślin transgenicznych DR5rev::GFP A. thaliana, zawierających konstrukt składający się z syntetycznego promotora DR5rev (dziewięciokrotnie powtórzona odwrotna sekwencja TGTCTC, wchodząca w skład promotora genów pierwotnej odpowiedzi na auksynę) oraz genu reporterowego GUS lub GFP umoŝliwia śledzenie akumulacji aktywnej auksyny na poziomie pojedynczej komórki [FRIML i in. 2002a, b; BENKOVÁ i in. 2003; FRIML i in. 2003b; DE REUILLE i in. 2006]. Analiza poziomu ekspresji i zmian lokalizacji białek PIN przyczyni się do zrozumienia istoty mechanizmu ukierunkowanego transportu auksyny podczas wzrostu i róŝnicowania się komórek kalusa, a następnie indukcji organogenezy korzenia i pędu w warunkach in vitro u A. thaliana. Sterylizacja nasion A. thaliana Materiał i metody Nasiona roślin transgenicznych DR5rev::GFP, PIN1::GFP, PIN4::GFP oraz PIN7::GFP A. thaliana (uzyskane od dr. J. Friml, Ghent University) sterylizowano w probówkach Eppendorfa 20% roztworem domestosu (NaOCl) przez 20 minut, kilkukrotnie wytrząsając. Następnie w warunkach sterylnych płukano nasiona sterylną wodą destylowaną, po czym odwirowywano w wirówce Eppendorf typ 5415R przez 10 sekund, stosując maksymalne obroty (1500 rpm). Czynności te powtarzano cztery razy. Wysterylizowane nasiona wykładano aseptyczną wykałaczką na sterylne szalki Petriego o średnicy 14 cm, zawierające około 20 ml poŝywki MS [MURASHIGE, SKOOG 1962]. Rośliny hodowano w komorze na ciągłym świetle (40 µm m -2 s -1 ), przez 7 dni w temperaturze 24-26 C. Indukcja kalusa Sterylne, 7-dniowe siewki roślin transgenicznych A. thaliana wykorzystano do załoŝenia kultury kalusa. 2-3 mm fragmenty hipokotyli wykładano horyzontalnie na szalki Petriego, zawierające około 20 cm 3 poŝywki CIM (ang. callus-inducing medium), indukującej tworzenie kalusa. PoŜywka CIM zawierała 0,1 mg dm -3 kinetyny oraz 0,5 mg dm -3 2,4-D [FELDMANN, MARKS 1986]. Wszystkie czynności wykonywano w aseptycznych warunkach. Hodowlę kalusa prowadzono w komorze hodowlanej na ciągłym świetle (40 µm m -2 s -1 ), w temperaturze 24-26 C. Analiza lokalizacji gradientu auksyny oraz rozmieszczenia białek PIN Lokalizację aktywnej auksyny oraz chimerycznych białek PIN1-GFP, PIN4-GFP i PIN7-GFP w kilkudniowym i 2-tygodniowym transgenicznym kalusie pochodzącym z hipokotyli roślin DR5::GFP, PIN1:GFP, PIN4:GFP i PIN7:GFP A. thaliana analizowano pośrednio, wykorzystując fluorescencję białka reporterowego GFP. W celu wizualizacji fluorescencji GFP w zakresie światła zielonego (508 nm) wzbudzano eksplanty światłem ultrafioletowym (395-398 nm) i niebieskim (470-475 nm), wykorzystując skaningowy mikroskop konfokalny Nikon Eclipse T300 z laserem helowo-neonowym. Przed obserwacją pod mikroskopem eksplanty inkubowano przez 5-10 minut w jodku propidyny (SIGMA P4567) (1:1000) [TAS, WESTERNENG 1981], a następnie płukano w wodzie destylowanej i umieszczano na szkiełku podstawowym w 5% glicerolu. Materiał badawczy przykrywano szkiełkiem nakrywkowym i dokonywano obserwacji. Dokumentację fotograficzną wykonano wykorzystując
LOKALIZACJA GRADIENTU AUKSYNY ORAZ ROZMIESZCZENIE BIAŁEK PIN... 299 program EZ Viewer 2000 (Laboratory Imaging, Prague, Czech Republic). Wyniki i dyskusja Obecność komórek kalusa na obu końcach fragmentów hipokotyli roślin transgenicznych A. thaliana, na poŝywce CIM stwierdzono juŝ po 4-6 dniach hodowli (dane nieprzedstawiane). Fluorescencję białka reporterowego GFP, odzwierciedlającego lokalizację aktywnej auksyny, zaobserwowano tylko w młodych i intensywnie dzielących się komórkach kalusa DR5rev::GFP (fot. 1A 1 ). Hormon ten zlokalizowano na terenie cytoplazmy komórek tkanki przyrannej (fot. 1B 1 ), a w niektórych komórkach auksyna występowała takŝe na terenie jądra komórkowego (fot. 1C 1 ). Stwierdzono, iŝ w cytoplazmie hormon ten jest rozmieszczony nierównomiernie, gdyŝ w niektórych miejscach zaobserwowano wyraźnie zwiększony poziom fluorescencji białka reporterowego GFP (fot. 1B 1 i C 1 ). Wykazano, Ŝe egzogennie podana auksyna indukuje ekspresję zarówno DR5rev, jak i PIN [FRIML i in. 2003b; VIETEN i in. 2005]. Jak dotąd brak doniesień naukowych, w jakich organellach komórki auksyna mogłaby być akumulowana. Najprawdopodobniej są to endosomy, w których zidentyfikowano białka AUX i PIN, odpowiedzialne za transport tego hormonu [GELDNER i in. 2001, 2003; PACIO- REK i in. 2005; KLEINE-VEHN i in. 2006; DHONUKSHE i in. 2007]. Obecność auksyny w jądrze komórkowym tłumaczy fakt, iŝ podwyŝszony poziom tego fitohormonu aktywuje geny wczesnej lub tzw. pierwotnej odpowiedzi na auksynę - Aux/IAA, SAUR i GH3, których ekspresję obserwowano po kilku minutach od traktowania roślin tym hormonem [HAGEN, GUILFOYLE 2002]. Tylko w młodych i szybko proliferujących komórkach transgenicznego kalusa stwierdzono wysoki poziom ekspresji PIN1:GFP (fot. 1A 2 ) i PIN7:GFP (fot. 1A 3 ), nie zaobserwowano zaś ekspresji PIN4:GFP (dane nieprzedstawiane). Chimeryczne białka PIN1-GFP i PIN7-GFP były równomiernie rozmieszczone w błonie komórkowej i na terenie cytoplazmy obserwowanych komórek (fot. 1A 1 i A 3 oraz 1B 2 ). Najprawdopodobniej białka PIN1 i PIN7 uczestniczą w utrzymywaniu odpowiedniego gradientu auksyny w tego typu komórkach tkanki przyrannej, choć nie moŝna wykluczyć udziału pozostałych, nieuwzględnionych w badaniach białek PIN. Apolarna lokalizacja białek PIN1-GFP i PIN7-GFP w plazmalemmie komórek kalusa, najprawdopodobniej związana jest z brakiem ukierunkowanego krótkodystansowego transportu auksyny w tych komórkach.
300 J. Wiśniewska i inni Fot. 1. Photo 1. Lokalizacja gradientu auksyny oraz białek PIN1-GFP i PIN7-GFP w kilkudniowych komórkach kalusa. Fluorescencję białka reporterowego GFP (zielony kolor), a tym samym pośrednio podwyŝszony poziom aktywnej auksyny zaobserwowano tylko w młodych i intensywnie dzielących się komórkach kalusa DR5rev::GFP (A 1 ) na terenie cytoplazmy (B 1 ), a w niektórych przypadkach takŝe w jądrze komórkowym (C 1 ). Transgeniczne białka PIN1-GFP takŝe zidentyfikowano tylko w młodych, intensywnie dzielących się komórkach tkanki przyrannej (A 2 ) w plazmalemmie (B 2 ), a takŝe na terenie cytoplazmy (C 2 ). PIN7-GFP stwierdzono w plazmalemmie młodych, intensywnie dzielących się komórek tkanki przyrannej (A 3 ), a takŝe najprawdopodobniej w endosomach, na terenie cytoplazmy (B 3 i C 3 ). A 1, A 2, A 3 - powiększenie 40 ; B 1, B 2, B 3 - powiększenie 60 ; C 1, C 2, C 3 - powiększenie 120 Localization of auxin gradient and PIN-1, PIN7-GFP proteins in a few day old transgenic callus cells. Fluorescence of the GFP reporter protein (green color), and thus a higher level of active auxin, were observed only in young and intensively dividing callus of DR5rev::GFP (A 1 ), in the cytoplasm (B 1 ) and sometimes inside the nucleus (C 1 ). Transgenic PIN1-GFP proteins were also delected only in young and intensively dividing callus cells (A 2 ), in the plasmamembrane (B 2 ) and cytoplasm (C 2 ). PIN7-GFP proteins were localized in the plasmamembrane of young and intensively dividing callus cells (A 3 ) and also probably in endosomes and cytoplasm (B 3 i C 3 ). A 1, A 2, A 3 - magnification 40 ; B 1, B 2, B 3 - magnification 60 ; C 1, C 2, C 3 - magnification 120
LOKALIZACJA GRADIENTU AUKSYNY ORAZ ROZMIESZCZENIE BIAŁEK PIN... 301 Zaobserwowano, iŝ w pojedynczych komórkach PIN7-GFP występowały tylko na terenie cytoplazmy, najprawdopodobniej w endosomach (fot. 1B 3 i C 2 ), zaś białka PIN1-GFP w plazmalemmie i na terenie cytoplazmy obserwowanych komórek (fot. 1B 2 i C 3 ), co sugeruje, iŝ PIN1 odgrywa istotną rolę w utrzymywaniu odpowiedniego gradientu auksyny w komórkach kalusa. BOUTTE i in. [2006] stwierdzili, iŝ 10-30% zakumulowanych białek PIN w cytoplazmie jest zgromadzonych w aparatach Golgiego, natomiast większość, bo aŝ 70-90% akumulowana jest w endosomach. Białka PIN są syntetyzowane na retikulum szorstkim, a obróbka powstałych peptydów zachodzi w diktiosomach, z których są transportowane do błony komórkowej. Synteza, degradacja i transport tych białek są niezwykle waŝne w utrzymaniu ich stałej puli w plazmalemmie. Białka PIN są dynamicznie transportowane w obrębie komórki i istnieje stała pula krąŝących białek PIN, które pod wpływem róŝnych czynników mogą przemieszczać się do odpowiedniej strony plazmalemmy w komórce (apikalnej, bazalnej bądź lateralnej) i tym samym, jak wykazano, ukierunkować przepływ auksyny [FRIML i in. 2002b; BENKOVÁ i in. 2003; FRIML i in. 2003a; WIŚNIEWSKA i in. 2006; SAUER i in. 2006]. W obserwowanych szybko dzielących się komórkach kalusa nie zaobserwowano, aby białka PIN1-GFP czy PIN7-GFP wykazywały polarną lokalizację (fot. 1C 2 i C 3 ). Nie stwierdzono wśród komórek kilkudniowego kalusa obszarów zróŝnicowanych, do których lub z których auksyna byłaby transportowana. Najprawdopodobniej na tym etapie wzrostu i rozwoju kalusa białka PIN1 i PIN7 nie wykazują polarnej lokalizacji, determinującej kierunek przepływu auksyny. Wykazano, iŝ podczas reakcji grawitropicznej korzenia polarna lokalizacja białek PIN odgrywa istotną rolę w ukierunkowaniu transportu tego hormonu i prawidłowej odpowiedzi wzrostowej tego organu na bodziec siły ciąŝenia [WIŚNIEWSKA i in. 2006]. Fot. 2. Ekspresja DR5::GFP i PIN1:GFP w 2-tygodniowym kalusie podlegającym procesom róŝnicowania. PodwyŜszony poziom aktywnej auksyny (fluorescencję białka reporterowego GFP zielony kolor) zaobserwowano na terenie cytoplazmy komórek miękiszowych ksylemu DR5::GFP (A 1 ). Obecność białek PIN1-GFP stwierdzono w plazmalemmie, po bazalnej stronie komórek miękiszowych ksylemu (A 2 ). A 1, A 1 - powiększenie 120 Photo 2. Expression of DR5::GFP and PIN1:GFP in the 2-week old callus cell, where the cell differentiation was observed. The higher level of active auxin (fluorescence of GFP reporter protein - green color) was observed in the cytoplasm of the parenchyma xylem cells DR5::GFP (A 1 ). Localization of PIN1-GFP was detected in the plasmamembrane, at the basal side of parenchyma xylem cells (A 2 ). A 1, A 1 - magnification 120 W trakcie wzrostu i rozwoju tkanki przyrannej nie stwierdzono fluorescencji białka reporterowego GFP w starszych komórkach transgenicznego kalusa DR-
302 J. Wiśniewska i inni 5rev::GFP, PIN1:GFP A. thaliana (dane nieprzedstawiane). Zaobserwowano, iŝ część komórek kalusa uległa zróŝnicowaniu i wykształciły się wiązki przewodzące, w skład których m.in. wchodzą komórki naczyń o charakterystycznych pierścieniowatych lub spiralnych zgrubieniach wtórnych ścian komórkowych (fot. 2A 1 i A 2 ). Obok tych martwych komórek tkanki waskularnej stwierdzono występowanie Ŝywych komórek miękiszowych ksylemu, w których zaobserwowano podwyŝszony poziom fluorescencji GFP, a tym samym aktywnej auksyny w cytoplazmie tych komórek (fot. 2A 1 ). Tylko ekspresję białek PIN1-GFP obserwowano w plazmalemmie komórek miękiszowych ksylemu (fot. 2A 2 ). Nie stwierdzono ekspresji PIN4-GFP ani PIN7-GFP w tych komórkach (dane nieprzedstawiane). ZauwaŜono, iŝ PIN1-GFP wykazują polarną lokalizację, gdyŝ znajdują się głównie po jednej stronie plazmalemmy, najprawdopodobniej bazalnej stronie komórki, odzwierciedlającej przypuszczalny kierunek transportu auksyny (fot. 2A 2 ). Co ciekawe - specyficzna, polarna lokalizacja jest identyczna jak obserwowana przez GÄLWEILERA i in. [1998] w tkance przewodzącej łodygi A. thaliana. Fakt ten świadczy o tym, iŝ w kilkunastodniowym kalusie wykształcił się długodystansowy polarny transport auksyny, umoŝliwiający ustalenie gradientu tego fitohormonu. Auksyna jest najprawdopodobniej transportowana tym szlakiem przez białka PIN1 do komórek nieprzylegających bezpośrednio do poŝywki, a wykazujących zapotrzebowanie na ten hormon. Konsekwencją jest wyodrębnienie się grupy komórek w rozwijającej się tkance, która staje się organizatorem róŝnicowania tkanek i instruuje za pomocą sygnałów komórkowych sąsiednie komórki, jak mają dalej się zachować. Jak wiadomo w kulturach in vitro największe znaczenie w ukierunkowaniu procesu organogenezy odgrywa balans między dwoma hormonami: auksyną i cytokininą. Przewaga auksyny nad cytokininą w poŝywkach regeneracyjnych prowadzi do wytworzenia korzeni, natomiast cytokinin nad auksyną do powstawania pędów [SKOOG, MILLER 1957; KORACH i in. 2002]. Wnioski 1. PodwyŜszony poziom fluorescencji GFP, a tym samym podwyŝszony poziom aktywnej auksyny obserwowano w cytoplazmie i jądrach komórkowych tylko młodych, intensywnie dzielących się komórek kalusa DR5rev::GFP A. thaliana. 2. W tego samego typu komórkach tkanki przyrannej stwierdzono takŝe wysoki poziom ekspresji białek PIN1-GFP i PIN7-GFP, zaś brak PIN4-GFP. Chimeryczne białka PIN1-GFP i PIN7-GFP były równomiernie rozmieszczone w błonie komórkowej obserwowanych komórek co sugeruje, iŝ białka te są zaangaŝowane w krótkodystansowy transport polarny auksyny pomiędzy komórkami kalusa A. thaliana. 3. W 2-tygodniowym transgenicznym kalusie A. thaliana, w którym zaobserwowano proces róŝnicowania się komórek, zidentyfikowano podwyŝszony poziom ekspresji DR5::GFP w cytoplazmie, a obecność białek PIN1-GFP w plazmalemmie, po bazalnej stronie komórek miękiszowych ksylemu, co świadczy, iŝ białka PIN1 są zaangaŝowane w długodystansowy transport polarny auksyny w grudkach kalusa. Literatura BENKOVÁ E., MICHNIEWICZ M., SAUER M., TEICHMANN T., SEIFERTOVÁ D., JÜRGENS G., FRIML J. 2003. Local, efflux-dependent auxin gradients as a common module for plant organ formation. Cell115: 591-602.
LOKALIZACJA GRADIENTU AUKSYNY ORAZ ROZMIESZCZENIE BIAŁEK PIN... 303 BOLTENKOV E.V., ZAREMBO E.V. 2005. In vitro regeneration and callogenesis in tissue culture of floral organs of the Genus Iris (Iridaceae). Biology Bulletin 32: 138-142. BOUTTÉ Y., CROSNIER M.T., CARRARO N., TRAAS J., SATIAT-JEUNEMAITRE B. 2006. The plasma membrane recycling pathway and cell polarity in plants: studies on PIN proteins. J. Cell Sci. 119: 1255-1265. DAVIES P.J. 2004. Plant Hormones: biosynthesis, signal transduction, action! Kluwer Academic Publishers. Dordrecht, The Netherlands. DE REUILLE P.B., BOHN-COURSEAU I., LJUNG K., MORIN H., CARRARO N., GODIN C., TRAAS J. 2006. Computer simulations reveal properties of the cell-cell signaling network at the shoot apex in Arabidopsis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103: 1627-1632. DHONUKSHE P., ANIENTO F., HWANG I., ROBINSON D., MRAVEC J., STIERHOF Y-D., FRIML J. 2007. Clathrin-mediated constitutive endocytosis of PIN auxin efflux carriers in Arabidopsis, Curr. Biol. 17: 520-527. FELDMANN K.A., MARKS M.D. 1986. Rapid and efficient regeneration of plants of explants of Arabidopsis thaliana. Plant Sci. 47: 63-69. FRIML J., BENKOVÁ E., BLILOU I., WIŚNIEWSKA J., HAMANN T., LJUNG K., WOODY S., SANDBERG G., SCHERES B., JÜRGENS G., PALME K. 2002a. AtPIN4 mediates sink-driven auxin gradients and root patterning in Arabidopsis. Cell 108: 661-673. FRIML J., BENKOVÁ E., MAYER U., PALME K., MUSTER G. 2003a. Automated whole-mount localisation techniques for plants. Plant J. 34: 115-124. FRIML J., VIETEN A., SAUER M., WEIJERS D., SCHWARZ H., HAMANN T., OFFRINGA R., JURGENS G. 2003b. Efflux-dependent auxin gradients establish the apical-basal axis of Arabidopsis. Nature 426: 147 153. FRIML J., WIŚNIEWSKA J., BENKOVÁ E., MENDGEN K., PALME K. 2002b. Lateral relocation of auxin efflux regulator PIN3 mediates tropism in Arabidopsis. Nature 415: 806-809. GÄLWEILER L., GUAN C., MÜLLER A., WISMAN E., MENDGEN K., YEPHREMOV A., PALME K. 1998. Regulation of polar auxin transport by AtPIN1 in Arabidopsis vascular tissue. Science 282: 2226-2230. GELDNER N., ANDERS N., WOLTERS H., KEICHER J., KORNBERGER W., MULLER P., DELBARRE A., UEDA T., NAKANO A., JÜRGENS G. 2003. The Arabidopsis GNOM ARF-GEF mediates endosomal recycling, auxin transport, and auxin-dependent plant growth. Cell 112: 219-230. GELDNER N., FRIML J., STIERHOF Y.D., JÜRGENS G., PALME K. 2001. Auxin transport inhibitors block PIN1 cycling and vesicle trafficking. Nature 413: 425-428. HAGEN G., GUILFOYLE T. 2002. Auxin-responsive gene expression: genes promoters and regulatory factors. Plant Mol. Biol. 49: 373-385. KLEINE-VEHN J., DHONUKSHE P., SWARUP R., BENNETT M., FRIML J. 2006. Subcellular trafficking of the Arabidopsis auxin influx carrier AUX1 uses a novel pathway distinct from PIN1. Plant Cell 18: 3171-81. KORACH A., JULIANI H.R., KAPTEYN J., SIMON J.E. 2002. In vitro regeneration of Echinacea purpurea from leaf explants. Plant Cell, Tiss. Org. Cult. 69: 79-83. MANDAL A.K.A., DUTTA GUPTA S. 2001. Direct shoot organogenesis and plant regeneration in safflower. In Vitro Cell. Dev. Biol. 37: 50-54. MONNIER M. 1990. Induction of embryogenesis in callus. Pollard J.W., Walker J.M. (red.). Plant Cell and Tiss. Culture Meth. in Molec. Biol. 6: 141-148. MURASHIGE T., SKOOG F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15: 473 497. PACIOREK T., ZAŽÍMALOVÁ E., RUTHARDT N., PETRÁŠEK J., STIERHOF Y.D., KLEINE-VEHN J.,
304 J. Wiśniewska i inni MORRIS D.A., EMANS N., JÜRGENS G., GELDNER N., FRIML J. 2005. Auxin inhibits endocytosis and promotes its own efflux from cells. Nature 435: 1251-1256. SAUER M., BALLA J., LUSCHNIG C., WIŚNIEWSKA J., REINOHL V., FRIML J., BENKOVÁ E. 2006. Canalization of auxin flow by Aux/IAA-ARF-dependent feedback regulation of PIN polarity. Genes Dev. 20: 2902-2911. SKOOG F., MILLER C.O. 1957. Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissues culture in vitro. Symp. Soc. Exp. Biol. 11: 118-131. ŠUŠEK A., JAVORNIK B., BOHANEC B. 2002. Factors affecting direct organogenesis from flower explants of Allium giganteum. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 68: 27-33. TANAKA H., DHONUKSHE P., BREWER P.B., FRIML J. 2006. Spatiotemporal asymmetric auxin distribution: a means to coordinate plant development. Cell Mol. Life Sci. 63: 2738-54. TAS J., WESTERNENG G. 1981. Reagent for the fluorescent staining of nucleic acids. J. Histochem. Cytochem 29: 929. TILKAT E., ONAY A. 2009. Direct shoot organogenesis from in vitro-derived mature leaf explants of pistachio. In Vitro. Cell. Dev. Biol. Plant 45: 92-98. VIETEN A., VANNESTE S., WIŚNIEWSKA J., BENKOVÁ E., BENJAMINS R., BEECKMAN T., LUS- CHING C., FRIML J. 2005. Functional redundancy of PIN proteins is accompanied by auxine dependent cross-regulation of PIN expression. Development 132: 4521-4531. WIŚNIEWSKA J., XU J., SEIFERTOVÁ D., BREWER P.B., RŮŽIČKA K., BLILOU I., ROUQUIÉ D., BENKOVÁ E., SCHERES B., FRIML J. 2006. Polar PIN localization directs auxin flow in plants. Science 312: 883. Słowa kluczowe: auksyna, białka PIN, kalus Streszczenie Wizualizacja gradientu aktywnej auksyny i rozmieszczenia białek PIN, odpowiedzialnych za wypływ tego hormonu z komórki, jest moŝliwa dzięki stworzeniu i wykorzystaniu w badaniach roślin transgenicznych. UŜywając mikroskopu konfokalnego, pośrednio wykorzystując fluorescencję białka reporterowego GFP, lokalizowano gradient auksyny i rozmieszczenie białek chimerycznych PIN1-GFP, PIN4-GFP oraz PIN7-GFP w młodym i róŝnicującym się transgenicznym kalusie A. thaliana. Materiał wyjściowy stanowiły fragmenty hipokotyli 7-dniowych siewek roślin transgenicznych - DR5rev::GFP, PIN1:GFP, PIN4:GFP oraz PIN7:GFP A. thaliana. Obserwowano zarówno ekspresję DR5::GFP, jak i białek transgenicznych PIN1-GFP i PIN7-GFP tylko w młodych i intensywnie dzielących się komórkach kalusa. Nie stwierdzono zaś ekspresji PIN4-GFP. Stwierdzono apolarną lokalizację białek PIN1- GFP i PIN7-GFP w plazmalemmie komórek kalusa, związaną najprawdopodobniej z brakiem ukierunkowanego krótkodystansowego transportu tego hormonu pomiędzy komórkami kalusa. W 2-tygodniowym transgenicznym kalusie A. thaliana, w którym zaobserwowano proces róŝnicowania się komórek, zidentyfikowano podwyŝszony poziom ekspresji DR5::GFP w cytoplazmie, a obecność białek PIN1-GFP w plazmalemmie, po bazalnej stronie komórek miękiszowych ksylemu, co świadczy, iŝ białka PIN1 są zaangaŝowane w długodystansowy transport polarny auksyny w grudkach kalusa. LOCALIZATION OF AUXIN GRADIENT AND PIN PROTEINS
LOKALIZACJA GRADIENTU AUKSYNY ORAZ ROZMIESZCZENIE BIAŁEK PIN... 305 IN THE PROLIFERATING AND DIFFERENTIATING TRANSGENIC CALLUS OF Arabidopsis thaliana Justyna Wiśniewska, Małgorzata Pietrzykowska, Bogumiła Szyndel, Andrzej Tretyn Institute of General and Molecular Biology, Department of Biotechnology, Nicolaus Copernicus University, Toruń Key words: auxin, PIN protein, callus Summary The visualization of auxin gradient and localization of PIN proteins, responsible for the auxin efflux, is possible due to using transgenic plants in the research. The localization of auxin gradient and chimeric PIN1-GFP, PIN4-GFP and PIN7-GFP proteins was studied by monitoring the fluorescence of the reporter gene GFP in intensively dividing and differentiating callus cells obtained from hypocotyl of DR5::GFP and PIN1:GFP, PIN4:GFP, PIN7:GFP A. thaliana. Starting material comprised fragments of hypocotyls of 7-day-old transgenic seedlings DR5rev::GFP, PIN1:GFP, PIN4:GFP, PIN7:GFP of A. thaliana. The explants were grown on the sterile callus inducing medium. Expression of DR5::GFP and chimeric PIN1-GFP and PIN7-GFP proteins was observed only in intensively dividing callus. The expression of PIN4-GFP was not detected. An apolar localization of PIN1-GFP and PIN7-GFP proteins in membranes of callus cells was observed, which probably resulted from the nondirected short-distance transport of auxin between cells. It was shown that in 2- week-old transgenic A. thaliana callus, where the cell differentiation was observed, a high expression of DR5::GFP occurred in the cytoplasm and PIN1-GFP proteins were present in the plasmamembrane, at basal side of xylem parenchyma cells. Dr Justyna Wiśniewska Zakład Biotechnologii Uniwersytet Mikołaja Kopernika ul. Gagarina 9 87-100 TORUŃ e-mail: jwiśniew@biol.uni.torun.pl