Streszczenie: Celem pracy była ocena wpływu metioniny i selenometioniny na rozwój zmian patomorfologicznych w narządach wewnętrznych królika w doświadczalnej miażdżycy. Badania przeprowadzono na 24 królikach rasy nowozelandzkiej o masie ciała 3000± 50g. Zwierzęta podzielono na 4 grupy liczące po 6 zwierząt: grupę kontrolną i 3 grupy badane. Króliki z grupy kontrolnej karmiono standardową paszą GLK. Zwierzęta w grupach badanych karmiono dietą zawierającą 2g /królika /24h. Dodatkowo zwierzętom w grupie badanej II podawano 70mg metioniny/ kg m.c./ 24h. Zwierzęta w grupie III otrzymywały taką samą ilość cholesterolu i 12,5μg selenometioniny /kg m. c./24h. Eksperyment trwał trzy miesiące. Co miesiąc pobierana była krew do badań biochemicznych. Podczas sekcji pobierano narządy: aortę, wątrobę, nerki i serca do oceny histopatologiczej. Oceny dokonano na podstawie preparatów wykonanych rutynową metodą parafinową i barwionych hematoksyliną i eozyną oraz uzyskanych na mikrotomie mrożeniowym, barwionych Sudanem III na tłuszcze obojętne. W surowicy oznaczono poziom frakcji LDL, HDL oraz triglicerydów. Wykazano, że metionina i selenometionina hamują rozwój procesów miażdżycowych w aorcie i tętnicach sercowych oraz stłuszczenie w wątrobie i w nerce. Słowa kluczowe: aorta, cholesterol, miażdżyca, metionina, selenometionia, histopatologia, Summary: The aim of the study was the influence of methionine and selenomethionine on the development of pathomorphological changes in the inner organs of rabbits in experimental atherosclerosis. The study was performed on 24 male New Zeland rabbits with an intial body weight of 3000 g±50g. The animals were divided into 4 groups of six as follows: a control group and 3 study groups. Animals in the control group were fed on standard diet GSL. Animals from the experimental groups were fed a cholesterol diet consisting of 2.0 g of cholesterol//rabbit/24h. Additionally, animals from the experimental group II were supplemented with methionine in the amount 70 mg/kg b.m./24hr. Animals in study the group III were fed on the same cholesterol diet and also received 12.5 μg of selenomethionine /kg b.m./24h. After three months the experiment the was terminated. Once a month, blood was collected for biochemical analyses. At autopsy, the heart, kidney, liver and aorta were collected for histopathological examination.the pathomorphological changes in the organs were assessed with preparations obtained with the normal paraffin method, stained with hematoxilin and eosin (H-E), as well as with the freezing microtome, stained with Sudan III for neutral fats. The concentration of LDL cholesterol, HDL cholesterol and triglycerides (TG) in plasma was determined. 5Selenomethionina and methionina reduced the development of atheromatosis changes in aorta walls and in the heart arteries as well as the fatty degeneration in the liver and kidneys. Key words: aorta, cholesterol, atherosclerosis, methionine, selenomethionine, histopathology.
Miażdżyca jest chorobą układu sercowo-naczyniowego, występującą najczęściej w krajach wysoko rozwiniętych. Charakteryzuje ją zmiany wsteczne i postępowe w błonie wewnętrznej i środkowej naczyń tętniczych, prowadzące do zwężenia ich światła. Dobrze poznanym czynnikiem patogennym miażdżycy jest cholesterol. Zmiany powstają najczęściej w aorcie i w tętnicach wieńcowych, w późniejszym etapie pojawiają się zmiany w tętnicach mózgowych i nerkowych [1,2,3,4]. Istotną rolę w patogenezie miażdżycy odgrywa wysoki poziom lipidów w surowicy, zwłaszcza frakcji lipoprotein o niskiej gęstości LDL, niski zaś frakcji lipoprotein HDL. W początkowym okresie dochodzi do kumulacji lipidów w błonie wewnętrznej ściany tętnic. W kolejnych etapach jej rozwoju dochodzi do dysfunkcji komórek śródbłonka naczyń krwionośnych oraz zwiększonego dopływu do błony wewnętrznej monocytów, limfocytów i makrofagów ulegających przekształceniu w komórki piankowate[5,6,7 ]. Badania prowadzone w ostatnich latach dowiodły, że istotną rolę w jej patogenezie odgrywają także procesy oksydoredukcyjne. Wykazano, że wolne rodniki tlenowe (WRT) utleniają lipoproteiny LDL, a te uszkadzają śródbłonek naczyń. WRT wpływają także na procesy adhezji płytek, procesy proliferacji komórek mięśni gładkich, stymulują odpowiedź immunologiczną, napływ makrofagów do błony wewnętrznej. Powstają w ten sposób warunki sprzyjające aterogenezie [8,9,10,11]. Stężenie wolnych rodników jest kontrolowane przez systemy antyoksydacyjne na drodze enzymatycznej (dysmutaza ponadtlenkowa (SOD), peroksydazy glutationowe: selenoniezależna i selenozależna (Se-GPx), reduktaza glutationową, katalaza) [12]. W zabezpieczeniu przed skutkami działania szkodliwego wolnych rodników tlenowych istotną rolę odgrywa także antyoksydacyjny system nieenzymatyczny. W tej grupie antyoksydantów znajdują się witaminy: A, E, C, ß-karoten, metionina, cysteina [9,10,13,14,15,16]. W ostatnim czasie dużym zainteresowaniem cieszą się metionina i selen [17,18]. Selen występuje w przyrodzie w postaci związków nieorganicznych (selenianów i selenininów) oraz związków organicznych (selenometioniny i selenocysteiny). W przemianach metabolicznych bierze udział poprzez selenocysteinę Selenocysteina wchodzi w skład selenoprotein. Poprzez te białkowe związki przejawia się aktywność biologiczna selenu. Selen wpływa na wychwytywanie, degradację oraz hamowanie powstawania wolnych rodników tlenowych [19]. Natomiast metionina jest niezbędnym aminokwasem egzogennym, który w organizmie funkcjonuje w postaci S-adenozyometioniny. Z tej postaci powstaje cysteina stanowiąca element struktury jednego z ważniejszych antyoksydantów komórkowych- glutationu. Jej właściwości antyoksydacyjne wynikają z obniżenia utleniania lipidów, działania ochronnego przed uszkodzeniem błony komórkowej i przywracania równowagi w układzie glutationu [20,21] W badaniach wykazano, że nawet minimalne ilości metioniny w białkach mogą wykazywać znaczne działanie antyoksydacyjne [22]. W badaniach eksperymentalnych Patra i wsp.[23] wykazali wpływ antyoksydacyjny wywierany przez L- metioninę wyrażony zmniejszeniem uszkodzeń w wątrobie i nerkach, aktywacją enzymów antyoksydacyjnych oraz obniżeniem utlenionych lipidów. Celem pracy była ocena wpływu metioniny i selenometioniny na rozwój zmian patomorfologicznych w narządach wewnętrznych królika w doświadczalnej miażdżycy oraz ocena parametrów lipidowych w osoczu krwi. Badania przeprowadzono na 16-tygodniowych królikach - samcach rasy o początkowej masie ciała około 3000g±50. Zwierzęta pochodziły z Centralnej Zwierzętarni Doświadczalnej ŚUM w Katowicach. Króliki podzielono na 4 grupy liczące po 6 zwierząt: Zwierzętom grupy kontrolnej podawano standardową paszę GLK. Króliki z wszystkich pozostałych grup otrzymywały z dietę 2g cholesterolu/ na królika /24h. Ponadto zwierzętom w grupie badanej II (CH+M.) podawano metioninę w ilości 70mg/kg masy ciała/24h, a w grupie badanej III(CH+M+ SM) - 12, 5μg selenometioniny/kg masy ciała/24h. Eksperyment trwał trzy miesiące. Przez cały okres eksperymentu zwierzęta trzymane były w osobnych drewnianych klatkach. Zwierzęta żywione były standardową paszą GLD i pojone wodą ad libitum. Króliki znieczulano ogólnie za pomocą 20 % uretanu etylowego, stosując dawkę 2,5 g/kg masy ciała. Co miesiąc pobierano krew do badań biochemicznych. Podczas sekcji pobierano: aortę, wątrobę, nerki i serce do oceny histopatologiczej. Oceny patomorfologicznej dokonano na podstawie preparatów wykonanych rutynową metodą parafinową, barwionych hematoksyliną i eozyną. Obecność tłuszczów w blaszkach miążdżycowych w aorcie i w komórkach pozostałych narządów wykazano w preparatach uzykanych na mikrotomie mrożeniowym, barwionych Sudanem III na tłuszcze obojętne[24]. Preparaty oglądano w mikroskopie Olympus. Mikrofotografie kolorowe wykonano w mikroskopie Docuwal firmy Carl Zeiss Jena. W surowicy oznaczono stężenie frakcji LDL metodą enzymatyczną za pomocą kitu Bio Merieux (Francja), stężenie HDL oraz triglicerydów za pomocą testów Alpha Diagnostics (Niemcy). Otrzymane wyniki poddano analizie statystycznej za pomocą programu STATISTICA PL. Do porównania zmian między poszczególnymi grupami użyto testu U Manna Whitneya. Za znamienne statystyczne przyjęto zmiany przy poziomie istotności p 0.05. Na prowadzenie badań na zwierzętach uzyskano zgodę Komisji Bioetycznej do Badań ŚUM. WYNIKI I ICH OMÓWIENIE Uzyskane w toku przeprowadzonego eksperymentu wyniki oceny mikroskopowej wykazały obecność zmian histopatologicznych we wszystkich badanych narządach u królików obciążonych dietą cholesterolową. W aortach (Ryc. 1-3) oraz w naczyniach wieńcowych serca (Ryc. 4-6) zaobserwowano rozrost błony wewnętrznej pod postacią blaszek miażdżycowych. W blaszkach obecne były liczne komórki
- - - - - - - - - - - - - - - - piankowate. Lipidy obecne były również w przestrzeniach międzykomórkowych. Uzyskane wyniki dowodzą, że cholesterol w zastosowanej dawce działa miażdżycorodne i korelują z wynikami dotychczasowych badań [25]. Wyraźne zmniejszenie grubości blaszek miażdżycowych zaobserwowano w grupie badanej III (CH+SM). Obciążenie królików cholesterolem wyzwoliło oprócz zmian miażdżycowych w naczyniach, zmiany wsteczne w wątrobie (Ryc. 7-9) pod postacią stłuszczenia hepatocytów oraz w nerkach (Ryc. 10- -12) w postaci ogniskowego stłuszczenia komórek nabłonka kanalików nerkowych. W wątrobach stłuszczenie lokalizowało się wokół żył środkowych. Stłuszczenie wątroby świadczy o zaburzeniach przemiany lipidów i lipoprotein, prowadzących do nadmiernej ich kumulacji. Stłuszczenie komórek nabłonka cewek zbiorczych obserwowane w grupie badanej I, obciążonej cholesterolem zwykle towarzyszy zaburzeniom przemiany tłuszczowej w wątrobie. Jak wykazano zmianę tą obserwuje się zwykle w stłuszczeniu wątroby [26,27]. U królików grup badanych: II(CH+M) oraz w III (CH+M+SM) otrzymujących z cholesterolem metioninę lub selenometioninę wykazano podobne zmiany patomorfologiczne, jednak stopień ich nasilenia był nieco mniejszy. W grupie II u 2 szczurów widoczny był naciek ropny w nerkach. Również w grupie otrzymującej dodatkowo selenometioninę obserwowano słabiej wyrażone zmiany stłuszczeniowe w hepatocytach, natomiast nie wykazano stłuszczenia komórek nabłonka kanalików. Uzyskane wynki oceny patomorfologicznej w grupach (Ch), (Ch+M), (Ch+SM) wykazują korelację z wynikami badań biochemicznych (tabela 1). We wszystkich grupach badanych wykazano istotny statystycznie wzrost TG w stosunku do stężenia zaobserwowanego w grupie kontrolnej po 3 miesiącach trwania doświadczenia. Po każdym miesiącu trwania badań stwierdzono także statystyczny wzrost stężenia cholesterolu LDL w grupach badanych w stosunku do kontroli. W grupach badanych II i III odnotowano także istotny statystycznie wzrost HDL w stosunku do kontroli po pierwszym miesiącu trwania eksperymentu. Ponadto w grupie III (CH+SM) wzrost ten obserwowano także po trzecim miesiącu. Natomiast w grupie II (CH+M) obserwowano istotny statystycznie spadek triglicerydów i cholesterolu (LDL) w osoczu w stosunku do grupy karmionej dietą cholesterolową. 1. Selenometionina hamuje rozwój zmian miażdżycowych w aorcie i naczyniach tętniczych serca oraz zmiany wsteczne w wątrobie i nerkach u zwierząt będących na diecie cholesterolowej silniej niż metionina. 2. Stosowanie antyoksydantów może odegrać ważną rolę w prewencji pierwotnej miażdżycy i w ochronie narządów wewnętrznych przed stłuszczeniem wynikającym z nieprawidłowej diety. 1. Kruś S., Skrzypek- Fakhoury E.: Patomorfologia kliniczna. PZWL, Warszawa 1996; 62-68. 2. Tatoń J.: Miażdżyca. Zapobieganie w praktyce lekarskiej, PZWL, Warszawa 1996. 3. Tkaczewski K.: Infekcyjna teoria miażdżycy Złudzenie czy rzeczywistość?. Lekarz wojskowy, 1998: 1-2; 60-69. 4. Tomaszewski J.: Patogeneza miażdżycy. Diagn. Lab., 1999, 35, 199-210. 5. Libby P., Pidker P. M., Maseri A.: Inflammatory and Atherosclerosis. Circulation. 2002: 105; 1135-1145. 6. Ross R..: Atherosclerosis is an inflammatory disease. Am Heart J.1999: 138; S419-S420.
7. Schneider Z.: Molecular aspects of atherosclerosis. Post Biol Kom., Sup.10, 1998: 25, supl.10; 157-194. 8. Harrison D. i wsp.: Role of oxidative stress in atherosclerosis. Am. J. Cardiol., 2003: 91; 7A-11. 9. Jialal I., Devaraj S.: Antioxidants and Atherosclerosis: Don t Throw Out the Baby With the Bath Water. Circulation, 2003: 107; 926-928. 10. Diaz M., Frei B., Vita J.: Antioxidants and atherosclerotic heart disease. Natl English J Med., 1997: 337; 408-416. 11. Mahfouz M.M., Kawano H., Kummerow F. A.: Effect of cholesterol diets with and without vitamin E and C on the severity of atherosclerosis in rabbits. Am. J. Clin. Nutr., 1997: 66; 1240-1249. 12. Strzałkowski A. i wsp.: Układy chroniące przed działaniem aktywnych form tlenu w organizmie żywym. Lek. Wojsk., 2004; 80: 196-205. 13. Stawiarska-Pięta B. i wsp.: Influence of selenomethionine on the morphology of rabbits organs in experimental atherosclerosis. Bull Vet Inst Pulawy: 2006: 50; 113-119. 14. Luoma P.V., Nayha S., Sikkilo K.: High serum α-tokopherol, albumin, selenium and cholesterol and low mortality from disease in Northern Finland. J. Inter. Med., 1995: 237; 49-54. 15. Stawiarska-Pięta B. i wsp.: Influence of vitamin E on the development of morphological changes in rabbits organs in experimental hypercholesterolaemia. Bull. Vet. Inst. Pulawy, 2004 48; 69-74. 16. Mahfouz M.M., Kawano H., Kummerow F. A.: Effect of cholesterol diets with and without vitamin E and C on the severity of atherosclerosis in rabbits. Am. J. Clin. Nutr., 1997: 66; 1240-1249. 17. Wożniak J.: Selen- pierwiastek życia. Farm. Pol. 1997: 53; 546-548. 18. Selvam R., Ravichondran V.: Effect of oral methionine and witamin E on blond lipid peroxidation in witamin B6 deficient rats. Biochem. Int., 1991; 23: 1007-1017. 19. R. K. Murray, D.K. Granner, P.A. Mayes, and V. W.: Rodwell, Biochemia Harpera, PZWL Warszawa, 1998. 20. Slyshenkov V.S. i wsp.: Protective role of L-methionine against free radical damage of rat brain synaptosomes. Acta. Biochem. Pol., 2002; 49: 907-916. 21. Selvam R., Ravichondran V.: Effect of oral methionine and witamin E on blond lipid peroxidation in witamin B6 deficient rats. Biochem. Int., 1991: 23; 1007-1017. 22. Levine R.L., Moskovitz J., Stadtman E.R.: Oxidation of methionine in proteins: roles in antioxidant defense and cellular regulation. IUBMB Life., 2000; 50: 301-307. 23. Patra R.C., Swarup D., Dwivedi S.K.: Antioxidant effects of α-tocotherol, acrobic acid and L-methionine on lead induced oxidative stess to the liver, kidney and brain in rats. Toxicology, 2001: 162; 81-88. 24. Zawistowski S.: Technika histologiczna, histologia oraz podstawy histopatologii. PZWL Warszawa, 1996. 25. Bacan T.M. i wsp..: The relantionship between the degree of dietary- induced hypercholesterolemia in rabbit and atherosclerotic lesion formation. Atherosclerosis 1993: 102; 9-22. 26. Brzozowski R.: Choroby wątroby i dróg żółciowych. PZWL, Warszawa, 1998. 27. Kruś S.: Patomorfologia nerek. PZWL, Warszawa, 1986